9.1. ВВЕДЕНИЕ

Яйца домашних кур (Gallus gallus) во многих странах составляют важную часть рациона питания населения и представляют собой объект международной торговли. В странах ЕС в период 1993-2003 гг. производство яиц выросло на 12,2%, достигнув в итоге 96,4 млрд шт. в год. В настоящее время только в одной Великобритании ежедневно потребляется около 27 млн шт. яиц. Несмотря на высокое содержание влаги (74%), яйца являются важным источником высококачественного белка и ненасыщенных жирных кислот, железа, фосфора, минеральных веществ и витаминов А, В, D, Е и К. Благодаря своим функциональным свойствам яйцепродукты нашли широкое применение в пищевой промышленности и являются важнейшими ингредиентами многих пищевых продуктов. Они широко используются, например, в производстве макаронных изделий, салатных заправок и дрессингов, мороженого, кондитерских и хлебобулочных изделий. Помимо широко распространенной розничной торговли куриным яйцом, еще больше яиц используется для производства промышленной яичной массы, включая пастеризованное жидкое яйцо (белок и желток) без скорлупы, которое по потребности может быть как в свежем, так и в замороженном и порошкообразном состоянии.

Большинство свежих яиц стерильны внутри, однако иногда может происходить их контаминация микроорганизмами, потенциально патогенными для людей (особенно это относится к сальмонеллам). Риски, связанные с контаминированными сальмонеллами яйцепродуктами, известны уже довольно давно (см. например, работы [62, 70]), и поэтому жидкие яйцепродукты требовалось пастеризовать. В период 1985-1990 гг. стала очевидной беспрецедентная пандемия сальмонеллеза человека под действием S. enteritidis (SE). Это заболевание было вызвано панзоотией серотипа, поражавшего и бройлеров, и несушек, что привело к росту числа яиц, контаминированных сальмонеллами, и к повышению рисков инфицирования человека яйцами в скорлупе.

Впоследствии ситуация значительно улучшилась благодаря внедрению специальных мер контроля (включая вакцинацию птицы), но существует потенциальная возможность возникновения подобных проблем в будущем из-за уже известного или других серотипов Salmonella. Из-за потенциальной угрозы здоровью населения, связанной с заражением яйца сальмонеллами, микробиологический контроль яиц и яйцепродуктов по-прежнему необходим.

Помимо патогенных микроорганизмов сырое яйцо может также контаминироваться микроорганизмами порчи (особенно при треснувшей скорлупе). Порча яиц вызывается микроорганизмами различных видов, но прежде всего псевдомонадами и некоторыми представителями семейства Enterobacteriaceae. Яйца могут контаминироваться и в процессе их разбивания, и поэтому для гарантии безопасности пищевого продукта сырые яйцепродукты пастеризуют.

В настоящей главе мы вкратце рассмотрим основные факторы, влияющие на контаминацию яиц и яйцепродуктов патогенными микроорганизмами и микроорганизмами порчи, опишем методы отбора проб, а также методы обнаружения и идентификации основных целевых микроорганизмов.

9.2. ЯЙЦО В СКОРЛУПЕ
9.2.1. Микробиологические аспекты

Биологическая роль яйца состоит в том, чтобы защищать развивающийся зародыш и обеспечить его питательными веществами, и многие из этих его свойств имеют отношение к использованию яиц в пищу человеком (особенно это касается сдерживания инвазии микроорганизмов). Физические и химические средства защиты яйца от контаминации микроорганизмами подробно рассмотрены в работе, и ниже мы представим лишь основные выводы.

Скорлупа яйца – это жесткая структура, состоящая преимущественно из карбоната кальция на органическом матриксе. В ней содержится от 7000 до 17 000 пор диаметром 9-35 мкм. Поверхность скорлупы покрыта гликопротеиновой кутикулой, которая сразу после откладывания яйца закупоривает большинство пор (но не все). С внутренней стороны скорлупы выделяются две подскорлуповых оболочки; внутренняя оболочка, в частности, действует как бактериальный фильтр, если микроорганизму удастся проникнуть сквозь скорлупу, но некоторые бактерии могут проникать и через этот барьер, достигая содержимого яйца. Внутри яйца желток (превосходная среда для роста микроорганизмов) изолирован от окружающего его белка и удерживается в центре яйца халазой – белковыми жгутиками. Любое продвижение микроорганизма в яичном белке затруднено вязкой природой белкового мешка. После кладки яйцо остывает, и значение рН яичного альбумина повышается вследствие потери СО₂ с 7,4 до около 9,2. Такое высокое значение рН в сочетании с другими факторами (включая низкое содержание доступного азота) затрудняет или предотвращает рост микроорганизмов. Все факторы этого процесса действуют синергически, причем наиболее важными из них являются овотрансферрин (кональбумин), связывающий железо, и лизоцим – фермент, расщепляющий у грамположительных бактерий глюканы клеточных стенок. Таким образом, сырой яичный белок является неблагоприятной окружающей средой для выживания, роста и размножения микроорганизмов.

В ходе хранения яиц в них происходят определенные изменения, делающие яйцо более восприимчивым к инвазии микроорганизмов, в частности, снижается вязкость белкового мешка и ослабляется халаза. Вследствие этого желток, заключенный в желточную мембрану, постепенно смещается к подскорлуповым оболочкам. При касании желтком внутренней мембраны в какой-то точке в него могут попасть проникшие под скорлупу бактерии и, кроме того, может произойти диффузия питательных веществ из желтка в белок, что сделает последний более пригодным для роста микроорганизмов.

Что касается Salmonella, то у этих бактерий есть три пути доступа к содержимому цельного яйца. Один путь возникает в результате инфицирования репродуктивной ткани у кур – определенные штаммы SE обладают необычной, но не уникальной способностью проникать в половые пути курицы. Второй путь является следствием инвазии яйцевода кур бактериями из кишечного тракта (клоаки), что может происходить в период образования яйца по мере его продвижения по яйцеводу, где сначала закладывается белок, затем оболочки и, наконец, скорлупа. Третий путь проникновения бактерий в яйцо обусловлен их проникновением через скорлупу извне – при этом источником микроорганизма являются либо кишечный тракт курицы, либо окружающая среда, в которой откладывается яйцо.

В случае SE восприимчивым к контаминации является любой участок половых путей, и вполне вероятно, что специфическое место инфицирования влияет на локализацию SE в содержимом яйца. На практике они обычно локализуются в белке или на наружной стороне желточной оболочки. Инфицированные курицы обычно откладывают зараженные яйца только спорадически, без какой-либо системы, так что процент яиц с контаминированным содержимым обычно очень невелик – от 0 до 0,05%. Количество клеток Salmonella в контаминированных яйцах также было невелико (менее 50 клеток на яйцо), но в ходе хранения при температуре выше 8 °С оно могло возрастать до очень высокой численности. Следует отметить, что скорлупа чаще контаминируется сальмонеллами, чем содержимое яйца (прежде всего, из-за инфекции половых путей или фекального загрязнении яиц). Среди выявленных серотипов были не только представители Salmonella enteritidis, но и S. braenderup, S. infdntis, S. livingstone и S. typhimurium. Сальмонеллы со скорлупы могут контаминировать содержимое при разбивании яйца на кухне (или при промышленном производстве яйцепродуктов); кроме того, они могут перекрестно контаминировать и другие пищевые продукты, где они могут размножиться и вызвать пищевое отравление.

9.2.2. Порча яиц в скорлупе

При кладке яйцо через клоаку курицы попадает в среду, которая загрязнена самыми разнообразными микроорганизмами – фекальными, содержащимися на частицах пыли, материалах гнезда, на корме и т. п. Микроорганизмы, преобладающие на поверхности скорлупы, обычно не относятся к видам, чаще всего ассоциируемым с порчей. Основными микроорганизмами на скорлупе являются грамположительные бактерии, в частности, Micrococcus spp., хотя микробиота скорлупы может меняться в зависимости от географического региона. К микроорганизмам порчи относится сравнительно небольшое число грамположительных видов (табл. 9.1), и на их содержание в протухших яйцах не влияет ни географический регион, ни методы птицеводства. Это свидетельствует о том, что доминирующее воздействие на селекцию микроорганизмов порчи оказывают собственные защитные механизмы яйца.

Таблица 9.1.
Роды бактерий, ассоциируемые с порчей яиц в скорлупе

Чтобы вызвать порчу неповрежденного яйца в скорлупе, микроорганизм должен быть способен проникать через нее и преодолевать различные антимикробные барьеры в виде оболочек и белка. Вероятность проникновения микроорганизмов возрастает с возрастом яйца и продолжительностью контакта с зараженным материалом, особенно при высокой относительной влажности. Этот процесс зависит от температуры при хранении и одинаков и для сальмонелл, и для бактерий порчи, хотя последние способны к размножению при более низких температурах. Такое проникновение облегчается в случае мокрой и грязной скорлупы и уменьшения объемов содержимого при охлаждении (это приводит к втягиванию жидкости с поверхности скорлупы вместе с присутствующими в ней микроорганизмами). Основной причиной порчи яиц являются флуоресцирующие Pseudomonas spp: они подвижны, продуцируют флуоресцирующий пигмент (пиовердин), конкурирующий с овотрансферрином за ионы металлов, необходимые для роста и размножения микроорганизмов, и стойки к действию других защитных механизмов яичного белка. Для этой разновидности микроорганизмов проникновение через внутреннюю подскорлуповую оболочку, по-видимому, зависит от действия ферментов, а не является результатом продвижения бактерии через систему перекрывающихся волокон. После проникновения через скорлупу микроорганизм приобретает относительную свободу и быстро размножается в содержимом яйца. К другим микроорганизмам, способным проникнуть через скорлупу яйца, относят виды, принадлежащие к родам Alcaligenes, Citrobacter, Flavobacterium и Proteus. После «пробития бреши» в защитных механизмах могут расти и микроорганизмы других видов и штаммов Acinetobacter, Alcaligenes, Enterobacter, Escherichia, Flavobacterium и Proteus. Признаки порчи зачастую имеют характерную окраску (см. табл. 9.1); порча под действием Ps. putida, не обладающих протеолитической активностью, обусловливает флуоресценцию белка в УФ-свете, тогда как Ps. fluorescens, продуцирующие фермент лецитиназу, обусловливают появление розовых пятен. Бактерии с сильной протеолитической активностью (например, Aeromonas, Alcaligenes, Escherichia и Proteus) разлагают яичный белок и вызывают почернение желтка. Некоторые микроорганизмы, в том числе и многие сальмонеллы, несмотря на их способность экстенсивно размножаться в соответствующих условиях, не дают в яйце видимых изменений.

Если сбор яиц на птицефабрике задерживается или при холодильном хранении слишком высока влажность, то может наблюдаться рост плесени. Обычно он бывает обусловлен размножением Cladosporium herbarum (в торговле такую плесень называют «усами»). Гифы плесневых грибов могут проникать сквозь скорлупу и распространяться по всему яйцу.

9.2.3. Мойка яиц

В странах ЕС яйца в скорлупе подразделяют на две категории – яйца категории А характеризуются нормальной чистой, неповрежденной скорлупой и кутикулой. В настоящее время им не требуются мытье или очистка ни до, ни после сортировки, их нельзя охлаждать ниже 8 °Сили иным способом обрабатывать для увеличения срока годности. Яйца категории В не соответствуют указанным требованиям и могут использоваться только пищевой промышленностью или в непищевых целях (например, в производстве шампуней). Такие яйца перед использованием для снижения микробиологической нагрузки на поверхность можно мыть. В США почти все поступающие на реализацию яйца моют. Это характерно и для некоторых других стран, в том числе Австралии и Японии. По последним данным, введение мытья яиц категории А в настоящее время рассматривается и в ЕС.

Мытье яиц обычно производят в линии в три отдельных стадии:

• предварительная мойка или стадия замачивания с размягчением прилипших материалов;
• шприцевание или мойка щетками в питьевой воде с добавлением моющих средств для очистки и дезинфекции поверхности яиц;
• ополаскивание чистой водой для удаления остатков инородных тел, моющих средств и т. п.

Затем яйца сушат и иногда для увеличения срока годности смазывают растительным маслом и/или охлаждают. У яиц, поступающих на реализацию в скорлупе, степень контаминации поверхности микроорганизмами можно уменьшить на 1-6 лог. ед., снизив тем самым риск перекрестной контаминации других пищевых продуктов во время их кулинарной обработки. Недостатком мытья яиц является возможность повреждения скорлупы и кутикулы. Кроме того, бесконтрольный процесс мытья яиц может привести к контаминации содержимого яйца патогенными микроорганизмами, проникающими с грязной водой через физические защитные барьеры яйца. Еще в 1950-е гг. было показано, что вымытые в неоптимальных условиях яйца характеризуются более высокой степенью порчи. Главное здесь, чтобы яйца были вымыты как можно быстрее после кладки, причем температура воды должна быть не менее чем на 11 °С выше температуры яиц, в нее желательно внести соотвествующее моющее средство и дезинфектант, а значение рН необходимо поддерживать на уровне 10-11, что позволит избежать роста микроорганизмов в воде. Кроме того, чтобы избежать подавления защитного действия овотрансферина в яйце, содержание железа в воде не должно превышать 2 мг/л. В работе показано, что мытье яиц в контролируемых условиях улучшает их микробиологическое состояние, снижает содержание Salmonella на предварительно контаминированных яйцах на 5-6 лог. ед. и позволяет избежать обнаруживаемой контаминации ими содержимого яйца. Наиболее важным фактором здесь оказалась температура воды для мытья и ополаскивания яиц – при использовании воды с температурой ниже 34 °С наблюдалась контаминация содержимого яйца.

9.2.4. Пробоотбор

С середины 1980-х гг. в разных странах велись исследования относительно возможностей контаминации яиц в скорлупе сальмонеллами. Эти исследования были направлены на изучение участившихся заболеваний сальмонеллезом, характерного течения этого заболевания, на исследование яиц от зараженных куриц или (более обще) яиц, контаминированных в ходе производства. Полученные данные убедительно показали, что Salmonella entiridis могут присутствовать в содержимом чистых, сухих, неповрежденных яиц.

Методы отбора проб и микробиологического исследования яиц в скорлупе описаны в работе – судя по всему, именно они положены в основу методов, одобренных Британским Комитетом по медицинской микробиологии. С их помощью можно отличать контаминацию скорлупы от контаминации желтка и белка, независимо от того, исследуются ли они вместе или по отдельности. Кроме того, иногда полезно объединять яйца для исследования в партии по 6 и более штук несмотря на некоторое снижение чувствительности данного метода. При использовании любых методов рекомендуется, чтобы все сотрудники лаборатории при манипуляции с яйцом работали в одноразовых перчатках.

Метод 1, описанный ниже, не требует какой-либо дезинфекции скорлупы. Отбор проб яиц выполняется следующим образом.

• Яйцо разбивают над стерильным сосудом со 180 мл забуференной пептонной воды (BPW), и содержимое яйца сбрасывается в сосуд.
• Получившуюся в результате смесь гомогенизируют путем встряхивания и перед работами по обнаружению или селективному выделению Salmonella инкубируют при температуре 37 °С в течение 18 ± 2 ч.
• Скорлупу кладут в отдельную емкость со 180 мл BPWn инкубируют так же.
• При необходимости яичный белок можно перенести пипеткой в отдельный сосуд с BPW (масса BPWдолжна в девять раз превышать массу белка). Материал для предварительного обогащения перемешивают до образования однородной массы (1:9).

Культуру для предварительного обогащения пересевают в обогатительную среду и затем высевают на чашки или непосредственно сеют на чашки с селективным агаром (см. раздел 9.2.5).

Желток можно обрабатывать так же, но полное разделение компонентов яйца обеспечить довольно трудно, так как некоторое количество альбумина обычно прилипает к желтку и скорлупе.

Метод 2 подразумевает отбор пробы с поверхности скорлупы тампоном, после чего скорлупу дезинфицируют. После разбивания яйца скорлупу отбрасывают, так что этот метод менее чувствителен, чем метод 1, однако меньше и риск контаминации содержимого яйца от скорлупы.

• Скорлупу сначала протирают большим стерильным ватным тампоном, смоченным Затем тампон переносят в емкость со 180 мл BPW.
• Скорлупу снова протирают ватой, пропитанной 70%-ным техническим метилированным спиртом (или яйцо полностью погружают в него), после чего дают яйцу высохнуть. Можно также дезинфицировать поверхность скорлупы тампоном, пропитанным изопропиловым спиртом (метод, описанный в работе, включает погружение яйца на 10 мин в 70%-ный этанол, осушение и последующее фламбирование перед разбиванием скорлупы).
• Скорлупу разбивают, содержимое собирают и гомогенизируют, как описано выше для метода 1. Скорлупу отбрасывают.
• Суспензию смыва со скорлупы и гомогенизированное содержимое яйца инкубируют, как показано выше.
• При необходимости белок и желток можно исследовать отдельно (см. описание метода 1).

Модифицированный метод 2 для исследования 20 яиц единовременно описан в работе. Яйца протирают тампоном с ватной подушечкой, который затем помещают в емкость с В PW объемом 250 мл и инкубируют в течение 24 ч при температуре 41,5 °С. После дезинфекции и сушки содержимое всех 20 яиц добавляют к 100 мл BPW в большом мешочке для стомакера, гомогенизируют и инкубируют в течение 48 ч при температуре 41,5 °С.

9.2.5. Обнаружение и выделение Salmonella

Более подробно этот вопрос рассмотрен в главе 10. Яйца и яйцепродукты в принципе не отличаются от многих других пищевых продуктов, и для их анализа можно использовать разные методы. Культуральный метод, описанный в работе, подразумевает селективное обогащение из культур в BPW с использованием соевого пептонного бульона (по Раппапорту-Вассилиадису, RVS), инкубацию при температуре 41,5 ± 1 °С с последующим высеванием на чашки Петри с ксилозо-лизиновым дезоксихолатным агаром (КЛД-агаром) и второй средой (например, с модифицированным агаром с бриллиантовым зеленым или желчным агаром с маннитом, лизином и кристаллическим фиолетовым). Следует отметить, что здесь не применяется отдельная селективная ступень обогащения для содержимого яйца, и посев на чашки производится непосредственно из культур BPW, так как при анализе содержимого яйца не ожидается помех со стороны других микроорганизмов. Культуры скорлупы в RVS инкубируют в течение 20-24 ч, однако для куриц, инфицированных как естественным, так и искусственным путем, скорость выделения Salmonella из объединенных партий яиц значительно возрастает при продлении периода инкубации до 48 ч или добавлении в среду источника железа (это противодействует ингибирующему эффекту яичного белка). Это особенно полезно при исследовании отдельно яичного белка (альбумина).

При необходимости можно количественно определить содержание в яйце Salmonella с помощью культурального метода и техники кратных разведений для определения наиболее вероятного числа.

Попытки разработать адекватные методы для обнаружения и выделения Salmonella предпринимались неоднократно. В работе ученые использовали искусственно зараженные яйца в скорлупе и яичную массу без скорлупы, контаминированную естественным путем, для сравнения нескольких обогатительных сред и сред для посева на чашки в целях выделения Salmonella enteritidis. Сочетание предварительного обогащения в BPW с цистеином и селективного обогащения в тетратионатном бульоне дала лучшие результаты – шесть из семи селективных сред для посева на чашки, использованных в сочетании с системой обогащения, позволили обнаружить этот микроорганизм во всех исследуемых образцах. Испытывались также экспресс-методы. Например, в работе Salmonella enteritidis были эффективно выделены из контаминированных яиц в скорлупе с помощью тест-наборов Vidas Immuno-Concentration Salmonella (ICS) System, VITEK (фирма BioMerieux, Франция) и модифицированной полутвердой среды Раппапорта-Вассилиадиса. На практике предпочтение отдается последней благодаря ее низкой стоимости, простоте и меньшим трудозатратам, причем результаты доступны уже через 48 ч. К прочим экспресс-методам, изучавшимся применительно к анализу яиц в скорлупе, относятся ПЦР-метод обнаружения Salmonella enteritidis и использование бактериофага Lux⁺. Кроме того, в работе дана оценка двух различных тест-наборов – основанного на флуоресцирующей поляризации и на основе радиальной иммунодиффузии. Несмотря на то, что эти тест-наборы намного менее чувствительны, чем культуральные методы, с их помощью Salmonella enteritidis были надежно обнаружены при заражении массы из 10 яиц примерно 10 КОЕ целевого микроорганизма с последующей инкубацией при 25 °С в течение 72 ч.

9.3. ЯЙЦО БЕЗ СКОРЛУПЫ
9.3.1. Контаминация микроорганизмами

При коммерческом производстве жидкой яичной массы (из цельного яйца, белка или желтка по отдельности) обычно используют как нормальное неповрежденное яйцо, так и яйца неправильной формы и/или с насечкой (тонкими трещинками).В странах ЕС и США любые «яйца-тёк», в которых была нарушена целостность скорлупы и повреждены оболочки, запрещены для использования в составе любых пищевых продуктов, предназначенных для потребления человеком. Также запрещены к использованию яйца с заметными признаками порчи и яйца, «прозрачные после инкубации» (инкубированные яйца без зародыша). Инкубированные яйца считаются непригодными из-за риска роста микроорганизмов в ходе инкубации и, следовательно, контаминации всей яичной массы. Метод микробиологического исследования таких яиц описан в работе – в его основе лежит обнаружение 3-гидроксимасляной кислоты, образующейся при подавлении развития зародыша. В «прозрачном после инкубации яйце» иногда присутствуют более 10⁸ КОЕ бактерий/г (прежде всего, Staphylococcus или Micrococcus spp, а также представители семейства Enterobacteriaceae) без видимых проявлений порчи.

При производстве яичной массы вымытые и прошедшие визуальный контроль яйца перерабатываются на технологической линии с использованием автоматического оборудования, способного за одну рабочую смену освобождать от скорлупы много тысяч яиц и при необходимости отделять желтки от белка. В ходе последующей гомогенизации яичной массы контаминирующие ее микроорганизмы распределяются по всей партии более равномерно. На степень контаминации влияет целый ряд факторов, в том числе и состояние используемых яиц. Их нативная микробиота представляет собой совокупность различных микроорганизмов, поступающих главным образом с поверхности скорлупы, но в ее составе могут оказаться и микроорганизмы-контаминанты содержимого яйца, а также занесенные с технологического оборудования, из окружающей среды и с рук персонала. В странах ЕС запрещен технологический процесс выработки яичной массы для потребления человеком методом дробления яиц в скорлупе с последующим удалением последней центрифугированием, поскольку при такой технологии наблюдается сильная контаминация получаемого «меланжа».

9.3.2. Влияние пастеризации

Перед пастеризацией вероятная численность микроорганизмов (на 1 г яичной массы) составляет :

аэробных                                         – 10³-10⁶;

колиформных бактерий              – 10²-10⁵;

дрожжей и плесеней                    – менее 10;

сальмонелл                                    – менее 1.

Несмотря на низкий уровень обсеменения сальмонеллами, в целях минимизации рисков для здоровья потребителя пастеризация необходима даже несмотря на то, что по данным, приведенным в работе, желток с внесенными 10% соли не требует пастеризации, если он используется в майонезах или салатных заправках и дрессингах со значением рН не выше 4,1. Для большинства пищевых продуктов режим тепловой обработки, необходимый для уничтожения Salmonella, близок к тому, который оказывает негативное воздействие на физические и функциональные свойства пищевого сырья. В разных странах применяют разные режимы термообработки, но все они рассчитаны на снижение степени контаминации сальмонеллами в 1000-10 000 раз так, чтобы численность данного микроорганизма была ниже нормального порога его обнаружения (не более 1 КОЕ/кг продукта). В США, например, яичную массу из цельного яйца выдерживают при температуре 60 °С в течение 210 с, а в Австралии - 150 с при 62 °С.

Все пастеризованные яйцепродукты (включая жидкую яичную массу, замороженный и сухой меланж) при использовании установленных процедур отбора проб и утвержденных методов анализа должны удовлетворять следующим предельно допустимым значениям по содержанию микроорганизмов:

аэробные микроогранизмы (на чашках)                       не более 25 000/г;

колиформные бактерии                                                     не более 10/г;

дрожжей и плесеней                                                           менее 10/г;

сальмонеллы                                                                        отсутствуют.

К возможным причинам невозможности уложиться в эти предельно допустимые значения относят слишком высокую контаминацию исходного материала, выбор неверного режима пастеризации или повторную контаминацию уже пастеризованного продукта. Важным фактором может оказаться и нарушение температурного режима при хранении жидкой яичной массы или замороженного меланжа.

Согласно нормативным актам ЕС необходимо применять планы отбора проб и проводить микробиологическое исследование на наличие представителей семейства Entembacteriaceae в соответствии со стандартом ISO 21528-2 (использование фиолетово-красного глюкозо-желчного агара при глубинном посеве; инкубация при 37 °С; n = 5, с = 2, m = 10 КОЕ/г или мл, М = 100 КОЕ/г или мл). Этот критерий оценивается в конце технологического процесса – в случае неудовлетворительных показателей необходимо провести анализ эффективности тепловой обработки и возможности повторной контаминации. Помимо этого требуется соответствие всех яйцепродуктов (за исключением тех, для которых риск обсеменения сальмонеллами исключен) требованиям относительно отсутствия Salmonella. По плану отбора проб в данном случае n - 5, а с - 0, причем в 25 г пробы этот микроорганизм должен отсутствовать (при исследовании по методу EN/ISO 6579 ). Этот показатель применяется к продуктам, реализуемым до истечения срока годности. Тот же критерий используется и для готовых к употреблению пищевых продуктов, содержащих сырое яйцо (за исключением тех, состав которых или режим переработки исключают риск обсеменения сальмонеллами).

9.3.3. Срок годности и порча пастеризованных яйцепродуктов

Яйцепродукты относятся к группе скоропортящихся товаров (даже после пастеризации и при холодильном хранении). Срок их годности зависит от степени обсеменения исходных яиц микроорганизмами и условий переработки и упаковки продукта. Если пастеризованные яйцепродукты из чистых яиц, хранящихся в условиях охлаждения, пригодны в пищу в течение примерно трех недель, то применение ультрапастеризации в сочетании с асептической упаковкой продлевает срок их годности (в условиях хранения при температуре 4 °С) до 3-6 месяцев. В случае порчи запах тухлых яиц обычно более интенсивен у яйцепродуктов на основе желтка и цельных яиц, чем у белковых яйцепродуктов. В ходе пастеризации гибнут большинство грамотрицательных бактерий, способных размножаться в сыром яйце, а выживать могут главным образом более термостойкие грамположительные виды Bacillus, Enterococcus, Micrococcus и Staphylococcus. Основными микроорганизмами, выживающими в цельном яйце в ходе термообработке в течение 3 мин при 65 °С, являются Microbacterium lacticum и Bacillus spp., которые начинают активно размножаться при температурах соответственно 10 и 15 °С. Для пастеризованного яичного белка в работе показано, что среди выживших микроорганизмов выделяются в основном «фекальные стрептококки» (энтерококки), М. lacticum, штаммы, подобные Aerococcus viridans, и две группы «атипичных лактобацилл», идентифицированных согласно работе. Все эти микроорганизмы были выделены на агаре с сердечной вытяжкой (методы анализа см. в работе). Здесь следует отметить, что таксономические наименования этих и других бактерий порчи яйцепродуктов в старой и более современной микробиологической литературе могут существенно отличаться, поскольку их отнесение к тому или иному роду или виду микроорганизмов в разные годы проводилась по разным схемам классификации.

9.3.4. Контаминация яйцепродуктов патогенными микроорганизмами,
отличными от Salmonella

Несмотря на некоторые свидетельства о том, что через скорлупу в яйцо может проникать Campylobacter jejuni, это, по-видимому, явление все же редкое, а продолжительность присутствия этого микроорганизма на яичной скорлупе и в яичном белке очень невелика. Даже если С. jejuni присутствует на поверхности яйца, он обладает небольшой способностью проникновения через подскорлуповую оболочку и контаминации содержимого яйца. В ходе анализа яйцепродуктов С. jejuni не были обнаружены ни в пастеризованной яичной массе из цельного яйца, ни в желтке и белке, ни во взболтанной яичной смеси для омлета, ни в цельном яйце без скорлупы и в омлете с сыром. Из этого можно сделать вывод, что вероятность кампилобактериоза из-за обсеменения яйцепродуктов маловероятна – была зарегистрирована лишь одна вспышка этого заболевания вследствие употребления сырых яиц.

Большее беспокойство могут вызывать психротрофные Listeria monocytogenes и Yersinia enterocolitica. L. monocytogenes – это типичный контаминант сырых яйцепродуктов, который может размножаться при температуре 5 °С и выше как в сыром, так и в пастеризованном меланже из цельного яйца и в желтках. Выделение и количественное определение этих микроорганизмов описано в главе 10. Неспособность листерий выживать в сыром яичном альбумине в течение длительного времени относят на счет присутствия в нем лизоцима. Считается, что L. monocytogenes в некоторых яйцепродуктах потенциально опасны, так как они относительнотермостойки по сравнению с вегетативными клетками других патогенных микроорганизмов и если их численность относительно высока, то они могут выживать в условиях мягкой пастеризации. Тем не менее Listeria spp. не были обнаружены в 500 пробах яйцепродуктов после пастеризации, и вплоть до настоящего времени ни одного случая листериоза не было связано с яйцепродуктами.

Штаммы Y. enterocolitica типичны для домашней птицы и продуктах мяса птицы, причем они хорошо выживают в щелочных условиях, характерных для яичного белка. Этот микроорганизм обладает способностью проникать сквозь скорлупу цельного яйца, контаминируя его содержимое, однако его серотипы, характерные для птицы, обычно не патогенны для человека.

Еще одним важным патогенным микроорганизмом является золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus), который бессимптомно присутствует у многих людей и может выделяться с яичной скорлупы. Он хорошо растет и размножается в яичной массе из цельного яйца, но не может размножаться в условиях охлаждения. Staphylococcus aureus потенциально опасен в соленых желтках, так как обладает повышенной стойкостью к низкому значению активности воды (0,9), но для цродуцирования количества энтеротоксина, способного привести к пищевому отравлению, его численность должна составить не менее 10⁵ КОЕ/мл. Такой рост численности может быть связан с существенным нарушением температурного режима хранения данного продукта. В странах ЕС недавно был отменен нормативный акт, устанавливавший предельно допустимые значения для Staph, aureus (отсутствие этой бактерии в 1 г пробы при исследовании методом счета колоний согласно ISO 6888). Требуемой для выделения средой являлся агар Бэйд-Паркера с подтверждением наличия колоний при исследовании на коагулазу и ДНК-азу. В работе сообщается, что при исследовании яйцепродуктов с использованием агара Бэйд-Паркера было получено всего 9% ложноположительных и 16% ложноотрицательных результатов, чему способствовало, по-видимому, присутствие атипичных колоний.

Иногда в жидких яйцепродуктах обнаруживают Bacillus cereus, особенно в летний период, но о каких-либо случаях пищевых отравлений такими яйцепродуктами не сообщалось (для проявлений симптомов заболевания необходима численность В. cereus свыше 10⁶ КОЕ/г). Тем не менее споры этих и других представителей рода Bacillus могут сохранять жизнеспособность при пастеризации и обнаруживаться в пастеризованных яйцепродуктах.

В настоящее время верхние предельно допустимые микробиологические показатели в Великобритании для пастеризованных жидких яйцепродуктов составляют: Enterobacteriaceae – 10 или 100 КОЕ/г; Е. coli – 10 КОЕ/г; В. cereus 100 или 200 КОЕ/г; Staph, aureus – 20 КОЕ/г. Listeria spp. должны отсутствовать в 25 г пробы, a Salmonella spp. – в двух пробах по 25 г каждая.

9.3.5. Отбор проб яйцепродуктов

Описываемые ниже способы пробоотбора основаны на методах, описанных в работах и. Для жидких яйцепродуктов важно, чтобы отбираемый материал был тщательно перемешан в целях равномерного распределения любых контаминантов.

Пробы перед исследованием следует хранить при температурах ниже 4 °С не более 4 ч, причем сырые и пастеризованные продукты всегда следует исследовать по отдельности, избегая тем самым их возможной перекрестной контаминации.

• Сырые яйца без скорлупы. Непастеризованный материал отбирают из уравнительного резервуара для сырого яйца. При наличии пробоотборного крана перед отбором пробы в стерильный контейнер необходимо в течение короткого времени слить некоторое количество материала – в противном случае необходимо специальное стерильное приспособление-пробоотборник. Пробы отбираются массой не менее 25 г.
• Пастеризованное жидкое яйцо. Пробы отбирают так же, как описано выше, из сборного резервуара, расположенного как можно ближе к пастеризатору. В каждом резервуаре, из которого берутся пробы, должна измеряться температура (на случай нарушения температурного режима).
• Замороженный меланж. Отбирают такое количество банок с меланжем, которое репрезентативно для анализируемой партии. Каждую банку асептически вскрывают, а возможный на поверхности замороженного меланжа иней удаляют стерильной ложкой. Затем пробы берут из центра замороженной массы с помощью электробура. Отбирают не менее 25 г полученной стружки, причем этот материал до проведения исследования следует хранить в замороженном состоянии. Оттаивание проводят при температуре 0-4 °С или путем выдержки при комнатной температуре в течение 2-3 ч.
• Сушеный меланж (яичный порошок). Репрезентативное количество упаковок осторожно вскрывают и пробы асептически отбирают стерильной ложкой. Собранный материал тщательно перемешивают и переносят 25 г в стерильный контейнер. В ходе постепенного добавления буферизованной пептонной воды (BPW) смесь перемешивают стерильным шпателем, получая однородную суспензию. Прежде чем переходить к собственно исследованию, для облегчения регидратации разрешается оставить ее на 60 мин при комнатной температуре.

9.3.6. Исследование на Salmonella

В рамках ЕС согласно Постановлению № 2073 требуется проведение микробиологического анализа по стандарту ISO 6579, то есть по стандартному для других пищевых продуктов методу. Средами для предварительного обогащения и обогащения проб являются, соответственно, BPW, RVS и тетратионатный бульон Мюллера-Кауфмана с новобиоцином. Обогатительные культуры высевают на чашки с XLD-агаром и на другую среду. Типичные колонии затем подтверждаются биохимическими и серологическими анализами. При исследовании яичного белка (и, возможно, других яйцепродуктов) более эффективное выявление сальмонеллы достигается дополнительным использованием среды для предварительного обогащения и/или обогащения с ферриоксамином Е, противодействующим образованию хелатных комплексов белка с железом.

Для обнаружения и/или выделения из яйцепродуктов сальмонелл, как и при исследовании яиц в скорлупе, применяют и другие методы, включая ускоренные (см. раздел 9.2.4 и главу 10). Например, в ходе исследования с участием 17 лабораторий было проведено сравнение автоматизированного кондуктометрического метода обнаружения сальмонелл со стандартным культуральным методом. В числе исследовавшихся продуктов была и яичная масса из цельного яйца, причем существенной разницы между результатами обеих методов (1-5 или 10-50 КОЕ/25 г соответственно) при использовании разных серотипов и разных количеств посевного материала выявлено не было.

9.4. НЕКОТОРЫЕ ТЕНДЕНЦИИ

Наиболее важным пищевым патогеном, ассоциируемым с яйцом в скорлупе и сырыми яйцепродуктами, является и будет оставаться Salmonella. До вспышек пищевых отравлений, вызванных Salmonella enteritidis во второй половине 1980-х гг., яйцо в скорлупе считались относительно безопасным пищевым продуктом – его можно было есть сырым или недоваренным всем людям, даже относящимся к группам риска. С появлением SE-инфекций, вызванных потреблением яиц, ситуация изменилась, и риск сальмонеллеза в этом случае стал очевидным. В результате появилась необходимость развивать национальные программы по контролю яиц в скорлупе и исследовать на Salmonella многие тысячи яиц (из-за низкой степени их контаминации). Поскольку торговля яйцом приобрела международный характер, появилась необходимость в координации контроля яиц между уполномоченными органами отдельных стран. Не удивительно, что эпидемиологическая картина постоянно меняется. Помимо того, что штаммы Salmonella enteritidis, вызывающие пищевые отравления, в разных странах разные, в той или иной стране они могут также изменяться со временем. Например, преобладающим типом штаммов в Европе был фаготип (ФТ) 4, а в США –ФТ 8 и 13. Не так давно в Великобритании было зафиксировано увеличение случаев пищевых отравлений при участии ФТ 14b – с менее чем 200 лабораторно подтвержденных случаев заболеваний в год в период до 2001 г. до 922 случаев в 2003 г. Данный микроорганизм был выделен также со скорлупы яиц, импортированных из Испании. Указанные изменения не ограничены SE – они характерны и для других серотипов, включая S. heidelberg, S typhimurium и S. typhimurium var. Copenhagen, которые характерны для птицы и, как было показано, могут присутствовать в репродуктивном тракте инфицированных кур. Любой из этих штаммов, как и «новые» штаммы SE, могут непосредственно контаминировать содержимое яйца. Кроме того, прогнозируемые изменения в международной торговле яйцепродуктами могут привести к появлению новых проблем с сальмонеллами.

В этом контексте значение микробиологических исследований состоит в том, что они позволяют установить причину контаминации импортного яйца и выделить те партии, которые подлежат пастеризации, а не реализации в розничной торговле. В связи с понятным стремлением ускорить решение относительно разрешения на реализацию яиц, не обсемененных сальмонеллами, будет расти интерес к ускоренным методам (экспресс-методам) обнаружения Salmonella, особенно без предварительного обогащения проб.

Что касается сырых яйцепродуктов, важным средством минимизации рисков является пастеризация, эффективность которой в некотором смысле обусловлена эффективностью санитарного контроля на протяжении всей логистической цепи. Это связано с тем, что существует неизбежный компромисс между тепловой обработкой, необходимой для обеспечения безопасности продукта, и неблагоприятным воздействием нагревания на функциональные свойства продукта. С учетом этого в будущем будут продолжены поиски путей оптимизации тепловой обработки и снижения ее последствий на свойства продукта. Особенно уязвим в этом отношении яичный белок. Так, в работе было проведено сравнение двух режимов нагрева для яичного альбумина распылительной сушки и показано, что ни один из исследованных режимов не может быть признан удовлетворительным относительно сохранения функциональных свойств альбумина. Возможно, эту проблему удастся решить с помощью новых технологий обработки, в том числе ультразвуковой и методом импульсного электронного поля. Более эффективная обработка сырых яйцепродуктов поможет снизить риски, связанные не только с Salmonella, но и с Listeria, а также с другими присутствующими в них патогенными микроорганизмами.