• 7.4.1. Технология

Для получения разнообразных белков эукариот и вирусов животных широко применяются бактерии и дрожжи Saccharo- myces Cerevisiae. При этом используются самые разные методы, но наиболее широко те из них, которые описаны ниже.

Прежде всего необходимо изолировать нужный ген. Если ген животного должен экспрессироваться в клетках бактерий или дрожжей, то обычно вначале выделяют соответствующую мРНК. Как правило, осуществить прямую экспрессию генов животных в бактериальных клетках не удается, поскольку эти гены содержат интроны. Интроны — это некодирующие участки гена; вся информация об аминокислотной последовательности белка содержится в других участках — экзонах. Зрелые моле­кулы мРНК клеток млекопитающих не содержат последова­тельностей, комплементарных интронам: они удаляются фер­ментами в процессе, называемом сплайсингом. Следовательно, такие молекулы можно транскрибировать с помощью фермен­тов ревертазы (обратной транскриптазы) и ДНК-полимеразы с образованием ДНК. Некоторые гены животных, например ко­дирующие а-лейкоцитарные интерфероны, не содержат интро­нов и могут прямо экспрессироваться в бактериальных или дрожжевых клетках. Если в качестве исходного объекта прихо­дится использовать мРНК, то прежде всего следует найти ее источник — ткань, в которой этот продукт образуется в наи­большем количестве. Иногда таким источником служат опухо­левые ткани или же клетки в культуре, образующие необходи­мую мРНК.

После транскрипции данной мРНК и получения комплемен­тарной ДНК (кДНК) необходимо определить, какие из мно­жества молекул этой кДНК содержат ген, подлежащий выде­лению и экспрессии. На этом этапе работы молекулы кДНК обычно вводят в состав плазмид или генома бактериофагов, ко­торые служат векторами. Затем рекомбинантные плазмиды со встроенными молекулами кДНК переносят в клетки подходя­щих бактерий-хозяев.

Идентификация искомых клонов занимает иногда много- времени. Если же клонирование гена проведено, выявить сход­ные гены в банках кДНК относительно несложно, если приме­нить метод Грюнштейна и Хогнесса. В этом случае колонии  бактерий, содержащих рекомбинантные плазмиды, выращива­ют на нитроцеллюлозных фильтрах, помещенных на поверх­ность питательной среды. Затем бактериальные клетки разру шают, а высвободившуюся ДНК денатурируют. При этом она остается связанной с фильтром. Далее на фильтр наносят ра­диоактивный зонд — денатурированную ДНК или РНК, кото­рая связывается с гомологичной или частично гомологичной бактериальной ДНК- Избыток радиоактивных молекул зонда, которые не связались специфически с гомологичной ДНК, уда­ляют промыванием и выявляют лизированные колонии, связав­шие зонд, методом радиоавтографии. Бактерии, для которых наблюдалась положительная реакция в этом тесте, можно вы­делить из дубликата — реплики набора колоний.

Если специфический зонд отсутствует, то его можно синте­зировать химическими методами, если известна полностью или частично аминокислотная последовательность белка — продук­та интересующего нас гена. Конечно, определить точную нук­леотидную последовательность, исходя из аминокислотной по­следовательности, нельзя, поскольку каждая аминокислота мо­жет кодироваться разными триплетами (от 1 до 4). Однако, зная аминокислотную последовательность, можно синтезиро­вать набор зондов и идентифицировать с их помощью плазмиды с частично гомологичными последовательностями.

Другие методы идентификации рекомбинантных плазмид ос­нованы на экспрессии включенного в них гена. При этом иден­тифицируется белковый продукт, для чего используются имму­нологические методы или методы определения его специфиче­ской активности. Для обнаружения антигенов в бактериях пу­тем скрининга, на основе специфического их взаимодействия с антителами, часто используется метод, разработанный Брумом и Джилбертом. Для этого пластиковый диск покрывают слоем специфических радиоактивных антител и помещают его на предварительно лизированные колонии. Антигены из лизиро­ванных бактерий связываются с антителами на диске. Положе­ние антигенов, адсорбированных на диске, определяют с по­мощью радиоавтографии.

Включение ДНК в плазмидные и фаговые векторы

Обычно выбор вектора определяется штаммом хозяина, кото­рый используется для экспрессии клонированной ДНК. Если в роли хозяина выступает E. coli, плазмидный вектор скорее всего представляет собой произ­водное pBR322, а если хозяи­ном является Bacillus spp., то векторные плазмиды получают из различных видов Bacillus или Staphylococcus. Вектор для Saccharomyces Cerevisiae кон­струируют либо на основе плазмиды длиной 2 мкм, либо из фрагментов хромосомы дрожжей, способных реплици­роваться подобно плазмидам. Нередко используются чел­ночные векторы, которые могут реплицироваться в одном или нескольких организмах- хозяевах. Применение таких векторов оказывается весьма­ перспективным в связи с тем, что нередко для наработки большого количества плазмид и для трансформации ДНК удобнее в роли хозяина использовать- E. coli. Строение плазмиды pBR322 показано на рис. 7.3.

Рис. 7.6. Нуклеотидные последователь­ности, узнаваемые и расщепляемые эн донуклеазами рестрикции AluI (ввер­ху) и BamIII (внизу).

Она несет гены устойчивости к тетрациклину и ампициллину. На карте указаны места расщепления этой молекулы эндонуклеа­зами рестрикции (рестриктазами).Испо льзуемые при клонировании рестриктазы выделяют из различных прокариот. Всего было получено более ста пятидеся­ти их разновидностей. Они отличаются друг от друга тем, что узнают и расщепляют разные нуклеотидные последовательно­сти. Сайты узнавания для большинства ферментов, используе­мых в генетической инженерии, представляют собой палиндро­мы из 4, 5 или 6 нуклеотидов. Расщепление происходит с обра­зованием либо «тупых» (как в случае AluI), либо липких (спо­собных к комплементарному связыванию) концов (как в случае BamHI; см. рис. 7.6). Неспаренные нуклеотиды липкого конца оканчиваются З'-гидроксильной или 5'-монофосфатной группи­ровкой в зависимости от фермента.

Обычный метод клонирования ДНК основан на расщепле­нии плазмидной и встраиваемой ДНК одной и той же рестриктазой. При этом получаются молекулы с липкими концами, ко­торые затем отжигают, получают кольцевую рекомбинантную  молекулу и сшивают ДНК-лигазой фага Т4. В случае плазми­ды pBR322 встраивание обычно осуществляют по генам устой­чивости к антибиотикам, поскольку такие рекомбинантные мо­лекулы легко распознать по их неспособности обеспечить устой­чивость.

ДНК-лигазу фага Т4 можно применять и для сшивания «ту­пых» концов молекул ДНК, хотя этот процесс осуществляется труднее, чем в случае липких концов. Липкие концы можно превратить в тупые путем отщепления одноцепочечных высту­пающих участков специфичными только к таким участкам нук­леазами. Альтернативный способ основан на использовании ДНК-полимеразы: она присоединяет к короткой цепи недо­стающие нуклеотиды, комплементарные 5'-одноцепочечной вы­ступающей части молекулы. Лигаза применяется также для встраивания в плазмиды синтезированных фрагментов ДНК с целью получения на стыке ДНК-вставки и вектора нужной по­следовательности. Комплементарные одноцепочечные концы у вектора и встраиваемой ДНК могут быть образованы при по­мощи концевой ДНК—нуклеотидилтрансферазы: она присоеди­няет нуклеотиды к З'-концам молекул ДНК- C ее помощью к З'-концам вектора могут быть добавлены «хвосты» из несколь­ких остатков дезоксигуаниловой кислоты [oligo(dG)]₁ а к кон­цам встраиваемой молекулы — комплементарная последова­тельность oligo (dC). Смысл этой процедуры состоит в том, что .повторное лигирование вектора становится невозможным.

Трансформация

Полученные in vitro рекомбинантные плазмиды необходимо пе­ренести в подходящую клетку-хозяина, природа которой и оп­ределяет особенности способа трансформации. Так, клетки Е. coli становятся компетентными (т. е. способными захваты­вать очищенную ДНК) после обработки их на холоду CaCR, а клетки Bacillus subtilis приобретают компетентность на опре­деленной фазе клеточного цикла при их разовом культивирова­нии в условиях дефицита питательных веществ. Многие дру­гие бактерии, включая виды Streptomyces, можно трансформи­ровать только в форме протопластов, когда удалены клеточные стенки. Для облегчения проникновения ДНК в дрожжевые клетки после обработки их CaCK или ПЭГ из этих клеток так­же часто получают протопласты. Интактные дрожжевые клет­ки становятся компетентными после обработки ионами щелоч­ных металлов, например Li⁺.

• 7.4.2. Экспрессия клонированных генов

Цель многих опытов по клонированию состоит в наработке в большом количестве какого-либо белка эукариот. Именно для этого и встраивают гены эукариот в плазмиды бактерий. Что­бы достичь высокого уровня экспрессии гена, эукариотическую ДНК нужно встроить вблизи от активного промотора транск­рипции; образующаяся мРНК при этом должна эффективно транслироваться. Промоторы, использующиеся для обеспечения активной экспрессии, обычно не принадлежат к числу изна­чально присутствующих в плазмидах. Как правило, это бывают промоторы фаговых или хромосомных генов, включаемые в плазмидные векторы. Типичным примером такого рода служит промотор P_l бактериофага λ. ДНК с таким промотором эффек­тивно транскрибируется, и образуется большое количество мРНК- Контроль за работой P_l осуществляется белком-репрес­сором, продуктом гена Ci этого бактериофага. Ген Cι₈57 кодиру­ет температурочувствительный белок-репрессор, который акти­вен при 30 ⁰C, но не работает при 42⁰C. Если внести этот ген в составе плазмиды или фага в ту же клетку, что и промотор Pl, то экспрессию клонированных генов, контролируемую Pl, можно регулировать, изменяя температуру.

У дрожжей Saccharomyces cereυisiae векторы с высоким уровнем экспрессии конструируют на основе промоторов генов, которые кодируют важнейшие клеточные белки (например, ал­когольдегидрогеназу и фосфоглицераткиназу). Так, с помощью промотора алкогольдегидрогеназы Cl удалось добиться прямой транскрипции в дрожжах гена инсулина человека, а в опытах с использованием промотора фосфоглицераткиназы получен высокий уровень экспрессии генов интерферонов.

C помощью бактерий были получены с высоким выходом не­которые белки — продукты генов животных и их вирусов. Так, были созданы штаммы E. coll, у которых 20% всего клеточно­го белка составляли коровый антиген вируса гепатита В, гор­мон роста человека или главный капсидный антиген вируса ящура. У одного из сконструированных штаммов В. SUbtilis последний составлял около 1 % синтезируемого этой бактерией белка. Однако добиться экспрессии в бактериальных клетках генов некоторых белков животных или их вирусов совсем не­просто, даже если эти гены сопряжены с сигналами инициации транскрипции и трансляции, которые обеспечивают в норме высокий уровень экспрессии генов прокариот. Причины такой неэффективной экспрессии не всегда ясны, но в некоторых слу­чаях удалось установить, что протеазы бактерий быстро разру­шают белки животных и вирусов. В подобных ситуациях мож­но повысить выход, применяя несодержащие протеаз мутанты. При выработке проинсулина, предшественника инсулина, неко­торая защита от протеаз обеспечивается тем, что полипептид секретируется в периплазматическое пространство у клеточной стенки E. coll. На N-конце молекулы препроинсулина нахо­дится последовательность гидрофобных аминокислот, с по­мощью которой (с одновременным ее отщеплением) осуществ ляется транспорт этой молекулы через мембрану в периплаз- матическое пространство. Время полужизни проинсулина в жлетке 2 мин, а в периплазматическом пространстве 20 мин.

Другой способ получения чувствительных к протеазам бел­ков основан на выделении их бактериями Bacillus в окружаю­щую среду. Эти бациллы в отличие от E. coll способны экскре­тировать некоторые белки. Так, получены штаммы Bacillus, осуществляющие экскрецию проинсулина. Выделенный в среду •белок обычно проще очищать, чем внутриклеточный. Помимо этого, использование штаммов Bacillus имеет то преимущество, что они не образуют эндотоксинов. Выяснилось, однако, что -клетки Bacillus эффективно экскретируют, видимо, лишь неко­торые типы полипептидов. В опытах с дрожжами проблема сек­реции была решена путем создания векторов, содержащих сиг­нальные последовательности генов a-фактора гормона спарива­ния или токсина-«убийцы».

• 7.4.3. Прикладные аспекты генетической инженерии

Не вызывает сомнения, что методы генетической инженерии бу­дут играть ведущую роль в развитии биотехнологии и найдут в ней самое широкое применение. Уже сегодня с помощью бак­терий и дрожжей мы получаем в больших количествах белки эукариот и вирусов, которые применяются в медицине и вете­ринарии. В табл. 7.1 перечислены некоторые белки, для синтеза которых используется этот подход.

Таблица 7.1. Белки эукариот и вирусов, получаемые методом клонирования генов в микроорганизмах

Инсулин человека a-, β- и γ-инτepфepoны

Коровый антиген вируса гепатита В

Поверхностный антиген вируса гепатита В

Гормон роста человека

Капсидный белок вируса ящура

Реннин теленка

Образование больших количеств ненужного бактериальной клетке белка ставит ее в неблагоприятное положение при отборе, так что приходится решать сложные проблемы стабилизации таких штаммов. Их удается решить — по крайней мере в случае выработки очень ценных продуктов — путем создания жестких условий отбора, направленных на сохранение плазмидного вектора, а иногда и клонируемого в нем гена. Использование индуцибельных про­моторов типа ZPl препятствует постоянному синтезу продукта, и он образуется лишь в результате индукции в определенное время клеточного цикла.

Проблема стабилизации не возникает, если вместе с клони­руемым геном клетка-хозяин получает определенные преиму­щества при отборе. Так, методы генетической инженерии по­зволяют расширить спектр используемых микроорганизмом субстратов. Пивоварение, например, заинтересовано в создании штаммов дрожжей, способных к секреции ферментов, разруша­ющих крахмал и белки. Появление у организма ряда новых ферментативных активностей может увеличить эффективность его обмена веществ. Так, фирме ICI удалось повысить эффек­тивность усвоения азота клетками Methylophilus methylotrop- hus, продуцента БОО, введя в них ген фермента глутаматде­гидрогеназы E. coll (рис. 7.7). Это позволило увеличить выход БОО примерно на 7% при росте бактерий на метаноле и ам­миаке. Сегодня мы можем уже конструировать искусственные линейные хромосомы дрожжей Saccharomyces Cerevisiae, что в принципе позволяет осуществлять стабильную модификацию клеток путем формирования в них новых путей метаболизма.

Введение чужеродного гена в клетки организма-проду­цента — это отнюдь не единственный генно-инженерный способ конструирования новых штаммов. Иногда оказывается полез­ным клонирование собственных генов организма. Так, если известно, что определенная ферментативная реакция лимитиру­ет скорость какого-то метаболитического процесса, то введе­ние многих копий соответствующего гена в рекомбинантные плазмиды может ликвидировать это «узкое место» благодаря образованию большего числа молекул фермента. Главной об­ластью применения «самоклонирования», видимо, может стать направленный мутагенез. При обычном методе получения но­вых штаммов с помощью мутагенеза и отбора действию мута­гена подвергается весь геном организма-продуцента. При этом, естественно, не гарантируется, что полезные мутации произой­дут именно в интересующих нас генах. Мутируют также и дру­гие гены, и некоторые из таких мутаций неблагоприятно по­влияют на жизнеспособность организма-продуцента. Если же провести клонирование нужных генов, то их обработку мута­геном можно провести in vitro, а затем вернуть эти гены в ор­ганизм. Это гарантирует получение только желаемых мутаций.

Основой развития фармацевтической промышленности до недавнего времени был скрининг микроорганизмов и синтети­ческих химических веществ. Появление новейших методов хи­мического синтеза генов, возможно, позволит пойти другим путем: конструирования случайных нуклеотидных последова­тельностей, их клонирования и оценки биологической активно­сти соответствующих белков и пептидов. Хотя занятие это мож­но уподобить написанию сонета Шекспира группой печатающихна машинке обезьян, случайная крупная находка поможет убе­диться, что и такой стратегией поиска не следует пренебре­гать.

Рис. 7.7. Увеличение эффективности ассимиляции азота бактериями Methylophilus methyIotrophus, используемыми для получения БОО. А. Пути ассимиля­ции аммиака у бактерий. Путь (а) эффективнее, чем (б), так как в нем не потребляется ATP. Б. Клонирование гена gdh Е. coll (гена глутаматдегидроге­назы) и его введение в Methylophilus.