Питательные среды: состав, назначение, техника приготовления

1 Определение понятия «питательная среда», требования к ее составу

2 Классификация питательных сред

3 Приготовление питательных сред

4 Наиболее используемые питательные среды в бактериологической

практике

1 Определение понятия «питательная среда»,

требования к ее составу

Потребности микроорганизмов в питательных веществах чрезвычайно разнообразны и определяются особенностями их метаболизма. В широком смысле слова питательная среда должна соответствовать следующим требованиям: Во-первых, питательная среда должна включать доступный для клетки источник энергии. Для одних организмов (фототрофов) таким источником служит свет, для других – органический (хемоорганотрофы) или неорганический (хемолитотрофы) субстрат. Во-вторых, среда должна содержать все необходимые компоненты для биосинтетических процессов в клетке. Причем синтетические способности микроорганизмов могут варьировать от использования углекислого газа в качестве единственного источника углерода (автотрофы) до потребности в более восстановленных соединениях углерода – кислотах, спиртах, углеводах и др. (гетеротрофы). В узком смысле слова любая искусственная питательная среда должна соответствовать следующим требованиям: содержать все необходимые для роста питательные вещества в легко усвояемой форме; иметь оптимальную влажность, вязкость, pH, быть изотоничной, сбалансированной с высокой буферной емкостью и, по возможности, прозрачной. Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях. Еще в 1930 году их было классифицировано не менее двух тысяч, но число ингредиентов, являющихся их неотъемлемыми компонентами, относительно невелико, а их

композиции создаются на определенных общих принципах. Для размножения любых бактерий необходимо обеспечить подходящее биофизическое окружение и биохимические питательные компоненты. Для роста автотрофных бактерий потребности в питательных веществах довольно просты: вода, двуокись углерода и соответствующие неорганические соли. Например, бактерии рода Nitrobacter ассимилируют СO₂ и получают энергию путем окисления нитритов в нитраты. Гетеротрофные бактерии используют органические соединения в двух целях: 1) в качестве источника энергии; при этом органическое вещество окисляется или расщепляется с высвобождением энергии и образованием ряда конечных продуктов типа СO₂, органических кислот и др.; 2) в качестве субстратов, ассимилируемых непосредственно с образованием клеточных компонентов или для их синтеза в реакциях, требующих затрат энергии. Так, E.coli способна к росту на простой среде, содержащей только глюкозу и неорганические соли. Молочнокислые же бактерии растут на сложных средах, содержащих в качестве добавок ряд органических соединений (витамины, аминокислоты и др.), которые клетки не в состоянии синтезировать самостоятельно. Такие соединения называются факторами роста.

2 Классификация питательных сред

Выбор питательной среды зависит в значительной степени от целей эксперимента, а существующая классификация питательных сред учитывает характеристику их следующих особенностей. По составу питательные среды делятся на натуральные и синтетические. Натуральными называют среды, которые состоят из продуктов растительного или животного происхождения, имеющих неопределенный химический состав. Примерами питательных сред такого типа являются среды, представляющие собой смесь продуктов распада белков (казеина, мышц млекопитающих), образующихся при их гидролизе. Кислотный (НСl) гидролиз белков используется для приготовления полных гидролизатов. Действие ферментов типа трипсина, панкреатина, папаина приводит к неполному гидролизу белков, в результате чего образуются пептоны. Как правило, на пептонных питательных средах микроорганизмы растут лучше, чем на питательных средах, приготовленных из полных гидролизатов или смесей аминокислот. При ферментативном гидролизе, вероятно, сохраняются лабильные факторы роста. Кроме того, многие микроорганизмы лучше размножаются на средах, содержащих

небольшие пептиды, потому что их они могут усваивать непосредственно, а отсутствующие аминокислоты – нет. К питательным средам неопределенного состава можно отнести и среды, полученные на основе растительного сырья: картофельный агар, томатный агар, отвары злаков, дрожжей, пивное сусло, настои сена и др. К числу сред неопределенного состава относят и среды полусинтетические. В такую среду вносят известные соединения как явно необходимые; а также добавляют небольшое количество дрожжевого или кукурузного экстракта (или любого другого природного продукта) для обеспечения неизвестных потребностей роста. Основное назначение таких питательных сред – выделение, культивирование, получение биомассы и поддержание культур микроорганизмов. Синтетические среды – это среды определенного состава, представленные чистыми химическими соединениями, взятыми в точно указанных концентрациях и соотношениях отдельных элементов. Обязательными компонентами таких сред являются неорганические соли и углерод- и азотсодержащие вещества (типичными представителями являются глюкоза и (NH4)2SO4. Часто к таким средам добавляют буферные растворы и хелатирующие соединения. Ауксотрофные организмы растут на таких средах только при добавлении соответствующих факторов роста. Основное назначение таких питательных сред – изучение особенностей физиологии и метаболизма микроорганизмов, выделение генетических рекомбинантов и т. д. По назначению среды разделяют на основные, элективные и дифференциально-диагностические. К основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. Например, это триптические гидролизаты рыбных продуктов или казеина, из которых готовят жидкую среду (питательный бульон) и плотную (питательный агар). К ним относят и мясо- пептонный агар (МПА), который применяют для культивирования мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, и солодовый агар (СА) – применяют для культивирования дрожжей и плесневых грибов. Такие среды служат основой для приготовления более сложных питательных сред. В качестве основных иногда используют синтетические питательные среды, к которым добавляют аминокислоты, витамины, пептон, дрожжевой экстракт и т.д. Элективные среды обеспечивают преимущественное развитие одного или целой физиологической группы микроорганизмов. Например, для преимущественного выделения грамотрицательных бактерий бывает достаточным добавления в питательную среду

трифенилметановых красителей (кристаллический фиолетовый, малахитовый зеленый и т. д.). Для выделения стафилоккоков в среду может быть добавлен хлористый натрий в концентрации 7,5 %. При этой концентрации рост других бактерий подавляется. Элективные среды применяются на первом этапе выделения чистой культуры бактерий, т. е. при получении накопительной культуры. Дифференциально-диагностические среды применяются для быстрой идентификации близкородственных видов микроорганизмов, для определения видовой принадлежности, в клинической бактериологии и т.д. Принцип построения таких сред основан на том, что разные виды бактерий различаются между собой по биохимической активности и имеют неодинаковый набор ферментов, расщепляющих субстраты, входящие в состав питательной среды. В состав дифференциально-диагностической среды входят: а) основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий; б) определенный химический субстрат, отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроорганизма; в) цветной индикатор, изменение окраски которого свидетельствует о биохимической реакции и наличии данной ферментной системы у исследуемого микроорганизма. Например, среда Левина в качестве индикаторов содержит эозин и метиленовый синий, исходно окрашена в черно-синий цвет. Клетки, осуществляющие брожение, образуют колонии, окрашенные в черный с металлическим блеском цвет, а колонии, не обладающие этим свойством, бесцветны. Данная среда позволяет отличать бактерии рода Escherichia от бактерий рода Proteus. Для этой же цели на практике часто используют среду Эндо. По консистенции среды могут быть жидкими, полужидкими, твердыми, сыпучими.

3 Приготовление питательных сред

Жидкие питательные среды получают при растворении в воде определенного необходимого набора питательных веществ, макро- и микроэлементов. По составу они могут быть как натуральными, так и синтетическими. Среды в твердом состоянии в форме плотных гелей используются в бактериологии со времен Р. Коха. Наиболее важным преимуществом использования твердых сред является то, что на них можно выращивать

микроорганизмы в виде колоний, образующихся из отдельных клеток популяции. Приготовление твердых питательных сред достигается добавлением к жидким средам определенных уплотнителей, в качестве которых могут выступать агар, желатина, силикагель, каррагенан. Наиболее распространенным из уплотнителей является агар – полисахарид, выделяемый из красных морских водорослей и состоящий из двух полисахаридов – агарозы (70 %) и агаропектина. Он обладает рядом полезных свойств, в частности: 1) способен образовывать в воде гели; 2) плавится при температуре 100 °С и затвердевает при 45 °С; 3) не расщепляется под влиянием ферментов многих видов микроорганизмов; 4) термолабильные вещества и живые микроорганизмы не разрушаются при добавлении к нагретому до 45 °С расплавленному агару, если смесь сразу же охладить; 5) агаровые гели имеют высокую степень прозрачности; 6) наиболее часто используемые концентрации 1,5–2,0 % являются относительно невысокими и их применение относительно экономично. Желатина – белок, приготовленный из кожи и костей. «Уплотняющая» концентрация желатины – 17–20 %. Используется для специальных целей, поскольку образуемый ею гель плавится при температурах около 30 °С. Кроме того, желатина разжижается протеолитическими ферментами многих микроорганизмов. Силикагелем называют двуокись кремния (SiO₂). Среды на основе силикагеля (1,5–2,0 %) используют для получения культур автотофных бактерий, так как при этом в среде отсутствуют органические вещества. С помощью силикагелиевых сред также можно определять потребности бактерий в витаминах. Каррагенан («растительная желатина») – добывается путем экстракции из определенных видов красных морских водорослей. Каррагенан дешевле агара, используется в концентрации 2 %, не разрушается большинством видов бактерий. Однако разливать приготовленные среды следует при высокой температуре – 55–60 °С. Полужидкие среды содержат гелеобразующее вещество в низкой (0,3–0,7 %) концентрации и имеют мягкую желеподобную консистенцию. Такие среды пригодны для изучения подвижности и хемотаксиса клеток, культивирования микроаэрофилов. Сыпучие среды представляют собой массу в той или иной степени измельченного и увлажненного сырья (чаще всего растительного). Основное их назначение – использование в пищевой промышленности (получение соевого соуса или водки), сельском хозяйстве (силосование кормов, выращивании грибов) и т. д.

Определение состава питательной среды предполагает, что при этом будут учтены и такие биофизические факторы как pH среды, температура, подача и удаление молекулярного кислорода, являющимися критическими для роста любой бактериальной культуры.

4 Наиболее используемые питательные среды

в бактериологической практике

В бактериологической практике чаще всего используются сухие питательные среды, которые получают в промышленных масштабах – триптические гидролизаты дешевых непищевых продуктов (рыбные отходы, мясокостная мука, технический казеин) и питательный агар. Сухие среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке и приготовлении, имеют относительно стандартный состав.

Вопросы для самоконтроля

1 Определите понятие «питательные среды».

2 Какие требования предъявляют к составу питательных сред?

3 Поясните на примерах классификацию питательных сред.

4 Какие вещества используются для получения твердых сред?

5 Почему агар является наиболее используемым уплотнителем при

приготовлении плотных сред? 6 Перечислите наиболее распространенные питательные среды в

бактериологической практике, охарактеризуйте их.

Практическое занятие 1

Цель: ознакомление с наиболее часто употребляемыми

питательными средами, их составом, назначением, техникой приготовления.

Оборудование и материалы: дистиллированная вода, электрическая

плитка, мерные цилиндры, весы, шпатель, стерильные колбы на 250 мл с ватными пробками, хозяйственная руковица, сухие питательные среды разного состава, стерильные чашки Петри, спиртовка, спички, чашки Петри с питательной средой.

Ход работы

1 Изучить составы ниже приведенных питательных сред, записать в

рабочую тетрадь название сред и их составы. Охарактеризовать каждую из них согласно классификации: по составу, назначению, консистенции; указать условия культивирования микроорганизмов на каждой из сред?

Среда 1, (г/л): Na₂HPO₄ – 24, KH₂PO₄ – 12, NaCl – 2, NH₄Cl – 4,

глюкоза – 10, pH – 7,2. Среда 2, (г/л): Na₂HPO₄ – 24, KH₂PO₄ – 12, NaCl – 2, NH₄Cl –

4, глюкоза – 10, цистеин – 0,01, агар – 15, pH – 7,2. Среда 3. Среда М 9 (основа для культивирования почвенных

бактерий), (г/л): Na₂HPO₄ – 24, KH₂PO₄ – 12, NaCl – 2, NH₄Cl – 4, pH – 7,2. Среда 4, (г/л): Na2 HPO4 – 24, KH2 PO4 – 12, NaCl – 2, NH₄Cl – 4,

гидролизат казеина – 10, дрожжевой экстракт – 5, pH – 7,2. Среда 5, (г/л): пептон – 5, мясной экстракт – 5, бромкрезоловый

пурпурный 1,6% раствора – 0,625 мл, крезоловый красный 0,2% раствора – 2,5 мл, глюкоза – 0,5 г, пиридоксаль – 0,5, pH среды – 6,0. Среда 6. Среда Эшби (концентрированная) для культивирования

азотфиксирующих микроорганизмов, (г/л): KH₂PO₄ – 2, NaCl – 2, K₂SO₄ –1, MgSO₄ – 2, CaCO₃ (мел) – 50, маннит – 200, pH – 7,2. Среда 7. Мясопептонный бульон (для культивирования широкого

круга микроорганизмов), (г/л): мясная вода, NaCl – 0,5 %. Среда 8. Картофельная среда (в основном для культивирования

спорообразующих бактерий), (г/л): картофель, мел – на кончике ножа. Среда 9. Среда (для выделения актиномицетов), (г/л): крахмал

растворимый – 20, КNО3 – 1, К₂НРО₄ – 0,5, MgSO₄ x 7Н 2O – 0,5, NaCl – 0,5, FeSO4 – следы, вода водопроводная, pH 7,2–7,3. Среда 10. Для выделения культур Clostridium, (г/л): КН₂РО₄ – 0,5,

К₂НРО₄ – 0,5, MgSO₄ – 0,5, NaCl – 0,5, вода водопроводная, глюкоза – 20, пептон – 5, CaCO₃ – 10, pH – 7,0. Среда 11. Для выделение микроорганизмов, растворяющих фосфаты

кальция, (г/л): глюкоза – 10, аспарагин – 1, К₂SО₄ – 0,2, МgSО₄ x 7H₂O – 0,2, дрожжевой экстракт – 0,02, агар – 15, вода водопроводная. Среда 12. Выделение культур микобактерий, (г/л): NН4С1 – 0,5,

К₂НРО₄ – 0,5, МgSO4 – 0,2, СаСО3 – 0,2, вода водопроводная.

Среда 13. Выделение культур лактобацилл, (г/л): гидролизат казеина

– 10, мясной экстракт – 10, дрожжевой экстракт – 5, глюкоза – 20,

ацетат натрия – 5, цитрат аммония – 2, К₂НРО₄ – 2, МgSO4 – 0,2, MnCl2 x 4H₂O – 0,05, вода дистиллированная. Среда 14. среда Гиса, (г/л): пептон – 10, NаС1 – 5, K2HPO4 – 10,

индикатор Андреде – 1% или бромкрезоловый пурпурный – 1,6%, агар – 5, вода дистиллированная, pH – 7,2. Среда 15, (г/л): Na2 HPO4 – 24, KH2 PO4 – 12, NaCl – 2, NH₄Cl – 4,

гидролизат казеина – 10, дрожжевой экстракт – 5, агар – 20, pH –7,2. 2 Приготовить 150 мл плотной питательной среды.

Последовательность приготовления питательной среды с использованием сухого питательного агара следующая: 2.1 Налить в 250-мл стерильную колбу 150 мл дистиллированной

воды. 2.2 Взвесить на весах лабораторных MWP-1500 (см. руководство по

эксплуатации) нужное количество питательной среды (5 г из расчета на 100 мл)*.

2.3 Засыпать сухой питательный агар в холодную воду.

2.4 Тщательно размешать. Для этого поставить колбу с содержимым

на магнитную мешалку IKA C-MAG HSJ IKAMAG (см. руководство по эксплуатации). Закрыть колбу ватной пробкой, соблюдая приемы поддержания стерильности. 2.5 Поставить колбу со средой на электрическую плитку либо

водяную баню BWT-U (см. руководство по эксплуатации). Довести среду до полного растворения агара, не допуская его пригорания. 2.6 Простерилизовать среду на паровом стерилизаторе, модель

LAC-3010/E (см. инструкцию по эксплуатации). 2.7 Остудить среду до 45 °С.

2.8 С соблюдением приемов стерильности в боксе абактериальной

воздушной среды «БАВп-01-«Ламинар-С.»-1.2 (см. руководство по эксплуатации) разлить среду по 25 мл в стерильные чашки Петри. 2.9 Дать застыть агаризованной среде.

*Примечание: 1) взвешивание реактивов в мг следует проводить на

весах аналитических (Ohaus); 2) Измерение pH питательной среды выполнять на ионометре И-160 МП (см. руководство по эксплуатации).