Способы культивирования микроорганизмов
1 Понятие о культивировании микроорганизмов
2 Способы культивирования аэробных и анаэробных
микроорганизмов ### 3 Техника посева микроорганизмов в жидкие питательные среды
4 Техника посева микроорганизмов на агаризованную среду
1 Понятие о культивировании микроорганизмов
Культивирование микроорганизмов, помимо состава питательной среды, сильно зависит от физических и химических факторов (температуры, кислотности, аэрации, света и т. д.). При этом количественные показатели каждого из них неодинаковы и определяются особенностями метаболизма каждой группы бактерий. Можно выделить методы культивирования на твердых и в жидких питательных средах; в аэробных, анаэробных и микроаэрофильных условиях. Характеристики этого процесса устанавливают путем измерения таких показателей как число клеток или их биомасса. В лаборатории микроорганизмы выращивают на плотных и жидких питательных средах, которые разливают в пробирки, колбы, матрасы и чашки Петри. Посуду и питательные среды предварительно стерилизуют различными методами. Внесение микроорганизмов в стерильную среду называется посевом, или инокуляцией. Посев микроорганизмов требует соблюдения определенных правил, которые необходимо выполнять, чтобы предохранить исследуемую культуру от загрязнения посторонними микроорганизмами. Перед посевом следует сделать надписи на посуде. Клетки микроорганизмов для посева или приготовления препаратов берут бактериологической петлей или иглой, если микроорганизмы выращивали на плотной среде. В случае, когда микроорганизмы выращены в жидкой среде, лучше пользоваться пипеткой. После пересева пробирки или другие сосуды с микроорганизмами помещают в термостаты с определенной температурой. По окончании работы посуду с культурами микроорганизмов, подлежащими выбрасыванию, следует автоклавировать, чтобы убить клетки, и только после этого мыть. Допускается заливать
дезинфицирующим раствором поверхность плотных сред. Через сутки среды можно выбрасывать и посуду мыть. Неаккуратное обращение с культурами микроорганизмов приводит к возникновению бактериального аэрозоля.
2 Способы культивирования аэробных и анаэробных
микроорганизмов
Культивирование аэробных микроорганизмов проводят следующим образом: – на поверхности плотных сред или в тонком слое жидких сред,
когда микроорганизмы получают кислород прямо из воздуха; – в жидких средах (глубинное культивирование). В этом случае
микроорганизмы используют растворенный в среде кислород. В связи с низкой растворимостью кислорода, для обеспечения роста аэробных бактерий в толще среды, требуется постоянное аэрирование. Наиболее простой и широко используемый в лабораторной практике способ глубинного культивирования – выращивание на шейкерах, обеспечивающих встряхивание колб или пробирок со скоростью 100– 200 об/мин и более. В работе удобно использовать термостат-шейкер
ES-20/60 (см. руководство по эксплуатации). Помимо перемешивания, аэрировать культуру микроорганизмов можно продуванием под давлением через толщу среды стерильного воздуха. Граница между аэробными и анаэробными микроорганизмами является относительно условной. Хотя облигатными анаэробами обычно считают бактерии, рост которых невозможен в присутствии растворенного кислорода, на практике к анаэробным относят те бактерии, которые не растут на поверхности твердой или полужидкой среды на воздухе при атмосферном давлении. Аэротолерантные бактерии хорошо растут на поверхности агара и чашках при низком уровне кислорода. Степень анаэробиоза измеряется по окислительно-восстановительному (редокс, Eh) потенциалу среды. При увеличении Eh выше 100 мВ, обусловленном присутствием растворимого кислорода, подавляется рост всех анаэробных бактерий. Для удаления кислорода и создания соответствующих условий среды можно воспользоваться следующими методами: ### 1 Культивирование в микроанаэростате, например,
анаэростате АЭ-01 (см. паспорт) – аппарате для выращивания микроорганизмов, в котором воздух замещен газовой смесью. Наиболее часто используемая смесь имеет следующий состав: азот с 5 % СO₂ и 10 % Н2 .
2 Использование химических веществ, поглощающих
молекулярный кислород. В качестве поглотителей молекулярного кислорода в лабораторной практике используют щелочной раствор пирогаллола, дитионит натрия (Na₂S₂O₄), металлическое железо, хлорид одновалентной меди и некоторые другие реактивы. Поглотители помещают на дно химического эксикатора с притертой крышкой, а также анаэробные бактерии, засеянные в колбу, пробирку или чашку Петри. При таком способе создания анаэробных условий необходимо учитывать поглощающую способность реактивов и объем замкнутого пространства, в котором выращиваются бактерии. ### 3 Использование восстанавливающих агентов, которые
добавляют для снижения окислительно-восстановительного потенциала среды: тиогликолат натрия, цистеин, дитиотрейтол, аскорбиновая кислота. Удаления кислорода из среды можно добиться и в результате быстрого нагревания и кипячения среды с последующим быстрым охлаждением. Если в такую среду засеять анаэробные микроорганизмы и наслоить смесь (1:1) масла и парафина, то в подобных условиях будет наблюдаться рост нестрогих анаэробов. ### 4 Выращивание совместно с аэробными или факультативно-
анаэробными бактериями. В жидкой среде с восстанавливающими агентами перед инокуляцией анаэроба проводят культивирование, например, E.coli, что приводит к удалению из среды остаточного кислорода. Перед инокуляцией анаэробов клетки E.coli убивают нагреванием. Существует и другая модификация метода. На половине чашки Петри засевают какой-либо аэробный микроорганизм, на другой – анаэроб. Края чашки заливают парафином. Рост анаэробного микроорганизма начнется после полного использования кислорода аэробом. Для культивирования анаэробных бактерий используют и другие методы, ограничивающие доступ воздуха к растущей культуре: – выращивание в высоком слое среды;
– выращивание в толще плотной среды;
– культивирование в вязких средах, в которых диффузия
молекулярного кислорода в среду уменьшается с увеличением ее плотности; – заливка среды с посевом высоким слоем стерильного вазелинового
масла или парафина; – культивирование в термостат СO₂ –инкубаторе (см. руководство
по эксплуатации). – самый современный и эффективный метод работы с анаэробными
бактериями – выполнять работу по получению первичной и
перевиваемых культур, их культивированию для накопления биомассы, с использованием анаэробной рабочей станции SIMPLICITY 888 (см. руководство по эксплуатации).
3 Техника посева микроорганизмов в жидкие питательные
среды
Посев микроорганизмов обычно осуществляется бактериологической петлей. Отбор клеток микроорганизмов производят следующим образом. В правую руку берут петлю и стерилизуют ее нагреванием в пламени спиртовки. Пробирку с культурой берут в левую руку таким образом, чтобы поверхность питательной среды с выросшими колониями микроорганизмов была хорошо видна. Затем, не выпуская петли, мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижимают наружный конец ватной пробки к ладони и вынимают пробку из пробирки. Края открытой пробирки слегка обжигают в пламени горелки, вводят в пробирку стерильную петлю. Петлю охлаждают прикосновением к внутренней поверхности стекла пробирки или на свободной от микроорганизмов части среды и после этого захватывают небольшое количество микробной биомассы. Осторожно вынимают петлю из пробирки, горлышко пробирки вновь обжигают, ватную пробку проводят над пламенем спиртовки и закрывают ею пробирку. Пробирку с культурой помещают в штатив, а извлеченную культуру переносят в жидкую питательную среду, находящуюся в другой пробирке или колбе. Оставшиеся на петле после пересева клетки микроорганизмов тщательно сжигают в пламени спиртовки. В этом случае прокаливание петли начинают с участка проволоки, ближе к основанию держателя, чтобы клетки, оставшиеся на петле, подсохли и не образовали аэрозоль, загрязняющий воздух. Затем петлю переводят в вертикальное положение, прокаливают докрасна и только после этого ставят на место.
4 Техника посева микроорганизмов на агаризованную среду
Посев на скошенный агар в пробирках проводят следующим образом. Клетки микроорганизмов отбирают бактериологической петлей (как описано в п. 3) и вводят петлю в пробирку со скошенной агаризованной средой почти до дна. Слегка прикасаясь петлей к поверхности среды, проводят от дна вверх зигзагообразную или прямую черту-штрих.
Посев на поверхность агаризованной среды в чашках Петри можно производить с помощью бактериологической петли, микробиологического шпателя или методом реплик. При посеве петлей отбирают клетки микроорганизмов с агаризованной или жидкой среды, приоткрывают крышку чашки Петри и на поверхности среды проводят штрихи, после чего чашку закрывают и помещают в термостат крышкой вниз. При посеве микроорганизмов из жидкой среды с использованием микробиологического шпателя поступают следующим образом. Для этого вынимают пипетку за верхний конец из бумаги, насаживают резиновую грушу. На поверхность среды в чашке наносят с помощью стерильной пипетки заданный объем жидкой культуры. Одновременно вращая чашку и проводя круговые движения стерильным шпателем, суспензию распределяют по поверхности среды. После использования пипетку немедленно переносят в дезинфицирующий раствор (хлорамина, фенола), не касаясь ею окружающих предметов. При пересеве микроорганизмов методом реплик используют стерильные кусочки бархата с коротким, жестким и густым ворсом. Бархат помещают на специальный столик для реплик, диаметр которого меньше диаметра чашки Петри, и закрепляют металлическим кольцом. Чашки Петри с агаризованной питательной средой и сформировавшимися колониями микроорганизмов накладывают поверхностью среды на бархат и слегка прижимают. Чашку осторожно снимают, а бархат с отпечатками колоний после этого может служить исходным штампом для засева других чашек со средой. Возможно снятие отпечатков на серию чашек, содержащих различные среды. В качестве контроля в последнюю очередь производится отпечаток на чашку Петри с исходной питательной средой. При глубинном посеве микроорганизмов в агаризованную питательную среду ее предварительно разливают по 15–20 мл в пробирки и стерилизуют. После охлаждения расплавленной среды до 48–50 °С в каждую пробирку стерильной пипеткой вносят по 0,1–1,0 мл жидкой культуры микроорганизмов. При необходимости готовят серию разведений культуры микроорганизмов с таким расчетом, чтобы при высеве получить изолированные колонии. Содержимое пробирки перемешивают путем ее вращения между ладонями и быстро выливают в чашку Петри. После застывания среды чашки помещают в термостат. В некоторых особых случаях используют выращивание бактерий в полужидких средах. Такая среда пригодна для культивирования микроаэрофильных бактерий, изучения подвижности клеток и хемотаксиса. При использовании 0,1–0,4 % агара, гелеобразующие вещества расслаивают среду таким образом, что конвекционные потоки
не способны смешивать богатые кислородом верхние слои среды с нижними. Единственным путем для проникновения кислорода в более глубокие слои в данном случае является диффузия, что создает градиент концентрации кислорода. При инокуляции среды в пробирке уколом петлей, микроаэрофилы начинают расти несколько ниже поверхности, где концентрация кислорода для них наиболее благоприятна. Анаэробы начинают расти в нижней части полужидкой среды. Все описанные выше манипуляции проводят около пламени горелки, по возможности быстро, чтобы не загрязнять культуру посторонними микроорганизмами. Не рекомендуется делать резкие движения, ходить около проводящего посев, так как движение воздуха увеличивает вероятность случайного загрязнения культуры.
Вопросы для самоконтроля
1 Дайте общее представление о культивировании микроорганизмов.
2 Каково отношение микроорганизмов к молекулярному кислороду?
3 Перечислите способы культивирования аэробных
микроорганизмов. 4 Перечислите способы культивирования анаэробных
микроорганизмов. 5 Охарактеризуйте технику посева микроорганизмов в жидкие
питательные среды. 6 Охарактеризуйте технику посева микроорганизмов на
агаризованные среды.
Практическое занятие 2
Цель: ознакомление со способами культивирования
микроорганизмов, техникой посева на (в) питательные среды.
Материалы и оборудование: бактериальные петли (иглы),
бактериальные шпателя, стакан со спиртом, колбы (пробирки) с ватными пробками, чашки Петри, стерильные пипетки, спиртовки, спички.
Ход работы
1 Отработать приемы пересева плотной культуры клеток с одной
пробирки (колбы), закрытых ватными пробками, в другую; с одной чашки Петри – в другую. 2 Отработать приемы пересева жидкой культуры клеток с одной
пробирки (колбы), закрытых ватными пробками, в другую, либо в чашку Петри. Задание 1 и 2 выполнить в боксе абактериальной воздушной среды «БАВп-01-«Ламинар-С.»-1,2 (см. руководство по эксплуатации). 3 Нарисовать в рабочей тетради схему распределения прокариот в
зависимости от их отношения к молекулярному кислороду. 4 Ознакомиться со способами культивирования аэробных и
анаэробных микроорганизмов, записать их в рабочей тетради. 5 Ознакомиться с оборудованием микробиологической лаборатории,
используемом для культивирования аэробных и анаэробных микроорганизмов: соответственно, термостат суховоздушный ТС-1- 80-СПУ (см. руководство по эксплуатации), термостат-шейкер ES- 20/60 (см. руководство по эксплуатации) и анаэростат АЭ-01 (см. паспорт), анаэробная рабочая станция (см. руководство по эксплуатации), 6 Охарактеризовать рост бактерий в жидкой среде с различным
отношением к молекулярному кислороду в соответствии с рисунком 2.1. Рисунок зарисовать в рабочую тетрадь и соответственно подписать группы прокариот в зависимости от отношения к молекулярному кислороду.
Рисунок 2.1 — рост бактерий в жидкой среде с различным отношением к O₂
Рисунок 2.1 – Иллюстрация роста бактерий в жидкой среде с различным отношением к O₂
7 Предложить различные варианты посева микроорганизмов
(рисунок и расположение штрихов) бактериалогической петлей на агаризованную среду: а) в чашке Петри; б) в микробиологической пробирке. Рисунки зарисовать в рабочую тетрадь.