Побуждаемая строгими законами об охране окружающей сре­ды, необходимостью извлечения ценных металлов и очистки промышленных вод для их повторного использования, горно­рудная промышленность все шире применяет новые физико-хи­мические технологии для очистки сточных вод. Слишком часто эти технологии оказываются крайне дорогостоящими и неэф­фективными. Все больше фирм приходят к убеждению, что для очистки сточных вод можно использовать биологические про­цессы, причем эти процессы могут быть более экономичными и эффективными, чем обычно применяемые методы. Некоторые промышленные предприятия широко используют эти процессы для удаления из рудничных сточных вод примесей неорганиче­ских ионов. Применяемые системы обычно представляют собой большие отстойники или проточные пруды с медленным тече­нием, в которых растут водоросли и микроорганизмы. Эти ор­ганизмы накапливают растворенные металлы и их частицы или образуют продукты, переводящие примеси в нерастворимую форму. Обычно используемые процессы биологической очистки сточных вод мало подвержены прогрессу, эту технологию мож­но рассматривать как несложную. Исследования последних лет показывают, что многие микроорганизмы способны накапливать металлы в больших концентрациях и содержат структурные компоненты, которые могут избирательно связывать специфи­ческие ионы. Селекция микроорганизмов, способных накапли­вать металлы, и создание технически более совершенных систем в целях использования этих организмов для удаления всех или  отдельных загрязняющих ионов, присутствующих в малых ко­личествах в больших объемах сточных вод, могли бы получить широкое применение в горнодобывающей промышленности и в других отраслях индустрии, где образуются сточные воды.

Извлекать металлы из окружающей среды способны все микроорганизмы, поскольку такие металлы, как железо, маг­ний, цинк, медь, молибден и многие другие входят в состав ферментов или пигментов, подобных цитохромам или хлоро­филлам. В ряде случаев металлы накапливаются микроорга­низмами в значительных количествах; в бактериальной клетке могут содержаться ионы калия в концентрации 0,2 М, даже если в среде калий присутствует в концентрациях 0,0001 M и ниже. В ходе эволюции у микроорганизмов сформировались системы поглощения, специфичные к определенным металлам и способные к значительному их концентрированию. В резуль­тате метаболических реакций, протекающих у микроорганизмов, могут происходит различные превращения металлов: выделяе­мые в окружающую среду продукты метаболизма способны образовывать комплексы с металлами или осаждать их из рас­творов; некоторые металлы могут переводиться с их помощью в летучие формы и удаляться из раствора; металлы могут окис­ляться или восстанавливаться. Так, в разделе, посвященном выщелачиванию металлов, мы уже рассматривали окисление железа [Fe(II)—HFe(III)+e^-]. Fe(III) может также восста­навливаться до Fe(II) при дыхании ряда бактерий. За счет использования восстановительных эквивалентов дыхания может происходить восстановление селената, селенита, теллурата и теллурита до свободных металлоидов; таким путем осуществля­ется иммобилизация этих металлоидов.

Рис. 5.3. Возможные взаимодействия между металлами и микробной клеткой; поверхностная адсорбция, внутриклеточное накопление, перевод в летучую форму, комплексообразование с выделяемыми органическими соединениями и внеклеточное осаждение.

Ниже перечислены основные механизмы иммобилизации, комплексообразования или других способов удаления метал­лов из растворов микроорганизмами: 1) перевод в летучую форму; 2) внеклеточное осаждение; 3) внеклеточное комплексо­образование и последующее накопление; 4) связывание клеточ­ной поверхностью; 5) внутриклеточное накопление.

Все эти реакции изображены на рис. 5.3. Понятно, что ука­занные процессы могут перекрываться, поскольку один из них способен давать начало другому или быть его составной частью.

• 5.3.1. Перевод в летучую форму

В настоящее время твердо установлено, что многие микроорга­низмы способны метилировать ртуть. Это приводит к превра­щению ионов Hg(II) из осадка или раствора в метилртутные соединения (например, диметилртуть), которые уходят в атмо­сферу. Такое превращение может быть важным этапом в при­родном круговороте ртути. Возможно также микробиологиче­ское метилирование других металлов, например мышьяка, тел­лура и селена, которые таким способом удаляются из почвы и воды. Подобные процессы могут играть важную роль в при­родных циклах этих металлов и иметь значение, например, при -образовании обедненных селеном почв или при удалении ток­сичных металлов при обработке сточных вод. Как бы то ни  было биотехнологические исследования, направленные на умень­шение или увеличение подобной микробной активности, пред­ставляются весьма перспективными.

• 5.3.2. Внеклеточное осаждение

Металлы могут иммобилизовываться и накапливаться в почвах и в осадочных породах за счет связывания с продуктами мета­болизма микробов или с накапливающимися органическими •остатками. Эти процессы издавна использовались человеком при очистке сточных и промышленных вод. При обычной очист­ке сточных вод образующийся ил содержит целый набор ме­таллов, перешедших из воды. Живые клетки и органические «остатки, присутствующие в отстойниках или проточных прудах, будут накапливать эти металлы, которые впоследствии оказы­ваются з осадках. Для удаления металлов из промышленных стоков или из рудничных вод в горнорудной промышленности используют пруды, в которых «цветут» водоросли (их усилен­ный рост стимулируется органическими или минеральными пи­тательными веществами, которые содержатся в воде).

Один из наиболее удачных примеров внеклеточного осажде­ния — перевод металлов в осадок путем осаждения сероводо­родом, образуемым сульфатредуцирующими бактериями. Эти бактерии обитают в анаэробных средах во всех частях земного шара (в озерных, океанических и некоторых речных осадках, бескислородных почвах, болотах и т. п.), и с их помощью про­исходит сопряжение окисления органических веществ с восста­новлением сульфатов до сульфидов:

H₂ SO₄+ 8H = H₂S-MH₂O.                                            (10)

Эта реакция может приводить к осаждению металлов в почвах и осадках, например в виде пирита (FeS₂). В масштабе геоло­гического времени таким способом могут накапливаться боль­шие массы сульфидов металлов, например CuS. К образованию сульфидов ведет разложение биомассы водорослей в осадочных породах. Схематически такой процесс представлен на рис. 5.4. Оба этих процесса осуществляются в природе и используются человеком в относительно небольших масштабах, если говорить об общем количестве загрязненной металлами воды, которая нуждается в очистке. Потенциальные возможности применения биотехнологии для бактериального восстановления сульфатов вцелях очистки вод от металлов, а также для извлечения метал­лов из разбавленных растворов совершенно очевидны. На рис. 5.5 показаны две высокотехнологичные системы такого ро­да. В одноступенчатой системе в хемостат с культурой сульфат-редуцирующих бактерий непрерывно поступает раствор, загряз­ненный каким-либо металлом и содержащий сульфат и пита­тельные вещества типа лактата или в зависимости от природы используемой бактерии углеводород либо органическую кисло­ту. Для одновременного разложения сложных органических остатков можно применять смешанные культуры бактерий,. функционирующих в анаэробных условиях. При более строго- контролируемом процессе для получения сероводорода следует использовать раздельные культуры сульфатредуцирующих бак­терий; при этом сероводород необходимо прокачивать сквозь загрязненную металлом воду, протекающую через осадочный чан. Сульфид металла будет осаждаться, а поток свободной от ме­талла (или по крайней мере сильно очищенной) воды —выте­кать из резервуара. Потери избыточного сульфида можно конт­ролировать, меняя соотношение между поступающими сульфа­том и металлом. Однако некоторое количество избыточного- растворимого сульфида все-таки неизбежно образуется. Его- можно удалять путем спонтанного химического окисления, если поддерживать на соответствующем уровне количество раство­ренного сульфата. 

Рис. 5.4. Существующая в природе система осаждения металлов. Отмершие водоросли оседают на дно водоема (стадия 1) и при их последующем разло­жении под действием микроорганизмов образуется сероводород, осаждающий металлы (стадия 2).

Альтернативным решением является окисле­ние сульфида серуобразующими фотосинтезирующими бактерия­ми в трехступенчатом процессе. Далее возможно экономически выгодное получение элементарной серы. Излишки газообразного, сероводорода легко вновь использовать в цикле.

Рис. 5.5. Две высокотехнологичные системы извлечения металлов из раствороа в виде сульфидов. В одностадийной системе применяют сульфатредуцирующие- бактерии; в двустадийной системе образуется сероводород, который в дальней­шем используется для осаждения металлов в отдельном резервуаре.

• 5.3.3.  Внеклеточное комплексообразование

Некоторые микроорганизмы синтезируют специфические хими­ческие соединения, обладающие высоким сродством к опреде­ленным металлам. Наиболее известны соединения, образующие  комплексы с железом. Молибден, ванадий и другие микроэле­менты, участвующие в метаболизме бактерий, также способны поступать в клетку в форме внеклеточных комплексов. Хотя  эти комплексообразующие соединения не осаждают металлы, на их основе может быть создана новая технология извлечения отдельных металлов из растворов. Для иммобилизации раство­ренных металлов пригодны комплексообразующие агенты, вы­деленные из культур микроорганизмов, а также химически син­тезированные соединения, имитирующие эти агенты. Эффектив­ность связывания металлов с подобными соединениями можно увеличить путем повышения их емкости по отношению к данным металлам, увеличения скорости соответствующих реакций и спе­цифичности комплексообразующих агентов. Для этого можно попытаться синтезировать химическим путем такие агенты, для которых в качестве моделей служили бы природные продукты. Перспективным представляется и создание методами генетиче­ской инженерии микроорганизмов, синтезирующих нужные ве­щества в большом количестве.

• 5.3.4. Внутри- и внеклеточное накопление металлов микроорганизмами

О прямом накоплении металлов микроорганизмами уже шла речь в предыдущих разделах. Теперь мы рассмотрим лежащие в основе этого явления биохимические процессы и возможности их использования в прикладной микробиологии. Идея примене­ния микроорганизмов для извлечения металлов из растворов издавна представлялась привлекательной не только для очистки воды, но и для получения ценных или экономически важных металлов. Возможность эксплуатации такого процесса концент­рирования несомненна, поскольку хорошо известна способность живых организмов извлекать металлы из разбавленных раство­ров и накапливать их. Многие растения и животные концентри­руют элементы из окружающей их среды в миллионы раз.

Возможные пути биотехнологического использования накоп­ления металлов микробами иллюстрирует рис. 5.6. Существуют два альтернативных механизма: накопление металлов организ­мами в растущей культуре и суспензиями нерастущих организ­мов. Конечно, можно использовать и проточные колонки с им­мобилизованными микроорганизмами или другие биофильтрую­щие устройства. Если предполагается применение растущих культур, то потребуется довольно сложная технология. Необхо­димо учесть и привести в соответствие друг с другом следую­щие факторы: 1) скорость роста организма (проточная культу­ра); 2) способность к накоплению металла и, следовательно, скорость его включения; 3) возможная токсичность металла для данных организмов; 4) конкуренция за извлекаемый ме­талл между данным организмом и возможными комплексооб­разующими агентами среды (органическими и неорганическими); 5) конкуренция между данным металлом и другими не­обходимыми металлами за включение в организм. Будучи высокотехнологичным, процесс извлечения металлов с по­мощью растущих культур требует учета слишком многих пара­метров и создает много проблем. Более привлекательным пред­ставляется накопление металлов нерастущими или иммобили­зованными микроорганизмами. При этом легче определять и контролировать физико-химические условия среды, в которой находятся клетки, и их способность к накоплению металла. Кроме того, металл может быть переведен в раствор, относительно свободный от комплексообразующих агентов, в кон­центрациях, нелетальных для живых клеток.

Рис. 5.6. Возможные способы извлечения металлов из раствора с помощью  микроорганизмов в качестве биосорбентов.

После концентрирования металла в микроорганизме возникает проблема извлечения из него металла. Для этого можно использовать либо недеструктивный способ высвобождения ме­талла из микроорганизма, либо экстракцию путем разрушения. В последнем случае микроорганизмы подвергают пирометал­лургической обработке либо разрушают их концентрированной щелочью или кислотой. Выбор метода определяется тем, на­сколько легко высвобождается металл из микроорганизма и насколько ценен сам микроорганизм для того, чтобы имело смысл повторно его использовать. Ясно, что, если стоимость получения микроорганизма высока, его повторное использова­ние весьма желательно. C другой стороны, если данный организм представляет собой дешевый побочный продукт иных производств (например, дрожжи) и/или извлекаемые металлы являются крайне ценными (например, металлы платиновой группы), то экономически предпочтителен деструктивный про­цесс. В любом варианте выбор организма и процесса экстрак­ции должен определяться основными свойствами аккумулирую­щих металл микробных систем; самое главное — четкое пони­мание биохимических процессов, характерных для данного ми­кроорганизма.

Микроорганизмы способны концентрировать металлы одним из следующих способов: 1) внеклеточное накопление участву­ющих или не участвующих в метаболизме металлов путем свя­зывания или осаждения их на клеточной стенке или мембранах; 2) внутриклеточное накопление нужных для метаболизма ме­таллов (например, К, Fe, Mg, Mo, следы Cu, Ni); 3) внутри­клеточное накопление относительно больших количеств несу­щественных для метаболизма металлов (например, Со, Ni, Си, Cd, Ag) в основном с помощью механизмов, служащих для накопления существенных для метаболизма металлов.

Поглощение некоторых металлов дрожжами и бактериями осуществляется почти исключительно за счет поверхностного связывания; примером служит накопление урана дрожжами или свинца у Micrococcus. Внутриклеточное накопление может сопровождаться незначительным поверхностным связыванием; пример тому — накопление калия. Процесс накопления метал­лов нередко характеризуется двухфазной кинетикой (рис. 5.7).

Рис. 5.7. Обычно наблюдаемая кинетика накопления металлов бактериями: стадия 1 — энергонезависимая, стадия 2 — энергозависимая.

Сразу после введения металла в среду последний быстро свя­зывается с клеточной поверхностью за счет независимого от энергии процесса, а затем происходит медленный перенос ме­талла в цитоплазму клетки. Последний процесс часто является энергозависимым и протекает лишь при активном дыхании. Он может блокироваться дыхательными ядами и анаэробиозом, ингибирующими аэробное дыхание или запасание энергии. У бактерий связывание металлов с клеточной поверхностью происходит интенсивнее, чем у большинства дрожжей; так, скорость связывания металлов у Saccharomyces cereυisiae на­много ниже, чем у Escherichia coli или Bacillus (рис. 5.8). Свя­занные с клеточной поверхностью металлы легко отделяются от нее хелатирующими агентами или разбавленными кислота­ми; например, кобальт, связанный с поверхностью Bacillus, легко удаляется при помощи ЭДТА (рис. 5.8). На внутрикле­точное накопление металла ЭДТА не влияет. Бактериальные системы представляются предпочтительными для удаления ме­таллов с последующим быстрым связыванием; однако энерго­зависимое поглощение металлов в случае дрожжей часто ока­зывается более эффективным, чем для бактерий. У различных штаммов родственных бактерий уровень поверхностного связы­вания существенно различается. Например, Bacillus megate- rium KAl (при концентрации 1 г сухой массы на литр) при 20 ⁰C связывает 43 мг кадмия на 1 г сухой массы из раствора, со­держащего Cd в концентрации 112 мг/л (в то время, как В. polymyxa — всего 10 мг Cd на 1 г сухой массы). Сильно свя­зывающий штамм В. megaterium (при концентрации 1 г сухой массы клеток на литр) извлекает 38 и 68% кадмия из раство­ров, содержащих соответственно 112 и 11 мг Cd в 1л.

Последующее накопление металлов внутри клетки, как пра­вило, требует специфических транспортных систем. Четко уста­новлено, что поглощение никеля или кобальта происходит при участии системы транспорта магния, а поглощение рубидия, вероятно, при участии системы транспорта калия. Различные металлы могут конкурировать за карбоксилы, гидроксилы и другие участки связывания на поверхности клетки или за транспортные системы. При поступлении в клетку иона какого- либо металла из цитоплазмы выходят одноименно заряженные ионы. В зависимости от организма это могут быть протоны, ионы магния или калия (рис. 5.9).

Над применением микроорганизмов в биотехнологии в ка­честве биосорбентов металлов еще предстоит поработать. Не­давно было показано, что уран может сорбироваться из мор­ской воды или из растворов водорослями, дрожжами или Pseudomonas. Pseudomonas накапливает уран в цитоплазме (рис. 5.10), а для Saccharomyces характерно поверхностное связывание (рис. 5.11).

Рис. 5.8. Поглощение кобальта дрожжами и бациллами из 0,002 M PIPES. (Norris, Kelly, 1977; Norris, Kelly, 1979.) 1 —Saccharomyces cerevisiae, 2 — Bacillus megaterium, 3 — кобальт, удерживаемый B. megaterium после промыв­ки 1 мМ ЭДТА.

Этот связанный уран легко удаляется, и дрожжи можно использовать повторно. Потенциальные воз­можности развития технологии экстракции определяются мно­гими факторами. 1. Специфичность связывания должна быть достаточной для удаления определенного металла или смеси металлов из разбавленного раствора. 2. Специфичность био­аккумулятора по отношению к металлу должна быть эквива­лентной таковой для физико-химических методов (ионный об­мен, экстракция растворителями и т. п.). 3. Биоаккумулятор должен обладать способностью к извлечению из среды боль­ших количеств металла. 4. Чтобы процесс был экономически выгоден, стоимость извлекаемых металлов должна быть экви­валентна затратам на получение и, возможно, повторное ис­пользование микроорганизмов (или превышать их). 5. Другие вещества окружающей среды не должны оказывать вредного воздействия на биоаккумуляторы.

Рис. 5.9. Схематическое изображение ионного равновесия, поддерживаемого микроорганизмами, которые накапливают металлы внутри клетки.

Широкое разнообразие микробных систем и возможность существенного изменения микроорганизмов генетическими ме­тодами позволяют надеяться на создание биотехнологии, отве­чающей всем этим требованиям. Однако к спекуляциям по по­воду разработки такой технологии следует относиться с осто­рожностью. Дело в том, что извлечение металлов с помощью микробиологических процессов подчиняется тем же химиче­ским законам, что и получение их обычными физическими и химическими методами. По мере изучения способности микроорганизмов к накоплению металлов может обнаружиться, что* микробные системы способны служить лишь моделями для разработки технологий искусственного извлечения металлов.

Рис. 5.10. Электронная микрофотография Pseudomonas aeruginosa, демонстри­рующая внутриклеточное накопление урана (увеличение 27 000). Фотография любезно предоставлена Дж. У. Страндбергом (G. W. Strandberg₁ Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN).