12.1. ВВЕДЕНИЕ

Микробиологические методы применяются:

• в государственной инспекции пищевого сырья и продуктов, обеспечивая соблюдение нормативных требований;
• в международной торговле, обеспечивая соответствие продукции принятым микробиологическим стандартам;
• в коммерческих взаимоотношениях партнеров, гарантируя соблюдение установленных микробиологических нормативов;
• в пищевой промышленности, обеспечивая контроль качества и технологический контроль;
• в научно-исследовательских лабораториях в исследовательских целях;
• в референтных лабораториях для подтверждения результатов, полученных в других лабораториях, и обеспечения контрольно-регламентирующих функций.

Результаты микробиологических анализов должны быть достоверными и, следовательно, для каждого аналитического метода необходимо знать его возможности. Кроме того, важно, чтобы все заинтересованные стороны были согласны с применением данных методов. Взаимное признание методов анализов и испытаний, используемых в международной торговле, во многом ей способствует.

Стандартизированные методы анализа разрабатываются различными международными и национальными организациями, а также торговыми ассоциациями – ISO (Международная организация по стандартизации), AOACI (Международная ассоциация химиков-аналитиков), CEN (Европейская комиссия по стандартизации), NMKL (Комитет северных стран по анализу пищевых продуктов), AFNOR (Французская ассоциация по стандартизации), NNI (Нидерландский институт стандартов), DIN (Немецкий институт стандартов), IDF (Международная федерация молочной промышленности) и др.

Эти стандартизированные методы обнаружения и количественного определения микроорганизмов, контаминирующих пищевые продукты, обычно включают традиционные методы выделения. Основная цель состоит в том, чтобы предоставить пользователю надежный, признанный международным сообществом метод получения одинаковых результатов в разных лабораториях независимо от поставщиков материалов и оборудования.

По существу такие методы являются своего рода методическими рекомендациями по проведению анализа, хотя исторически во многих странах они являются рекомендованными или утвержденными на государственном уровне и признаются как официальные методы обнаружения и количественного определения микроорганизмов в пищевых продуктах. Таким образом, эти методы можно считать своего рода эталонными (референтными).

В 1990-е гг. в результате инноваций в иммунологии, биотехнологиях и приборном оснащении появились альтернативные методы обнаружения и/или количественного определения микроорганизмов в пищевых продуктах. Эти альтернативные методы зачастую более быстры и удобны для пользователя и могут быть автоматизированы. Они представляют большой интерес для пищевой промышленности и для испытательных лабораторий, и в последнее время наблюдается тенденция к вытеснению ими классических референтных методов. Перед использованием любого альтернативного метода заинтересованными сторонами его соответствие поставленной цели должно быть продемонстрировано независимым органом. На практике валидизация необходима для демонстрации того факта, что новый метод обладает приемлемыми характеристиками.

Растущая потребность в валидизированных (аттестованных) методах, кроме того, обусловлена наличием концепции «официальной» лаборатории, которая должна быть аккредитована в соответствии с требованиями EN/ISO/IEC17025 и, таким образом, вынуждена использовать либо стандартизованные методы, либо валидизированные альтернативные методы, либо (если применяется какая-либо модификация стандартного метода или собственный альтернативный метод), должна провести надлежащую валидизацию. Очевидно, что стандартизованные и валидизированные методы могут давать достоверные результаты только в том случае, если они применяются в микробиологической лаборатории пищевого предприятия в рамках концепции обеспечения общего качества продукции.

В начале этой главы мы рассмотрим определения некоторых характеристик методов, которые обычно определяют в ходе валидизации. Затем мы рассмотрим общее понятие протоколов валидизации, используемых в настоящее время или предлагаемых AOACI, а также процедуру валидизации согласно EN/ISO 16140, которая положена в основу Micro Val-сертификации тест-наборов, официально признанной в ЕС. Там же мы остановимся на ряде вопросов, важных для разработки эффективной схемы валидизации. В третьей части мы познакомимся с некоторыми примерами валидизации новых методов, после чего подчеркнем важность приверженности сотрудников микробиологических лабораторий принципам обеспечения качества – это позволит обеспечить проведение микробиологических анализов в контролируемых условиях, включая применение надлежащим образом валидизированных методов. Завершается эта глава обзором некоторых тенденций.

12.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК МЕТОДОВ

Валидизация – это демонстрация того, что характеристики данного метода сравнимы с характеристиками соответствующего стандартного метода и что испытываемым методом можно обнаруживать или количественно определять конкретный микроорганизм или группу микроорганизмов. Валидизация должна обеспечивать выполнение хотя бы одного из нижеперечисленных пунктов:

• определение характеристик исследуемого метода с помощью справочных материалов (см. ниже) или (в случае их отсутствия) с помощью чистых культур с хорошо известными свойствами или соответствующих тест-штаммов;
• сравнительное исследование соответствующих методов;
• межлабораторное исследование рассматриваемого метода;
• исследование для определения роли конкретных переменных параметров, например периода инкубации или пищевого матрикса.

В ходе валидизации обычно определяют все или некоторые из описанных ниже параметров.

12.2.1. «Правильность» (ошибка измерения)
количественных методов

Правильность – это точность совпадения между истинным значением или (если оно не известно) принятым референтным значением и средним результатом, полученным после многократного применения данного метода (= «систематическая ошибка»).

Правильность определяют путем анализа сертифицированных референтных материалов (CRM), полученных от сертифицирующей организации, – например, от европейского бюро стандартов (BCR) Еврокомиссии (ЕК). Производство референтных материалов основано на распылительной сушке суспендированных в молоке бактерий. Получающийся в результате материал затем смешивают со стерильным сухим молоком и перед инкапсулированием его в желатин обрабатывают для получения стабильной и однородной смеси. После анализа в различных международно признанных лабораториях референтные материалы получают сертификат BCR. Затем выпускаются таблицы с указанием 95%-ного доверительного интервала для проверки определенного числа капсул на практике. Для микробиологических целей доступно ограниченное число CRM. Применительно ко многим (но не всем) микроорганизмам имеются несертифицированные референтные материалы с известными характеристиками, разработанными другими организациями. К организациям, участвующим в распространении референтных материалов, относятся: Ccala.it (Франция); рабочая группа ведомства по безопасности пищевых продуктов СНЕК (VWA, Нидерланды); LED Techno (г. Цольдер, Бельгия), дистрибьютор системы Senate^гм (г. Бери, Великобритания); BioTRADING и т.д.

Если нет возможности получить стабильный референтный материал, то в качестве альтернативы для исследований по выделению можно использовать материалы, обогащенные внесением инокулята микроорганизмов (при условии, что концентрация инокулята, используемого для обогащения, независимо определяется стандартизированными методами и дополнительным тестированием). Суррогатные «известные значения» могут быть получены путем многократных повторных измерений на естественно-контаминированных образцах с помощью референтного метода, независящего от метода, подлежащего валидизации. При таких условиях, однако, «истинное значение» точно не устанавливается, и правильность может быть определена лишь приблизительно путем исследования проб одного и того же образца как с помощью референтного метода, так и метода, подлежащего валидизации. Оценить работу лаборатории относительно характеристики «правильности» помогает также ее участие в программах проверки качества проведения аналитических работ (профессионального тестирования).

12.2.2. «Прецизионность» (количественных методов)

Прецизионность – это близость между собой независимых результатов анализа одного и того же образца по определенной аналитической процедуре при заданных условиях (= «случайная ошибка»). Обычно ее выражают как погрешность результатов измерений и рассчитывают как стандартное отклонение от среднего результата испытаний. Низкая прецизионность соответствует относительно большому стандартному отклонению.

Проверки на прецизионность применительно к традиционно используемым методам выполняют для того, чтобы убедиться, что получаемые результаты с течением времени не изменяются (из-за смены реактивов, оборудования, персонала и т.п.). Выделяют:

• «сходимость», характеризующую изменчивость в рамках данной лаборатории за короткий отрезок времени при работе одного лаборанта на одном и том же оборудовании и с одним и тем же материалом;
• «воспроизводимость», характеризующую изменчивость между разными лабораториями, анализирующими один и тот же образец одним и тем же методом; кроме того, понятие «внутренней» воспроизводимости применяют к изменчивости результатов, наблюдаемой при смене внутри лаборатории одного или нескольких факторов (продолжительности инкубации, реактивов, оборудования, лаборанта и т.п.).

12.2.3. «Точность» (качественных и количественных методов)

Точность – это степень близости результата анализа к истинному значению или (если оно не известно) принятому референтному значению. Точность – это качественное понятие, включающее сочетание случайных компонентов и общей систематической ошибки. Применительно к микробиологическим анализам иногда используют термин «относительная точность», которую определяют как степень соответствия между результатами анализа одних и тех же образцов референтным методом и альтернативным. Прилагательное «относительная» здесь означает, что применение референтного метод автоматически не обеспечивает получения принятого референтного значения.

12.2.4. «Предел обнаружения»
(качественных и количественных методов)

«Предел обнаружения» – это наименьшее количество поддающихся культивированию микроорганизмов, которые могут быть достоверно обнаружены в некотором образце. Для качественных методов это понятие можно определить как наименьшее число поддающихся культивированию микроорганизмов, обнаруживаемых в 50% случаев и референтным, и альтернативным методами. Что касается количественных методов, то предел обнаружения находится выше критического уровня, причем последний представляет собой минимальную концентрацию поддающихся культивированию микроорганизмов, достоверно определяемых количественно. Например, это может быть среднее от результатов, полученных на холостом образце (не содержащем целевых микроорганизмов) плюс трехкратное стандартное отклонение холостого образца; определяют его путем анализа довольно большого числа холостых образцов. С помощью таких образцов учитывают любое влияние на результат анализа пищевого матрикса и/или конкурирующей микробиоты.

12.2.5. «Линейность» (количественных методов)

При использовании заданного матрикса «линейность» характеризует способность данного метода давать результат, пропорциональный количеству присутствующего в образце определяемого материала (аналита). Таким образом, увеличение количества определяемого материала соответствует линейному или пропорциональному увеличению результата.

12.2.6. «Чувствительность» и «специфичность»
(качественных методов)

Чувствительность и специфичность связаны со способностью данного метода специфически реагировать на указанный целевой микроорганизм или группу микроорганизмов, и сравниваются с числом ложноположительных и ложноотрицательных результатов, получаемых с помощью валидизированных методов. Для понятий «чувствительности» и «специфичности» предложены различные определения, в том числе и приведенные ниже.

Чувствительность некоторого метода определяется долей целевых микроорганизмов, которые могут быть обнаружены в известной популяции; ее можно вычислить по следующему уравнению:

Невозможность определить целевые микроорганизмы в случае их наличия является ложно-отрицательным результатом и снижает чувствительность анализа. В пищевой микробиологии из-за требований пищевой безопасности допустимы только очень низкая частота встречаемости ложноотрицательных результатов.

Специфичность некоторого метода определяется возможностью с его помощью отличать целевые микроорганизмы от других; она рассчитывается по формуле:

Положительный результат при отсутствии целевых микроорганизмов представляет собой ложноположительный результат и снижает специфичность метода. Для ускоренных скрининг-методов относительно высокая частота встречаемости ложноположительных результатов допустима, так как все предположительно положительные результаты подвергаются последующим подтверждающим анализам.

Помимо рассмотренных выше «чувствительности» и «специфичности» могут также определяться «инклюзивность» и «эксклюзивность» качественных методов. «Инклюзивность» – это способность валидизированного метода обнаруживать широкий диапазон штаммов целевого микроорганизма (ов), а «эксклюзивность» – это тот предел, при котором валидизированный метод уже не обнаруживает соответствующий диапазон штаммов нецелевого микроорганизма.

12.2.7. «Устойчивость» или «жесткость»
(качественных и количественных методов)

Понятия «устойчивость» и «жесткость» используют для описания чувствительности данного метода к небольшим изменениям окружающих условий или методики анализа, например, продолжительности и температуры инкубации, фирмы-поставщика расходных материалов (ингредиентов), чистоты и срока годности реактивов.

12.2.8. «Практичность»

В оценке нового метода могут учитываться и другие немаловажные факторы, которые обычно называют «практичностью» того или иного метода :

• любые риски относительно техники безопасности при проведении анализа;
• степень быстроты и простоты выполнения анализа, возможность автоматизации и возможное количество обрабатываемых проб;
• потребность в дополнительном обучении лаборанта-микробиолога;
• доступность данной тест-системы и репутация ее фирмы-производителя (наличие системы контроля качества на производстве, оказание сервисных услуг и т. д.).

12.2.9. Характеристики исследуемого метода
и стандартизованные процедуры

В процессе валидизации определение характеристик того или иного метода будет способствовать его одобрению международными, национальными и региональными контрольно-регламентирующими органами и торговыми партнерами. Стандартизованные методы, опубликованные соответствующими организациями по стандартизации или торговыми организациями, считаются валидизированными. В таких случаях лаборатория должна продемонстрировать, что указанные в стандарте критерии валидизации достигаются на практике. Вместе с тем такие методы совсем не обязательно прошли валидизацию. В отличие от методов IDF и AOACI, прошедших перед их принятием процесс валидизации, ряд методов ISO только недавно были подвергнуты валидизации, требуемой Европейской комиссией в рамках Четвертой рамочной программы по стандартам, измерениям и испытаниям проекта SMT4-CT96-2098 (Standards, Measurement and Testing, Fourth Framework Programme). Были определены характеристики шести методов ISO, а именно для Bacillus cereus (количественное определение), Listeria monocytogenes (обнаружение и количественное определение), Staphylococcus aureus (количественное определение), Clostridium perfringens (количественное определение) и Salmonella (обнаружение), которые в начале 2000-х гг. были опубликованы в виде поправок к соответствующим методам ISO – см.

Прецизионность, включая пределы сходимости (r) и воспроизводимости (R), определяли на базе межлабораторных анализов трех типов пищевых продуктов – контаминированных в разной степени говяжьего фарша, свежего сыры и сушеного картофеля, а также референтных материалов. Значения, полученные в результате этих межлабораторных испытаний, не могут применяться к никаким другим бактериальным концентрациям и пищевым матриксам, кроме исследовавшихся. Обычное значение предела сходимости (r) для В. cereus при тестировании пищевых образцов составляет r – 2,0. Это означает, что если в первом тесте был получен результат 10 000 клеток В. cereus на 1 г пищевого продукта, а затем тест был повторен, то соотношение между результатами первого и второго тестов не должно превышать 2,0. Таким образом, второй результат должен находиться в пределах от 5000 (10 000 : 2) до 20 000 (10 000 х 2) бактерий/г. Соответственно, обычное значение предела воспроизводимости (R) для В. cereus составляет R = 2,6. Это означает, что если в первой лаборатории был получен результат 10 000 клеток В. cereus/г, то соотношение соответствующих результатов из первой и второй лабораторий не должно превышать 2,6. Следовательно, результат, полученный во второй лаборатории, должен находиться в пределах от 3800 (10 000 : 2,6) и 26 000 (10 000 х 2,6) бактерий/г.

Для референтных материалов предельные значения сходимости и воспроизводимости ниже, так как в этом случае отсутствует влияние матрикса, то есть r = 1,3, a R = 1,7. Можно ожидать, что внутрилабораторный предел сходимости также будет ниже, чем при межлабораторных испытаниях, так как в этом случае задействовано меньше переменных. Несмотря на то что иногда всесторонних валидизационных исследований не проводится, исторически методы ISO всегда считались международно принятыми стандартными методами, поскольку они появились в результате открытых дискуссий между экспертами разных стран-участниц (рекомендованными национальными комитетами) в специализированных рабочих группах, включая группу ISO/TC34/SC9 по микробиологии.

Так как эти стандартизованные методы регулярно пересматриваются на предмет внесения в них поправок и инноваций в традиционных методах выделения, сам процесс пересмотра является очень трудоемким и требует времени, так что стандартизованные методы не всегда содержат самые последние разработки. Если в стандартизированном методе его пользователем производится какая-либо модификация (например, изменение продолжительности инкубации, уменьшение числа культуральных сред или подтверждающих тестов, и сокращается хранение в охлажденном состоянии культуральных сред перед чашечным подсчетом), должна быть выполнена ограниченная валидизация. Это необходимо для того, чтобы показать, что модификация метода не повлияла на результат, достигаемый данным методом анализа, и по-прежнему гарантирует получение достоверных результатов (по крайней мере, относительно данного пищевого матрикса). Например, относительно недавно было продемонстрировано, что полутвердая среда MSRV (модифицированная полутвердая среда Раппапорта-Вассилиадиса) может служить хорошей альтернативой селективному обогатительному бульону, используемому при выявлении подвижных штаммов Salmonella в фекалиях животных и в пробах мяса на бойнях, что было отражено в виде поправки к горизонтальному методу обнаружения Salmonella в стандарте EN/ISO 6579.

В 1990-е гг. появились много новых методов, которые или дают результат значительно быстрее, чем традиционные культуральные методы, и/или удобнее в использовании, так как их можно автоматизировать. Такие системы могут быть подготовлены «собственными силами» на предприятии или закуплены в виде тест-наборов. Если такой метод предназначен для регулярного применения в официальной испытательной лаборатории, которая занимается аккредитацией других лабораторий, то он в обязательном порядке должен пройти полную процедуру валидизации. Там же, где альтернативный метод предназначен для внутреннего использования и где не требуется соответствия внешним критериям гарантии качества (например, в автономных лабораториях), более предпочтительной может оказаться сокращенная процедура его валидизации. Таким образом, решать, насколько полным или сокращенным должен быть протокол валидизации и какое количество образцов, пищевых матриксов и повторностей необходимо использовать, должна сама лаборатория по согласованию с заказчиком или аудитором. В настоящее время в рабочей группе ISO TС34 SC9/CEN TC275 WG 6 признано, что стандарт EN/ISO 16140 ограничен лишь вопросами полной валидизации альтернативных методов официальными сертифицирующими организациями. Была признана необходимость в разработке адекватного, несложного и эффективного стандарта для сокращенной валидизации методов для «внутреннего использования». Кроме того, признана необходимость лабораторной верификации модифицированного горизонтального стандартного метода, применяемого для определенных типов пищевых продуктов. В настоящее время созданная в декабре 2005 г. рабочая группа ISO ТСЗ4 SC9 главное внимание уделяет разработке именно таких «усеченных» стандартов.

12.3. ПРОТОКОЛЫ ВАЛИДИЗАЦИИ

Для каждого предлагаемого метода должна быть разработана соответствующая процедура. Протоколы валидизации для качественных и количественных методов различаются, причем строгость набора критериев относительно характеристик того или иного метода зависит от способа его применения, – например, в качестве ускоренного скрининг-метода в рамках программы НАССР или в качестве метода анализа для определения источника пищевых отравлений. Критерии зависят и от области применения метода – например, от типа выявляемых микроорганизмов или группы пищевых продуктов.

В прошлом в разных стран применялись свои собственные схемы валидизации. Кроме того, некоторые международные организации по стандартизации типа AOACI, IDF, AFNOR, NMKL расширили свою деятельность и разработали протоколы валидизации для альтернативных методов. Все это препятствовало разработчикам новых систем, так как они для распространения своих тест-наборов были вынуждены в разных странах выполнять различные процедуры валидизации. Очевидно, что назрела необходимость в согласовании всех существующих схем валидизации.

В 2002 г. CEN был принят европейский стандарт «Протокол валидизации альтернативных методов», ставшим результатом работы по проекту MicroVal, стартовавшему в 1993 г. и направленному на разработку единой европейской процедуры валидации. Тем самым была достигнута первая поставленная цель, а именно был разработан принятый на международном уровне протокол валидизации альтернативных микробиологических методов. Благодаря «Венскому соглашению» CEN/ISO этот Европейский стандарт был принят в качестве стандарта ISO, а также было достигнуто соглашение с AOACI относительно двустороннего признания различных схем валидизации. Стандарт EN/ISO 16140 был подготовлен Техническим комитетом CEN/TC 275 «Горизонтальные методы пищевых продуктов» в сотрудничестве с Техническим комитетом ISO/ТС 34 «Пищевые продукты сельскохозяйственного происхождения», и в 2005 г. подлежал пересмотру. Кроме того, для независимой сертификации альтернативных методов, основанных на этом европейском стандарте, была учреждена специальная организация (вторая цель проекта MicroVal), и в настоящее время проводится экспериментальное валидизационное исследование. Предлагаемый для валидизации альтернативных методов стандарт описывает технические протоколы валидизации как каче-ственных, так и количественных методов, каждый из которых включает сличение методов и межлабораторное испытание. Разработаны особые рекомендации по разработке протокола испытаний, а также по методам расчетов и интерпретации получаемых данных согласно методам статистического анализа. Стандартизация схемы валидизации согласно проекту Micro Val представляет значительный прогресс в применении согласованных условий валидизации. Тем не менее в этом протоколе недостаточно ясно определены критерии приемлемости – так, результаты, полученные с помощью альтернативного метода, должны быть «сравнимыми» с результатами, полученными референтным методом. Реальные критерии зависят от типа метода и конкретных условий.

Организацией с большими традициями проведения валидизации лабораторных методов является AOACI. Сутью процесса валидации в рамках AOACI являются совместные испытания. При таких исследованиях опытные аналитики, работающие независимо друг от друга в разных лабораториях, используют соответствующий метод для анализа однородных образцов на наличие конкретного микроорганизма. Несмотря на то что для таких совместных исследований не существует никакого стандартного протокола, в результате разрабатываются различные рекомендации относительно минимального количества типов исследуемых пищевых продуктов и числа анализируемых проб для каждого типа продукта. Отвечает за протокол испытаний привлеченный эксперт, работающий под руководством главного эксперта с привлечением консультанта по статистике; такой привлеченный эксперт утверждается Комитетом по методам микробиологического анализа и определения примесей. Этот эксперт проводит исследования на «жесткость» данного метода и предварительное исследование по определению его применимости относительно обнаружения целевых микроорганизмов в разных пищевых матриксах и при различных условиях. Необходимо, чтобы этот специалист был экспертом по конкретному целевому микроорганизму, методам данного типа или по используемым пищевым матриксам (или и по тому, и по другому), а также являлся признанным авторитетом в данной области.

При разработке эффективной схемы валидизации необходимо учитывать ряд моментов.

12.3.1. Выбор референтного метода

В качестве референтного должен использоваться метод, принятый на международном уровне. Обычно выбирают метод, закрепленный в том или ином международном стандарте (метод ISO, AOACI или IDF); если же такового нет, то можно использовать некоторые методы, признанные на национальном уровне, или метод, официально не утвержденный, но описанный в уважаемом научном журнале и успешно применявшийся в течение нескольких лет в различных лабораториях. Важность выбора референтного метода обусловлена тем, что предполагается получение с его помощью «истинного» результата. Что касается качественных методов, то считается, что если его полученный результат положительный, а референтный метод дает отрицательный результат, то подлежащий валидизации альтернативный метод даетложноположительный результат. Это означает, что с помощью референтного метода все контаминнрованные образцы должны относиться к достоверно положительным. Например, при валидизации ускоренных методов обнаружения Salmonella в качестве референтного метода может быть выбран метод ISO, однако для определенных пищевых матриксов показано, что модифицированный метод ISO, при котором вместо селективного обогащения в бульоне используется полутвердая культуральная среда типа DIASALM (фирмы LabM) или MSRV (фирмы Oxoid), дает более высокое число подтвержденных образцов с подтвержденным наличием сальмонелл, чем оригинальный метод ISO. Следовательно, этот модифицированный метод ISO, как и исходный, может использоваться в сравнительных исследованиях в качестве референтного.

Тем не менее для некоторых с трудом культивируемых микроорганизмов, в частности для бактерий рода Campylobacter из проб окружающей среды или замороженных (соленых, ферментированных...) пищевых продуктов или для микроорганизмов, для которых нет адекватных культуральных методов (например, для не принадлежащих к серотипу О157 энтерогеморрагических Escherichia colt), бывает довольно трудно выбрать «референтный» метод. В таких случаях для обнаружения этих патогенов более надежным может оказаться какой-то альтернативный метод, в том числе ПЦР-метод или FISH (метод флуоресцентной гибридизации in situ). Эти альтернативные методы основаны на характеристиках, не являющихся фенотипическими, например, на ДНК или рРНК-анализе.

При выборе наиболее соответствующих для диагностических целей и сравнительных исследований методов рекомендуется проконсультироваться у экспертов из научно-исследовательских лабораторий и общими усилиями выработать правильное решение. В настоящее время рабочая группа экспертов CEN ТС215 WG 6 работает над стандартизацией ПЦР-анализа в целях обнаружения пищевых патогенов, в частности, продуцирующих веротоксин Е. coli. Кроме того, разработкой критериев стандартизации ПЦР-анализов и решением проблем, связанных с гармонизацией ПЦР-методов, занимаются в рамках исследовательского проекта ЕК FOOD-PCR. Например, для обнаружения термотолерантных представителей рода Campylobacter пищевого происхождения был разработан тест-набор на основе ПЦР и проведена как его аналитическая валидизация, так и валидизация в ходе совместных межлабораторных исследований.

12.3.2. Количество подлежащих анализу
проб и типов пищевых продуктов

На результаты, полученные экспериментальным, подвергаемым валидизации методом, неизбежно оказывает влияние тип исследуемого пищевого продукта. На поведении целевых микроорганизмов сказывается численность других микроорганизмов сопутствующей микробиоты и их биохимические свойства. Кроме того, свойственные данному типу пищевых продуктов значения рН и a_w, состав газовой среды при хранении и в упаковке, температура, нативные или внесенные в ходе переработки противомикробные препараты, а также вид и степень технологической переработкиданного пищевого продукта могут приводить к сублетальным повреждениям целевых микроорганизмов и снижать уровень их выделения исследуемым методом. Дополнительно осложнять анализ может и состав пищевых продуктов, так как в них могут присутствовать ингредиенты, влияющие на проведение анализа, – это можно наблюдать при использовании ПЦР-методов .

Количество типов пищевых продуктов в рамках исследования зависит от применимости конкретного метода. Если он должен пройти валидизацию для всех пищевых продуктов, то в валидизационное исследование обычно включают пять типов (категорий) пищевых продуктов в зависимости от их происхождения, – например, мясопродукты, продукты из мяса птицы, рыбо- и морепродукты, фрукты и овощи, молочные продукты, кондитерские и хлебобулочные изделия, а также ряд других, в частности майонез и салатные дрессинги, яйцепродукты, крупы и зерновые завтраки. Корма для животных, ветеринарные образцы и пробы окружающей среды считаются отдельной категорией. Кроме того, в рамках одной пищевой категории выделяют для выделения дополнительные типов продуктов в зависимости от способа переработки для увеличения срока годности – например, тепловой обработки, маринования или соления, ферментации и замораживания. Данные типы пищевых продуктов должны соответствовать целевым микроорганизмам, на обнаружение которых и направлен анализ. Так, валидизационные исследования метода для выявления В. cereus могут включать образцы риса, специй, сырых и термообработанных молочных продуктов, а также термообработанных продуктов на овощной основе, а такие же исследования, направленные на выявление Campylobacter, – сырые мясо птицы и крупного рогатого скота, морепродукты и свежее молоко. Если же планируется ограниченное применение исследуемого метода, то количество анализируемых типов пищевых продуктов может быть меньше. Примером может служить обнаружение Vibrio parahaemolyticus исключительно в рыбо- и морепродуктах. Таким образом, результатом любого успешного валидизационного исследования должно быть заключение о возможности применения данного метода анализа либо для всех пищевых продуктов, либо для отдельного их типа.

При валидизации какого-либо метода на его применимость к выявлению определенного микроорганизма во всех типах пищевых продуктов возникает вопрос, насколько эффективен этот метод для отдельных типов пищевых продуктов, в которых может встречаться данный микроорганизм. Конкретное исследование охватывает ограниченное количество типов пищевых продуктов. Если, например, некоторый валидизированный метод выявления Listeria monocytogenes дает достоверные результаты применительно к пяти видам пищевых продуктов, относящимся к пяти разным категориям, например, к расфасованной вареной ветчине в нарезке (мясной продукт после термообработки), мягкому сыру из сырого молока (сырой молочный продукт), копченому лососю (переработанный рыбопродукт), зеленому салату (сырой овощной продукт) и к макаронным изделиям («прочие продукты»), то может ли это гарантировать, что данный валидизированный метод будет надежно выявлять присутствие L. monocytogenes в сыром молоке, пастеризованном сыре, сыром мясе птицы, замороженной рыбе, гусином паштете («пате»), ферментированном мясе, пекарских дрожжах и т.п.? Этот вопрос до сихпор открыт и, следовательно, в отчете о валидизации должны быть ясно и точно указаны виды пищевых продуктов, на основе которых проводилось исследование. Несмотря на то что официальная валидизация метода является показателем того, что данный метод может работать хорошо, пользователь при его использовании применительно к особым типам пищевых матриксов в рамках внутреннего валидизационном исследования всегда должен доказать, что применяемый метод дает надежные результаты.

Что касается количества образцов для анализа при валидизационном исследовании, то и референтным, и валидизируемым методом должно быть проанализировано такое количество одинаковых проб, которое позволило бы получить достаточное количество данных для статистического анализа и правильной их интерпретации. Количество образцов для анализа, согласно протоколам MicroVal и AOACI, приведено в табл. 12.1. Следует отметить, однако, что эти данные предназначены для межлабораторной валидизации коммерческой тест-системы – при внутренней валидизации методов в лаборатории пищевого предприятия или санэпидстанции может использоваться разное количество проб, зависящее от особенностей данного метода и области его применения (см. об этом в конце настоящей главы).

Таблица 12.1.
Сравнение схем валидизации Micro Val и АОАС International

Рекомендуется, чтобы пищевые образцы, используемые для сравнительного исследования, брались из самых разных источников на всем протяжении логистической цепи, что позволит уменьшить систематическую ошибку из-за влияния местных факторов. В отношении качественных методов для одного и того же типа пищевых продуктов желательно иметь примерно одинаковую долю положительных и отрицательных ответов, хотя это не всегда осуществимо, особенно если на наличие патогенных микроорганизмов исследуются образцы, контаминированные естественным образом. В референтном и валидизируемом методах анализа должны исследоваться по возможности одинаковые образцы. Например, если у того и другого метода первые стадии одинаковы (например, используются тот же бульон для предварительного обогащения или исходное разведение), тогда суб-образцы могут отбираться после этой первой общей стадии. Эффективное сравнение методов обнаружения патогенных микроорганизмов зачастую требует исследования на границе пределов обнаружения, где различия между методами наиболее очевидны. В этом случае может оказаться невозможным обеспечить одинаковые парные образцы, о которых заранее известно, что содержание в них целевых микроорганизмов одно и то же.

12.3.3. Естественно и искусственно
контаминированные образцы пищевых продуктов

По возможности при любом сравнительном анализе микробиологических методов следует использовать естественно контаминированные образцы. Именно они отражают реальную ситуацию, когда целевые патогенные микроорганизмы присутствуют в них в меньшем количестве, чем большинство других бактерий, причем в неоптимальных (стрессовых) условиях (из-за свойств собственно пищевых продуктов и условий их технологической переработки и хранения). Естественно контаминированные пробы могут браться из продуктов, анализируемых данной лабораторией или другими организациями в плановом порядке. Хранение образцов должно быть сведено к минимуму, не допуская тем самым изменений в содержании целевых микроорганизмов и дополнительного стресса для них. Присутствие целевых микроорганизмов должно быть подтверждено референтным методом еще до проведения валидизационного исследования или параллельно последнему.

При невозможности получить достаточное количество естественно контаминированых пищевых продуктов каждой из категорий, необходимых для проведения валидизационного исследования, разрешается использовать искусственно контаминированные (обогащенные) образцы. Рекомендуется, тем не менее, чтобы таких образцов было не более 80%. При их использовании уровень инокуляции должен соответствовать ожидаемому в естественно контаминированных продуктах, причем микроорганизмы не следует подвергать чрезмерному стрессу. При необходимости должен иметься протокол приготовления сред с сублетально поврежденными микроорганизмами, соответствующими, например, хранению продуктов в состоянии охлаждения, стрессу в результате замораживания и действия кислот. Степень стресса должна выявляться при посеве на культуральную среду путем сравнением продолжительности лаг фазы и/или численности бактерий в нормальной культуре и в культуральной среде, находившейся в стрессовых условиях. Кроме того, сопутствующая микробиота в искусственно контаминированных образцах (численность, распределение и физиологическое состояние микрооранизмов) должна соответствовать естественной.

12.3.4. Происхождение, количество штаммов
и содержание микрооорганизмов в инокуляте

Для обогащения проб можно использовать референтные материалы, так как в них целевые микроорганизмы содержатся в стабильном, а не стрессовом состоянии, и точно определенном количестве. Тем не менее в этой форме доступны лишь небольшое количество штаммов или серотипов бактерий пищевого происхождения, так что такие референтные материалы имеют ограниченное применение. В целях обогащения предпочтительнее использовать штаммы, выделенные из одного и того же типа пищевых продуктов, чем клинические изоляты. Еслиэто не выполнимо, то следует использовать только полностью охарактеризованные штаммы [1, 23].

При отборе штаммов для исследования инклюзивное™ и эксклюзивности большая их часть должно происходить из типов пищевых продуктов, используемых для валидизационного исследования, и относиться к общепризнанным целевым микроорганизмам с учетом географического региона, инцидентности, разнообразия биохимических и физиологических признаков, а также серотипа, фаготипа и т. д. Если валидизируемый метод способен определять все виды микроорганизмов данного рода, то в исследовании должно участвовать несколько видов этого рода, а по возможности – все его виды, а также ряд типовых видов других родов внутри данного семейства. Если обнаружение проводится только до уровня видов, следует отобрать ряд штаммов этих видов из разных источников. Кроме того, желательно иметь типовые штаммы других видов того же рода. При анализе селективности исследуемого метода можно использовать различные нецелевые микроорганизмы, про которые известно, что они входят в состав фоновой микробиоты исследуемых типов пищевых продуктов.

Следует уделить внимание также содержанию микроорганизмов в инокуляте, особенно в случае исследования по принципу «да/нет». Это содержание должно быть таким же, что и уровень контаминации, с которыми обычно имеют дело при анализе пищевых продуктов. Исследования следует проводить с инокулятами, содержание микроорганизмов в которых близко к пределу обнаружения данного метода или к содержанию микроорганизмов, необходимому для обнаружения по критериям для целевого микроорганизма. Это обеспечивает применимость данного метода анализа для сравнительных исследований.

12.4. Схемы валидизации эффективности
альтернативных методов

Далее для иллюстрации вышеуказанных принципов мы рассмотрим некоторые примеры схем валидизации ускоренных методов микробиологического исследования. Так как производители пищевых продуктов и представители контрольно-регламентирующих органов нуждаются в быстрой и достоверной информации о присутствии в пищевых продуктах патогенных микроорганизмов, постоянно разрабатываются новые ускоренные, удобные для потребителя методы выявления пищевых патогенов, особенно Salmonella, L. monocytogenes и Е. coli О157 : Н7. Таким образом, в большинстве сравнительных исследований имеют дело с качественными методами обнаружения этих патогенных бактерий. Приводимые ниже примеры посвящены иммунологическим и молекулярным методам, так как они широко применяются в пищевых микробиологических лабораториях и сулят большие возможности. Эти примеры приводятся лишь в целях иллюстрации схем оценки или валидизации методов, и по ним не следует делать каких-либо выводов о фактических их характеристиках.

12.4.1. Иммунологические методы обнаружения пищевых патогенов

VIDAS® Listeria enzyme-linked immunofluorescent assay (US)

Аналитическая иммуноферментная система VIDAS® для листерий на базе иммунофлуоресценции ( VIDAS® Listeria) фирмы bioMerieux обеспечивает качественный флуоресцентный иммуноанализ с использованием иммобилизованных ферментов, который выполняется в автоматизированной тест-системе для обнаружения Listeria spp. Этот метод позволяет проводить быстрый скрининг пищевых продуктов и проб окружающей среды на присутствие Listeria spp. через 44-48 ч после проведения обогащения. Положительные результаты должны быть подтверждены стандартными культуральными методами.

Характеристики этой системы проверялись в рамках Программы АО АС по определению характеристик методов микробиологического анализа и были признаны соответствующими заявленным фирмой-производителем. Инклюзивность и эксклюзивность испытывались на 206 штаммах Listeria spp. и 50 штаммах бактерий, не принадлежащих к этому роду. В предварительном исследовании, предшествующем межлабораторным испытаниям и включавшем 980 образцов (с инокулятом, без инокулята и естественно контаминированные), представлявших 17 различных пищевых продуктов, было показано, что эта тест-система не хуже, если не лучше культуральных методов исследования тех же образцов (последние описаны в 8-м издании Bacteriological Analytical Manual). В набор испытываемых пищевых матриксов входили молочные продукты, морепродукты, овощи, мясное сырье и сырое мясо птицы, а также термообработанные мясные продукты и продукты из мяса птицы. Анализу подвергались также пробы с рабочих поверхностей оборудования.

Затем метод VIDAS® LIS и традиционный культуральный метод оценивались в рамках сравнительного исследования с участием 19 лабораторий. Исследовались шесть типов пищевых продуктов (мороженое, сыр, стручковая фасоль, рыба, ростбиф и фарш из мяса индейки). Мороженое, зеленую фасоль и сыр инокулировали разными сероварами L. monocytogenes, ростбиф – штаммом L. innocua, а рыбу – L. welshimeri. Образцы фарша из мяса индейки были естественно контаминированы бактериями рода Listeria. Продукты каждого типа были разделены на три части; две части были инокулированы (1-5 КОЕ/25 г при низком содержании бактерий в инокуляте и 10-50 КОЕ/25 г при высоком), а третья часть служила контролем (без инокулята, отрицательный контроль). Образцы сыра были стабилизированы путем их хранения при температуре 4 °С в течение 5 сут, а все остальные образцы – путем их хранения при температуре -20 °С в течение 5 сут. Каждая участвующая лаборатория получила набор из 15 образцов каждого пищевого продукта (по пять повторностей с разным содержанием микроорганизмов в инокуляте и отрицательный контроль). Из 1558 исследованных образцов 935 оказались положительными: 839 по методу VIDAS* и 809 – по стандартному культуральному методу. В целом ложноотрицательные результаты составили для системы VIDAS® LIS и культуральных методов соответственно 10,3 и 13,5%. Ложноположительные результаты для системы VIDAS® LIS составили 1,4% (9 положительных по методу VIDAS® LIS образцов, не получивших подтверждение выделением Listeria). Для всех исследованных образцов процент совпадения результатов между двумя методами составил 86%. Результаты, полученные с помощью тест-системы VIDAS® LIS для каждого типа пищевых продуктов и уровня обсеменения, оказались не хуже и даже лучше, чем результаты, полученные с помощью традиционного культурального метода. На этом основании тест-система VIDAS® LIS по обнаружению Listeria spp. была рекомендована к применению и одобрена Комитетом по микробиологическим методам анализа, материалам и примесям, после чего была признана Комиссией AOACI по официальным методам анализа.

Тест-система VIDAS® LIS также получила сертификат о валидизации AFNOR относительно ускоренного обнаружения Listeria spp. во всех пищевых продуктах. Инклюзивность и эксклюзивность в сертификате AFNOR названы «специфичностью», и эти свойства продемонстрированы на примере 217 штаммов Listeria (207 изолятов из пищевых продуктов и 10 штаммов – из коллекций культур L. monocytogenes) и 35 штаммов бактерий-нелистерий. Предел обнаружения, определяемый как количество клеток Listeria, необходимое для получения положительного ответа с помощью этой тест-системы, составил 10⁴-10⁵ КОЕ/мл и был получен с использованием четырех чистых штаммов Listeria. Данный предел обнаружения был определен по четырем разным типам пищевых продуктов (мясо, овощи, молочные и морепродукты); каждый продукт был искусственно обсеменен четырьмя штаммами Listeria до четырех разных уровней их содержания: 0,1-10, 2-20, 5-50 и 10-100 КОЕ/25 г. Между результатами, полученными с помощью этих двух методов, было установлено совпадение в 96,4% (80/83). Три отличающихся результата соответствовали содержанию в две или три клетки/25 г. Правильность определения верифицировалась путем сравнения метода VIDAS® LIS с референтным методом по 204 образцам разных пищевых продуктов, 88 из которых были естественно контаминированы, а 116 – не контаминированы. Все образцы были протестированы в повторностях и тем и другим методом. В целом степень соответствия между двумя методами названа AFNOR «хорошей» (8 ложноотрицательных результатов были получены тест-системой VIDAS® ^LIS, а 5 – референтным методом). Данные относительно точности были получены в результате межлабораторного исследования с участием 13 лабораторий образцов пастеризованного молока, искусственно обсемененных штаммом L. monocytogenes с четырьмя различными уровнями контаминации: 0, 1-10, 5-50 и 10-100 КОЕ/25 г. Все результаты соответствовали ожиданиям, и было показано, что проверяемый метод является достоверным. В 2002 г. была выпущена усовершенствованная версия тест-системы VIDAS® LIS (VIDAS LM02), в которой для операций иммобилизации и обнаружения используются два комплементарных моноклональных антитела. Эти антитела ориентированы на различные антигенные сайты специфического белка вирулентности L. monocytogenes. Данный усовершенствованный тест-набор также прошел валидизацию в AFNOR.

Тест-система anti-Salmonella Dynabeads®

В этой тест-системе для избирательной концентрации всех серовариантов сальмонелл из пищевых продуктов и проб окружающей среды используются намагничиваемые частицы, покрытые специфическими антителами. Эта система, в которой для анализа требуется 15-20 мин, может заменить традиционное 18-48-часовое селективное обогащение или улучшить его качество. Первоначальный протокол включал иммуномагнитное разделение (IMS) из обогащенных в забуференной пептонной воде (BPW) пищевых образцов с последующим посевом на чашки. Непосредственный чашечный посев комплексов «бусины-бактерии» на поверхность твердой агаровой среды может использоваться для прошедших технологическую переработку пищевых продуктов или проб, для которых известно, что у них низкий уровень обсемененности микроорганизмами. В случае сырых пищевых продуктов, в частности мяса птицы, применение этого протокола на среде для чашечного посева иногда приводит к зарастанию целевых сальмонелл колониями других энтеробактерий. В качестве альтернативы традиционному культуральному методу обнаружения бактерий Salmonella можно использовать модифицированный IMS-протокол, по которому стандартное предварительное обогащение образцов в BPW сопровождается IMS с последующим селективным обогащением комплексов «бусины-бактерии» в соево-пептонном бульоне Раппапорта-Вассилиадиса (RVS). Затем проводят посев на чашки с селективной средой. Было проведено сравнение этих методов с традиционным методом, приведенным в стандарте EN/ISO 6579, на основе 10 пищевых образцов (сухое обезжиренное молоко, майонез, смесь для выпечки, сырое куриное мясо, вареная колбаса, сыр, перец, фрикадельки, лазанья, казеин), инокулированных перед предварительным обогащением 20 разными серотипами Salmonella (два серотипа на образец) с низким (1-5 КОЕ/25 г) и средним (10-50 КОЕ/25 г) уровнем засева. Все засеянные образцы затем были заморожены на 1 мес., после чего исследовались. 100%-ное соответствие для 10 вышеуказанных пищевых продуктов было получено между методами прямого /М5-посева и метода с селективным обогащением в RVS-булъоне, причем последний способствовал формированию на чашках хорошо изолированных почти чистых культур Salmonella. Эти IMS-методы показали, соответственно, 90 и 95%-ное совпадение со стандартным методом ISO и выделили при низком и среднем уровне инокулята соответственно на 2 и 1 Salmonella-положительных образцов больше. При оценке этих IMS-методов с помощью 100 естественно контаминированных образцов (50 тушек птицы, 20 клоакальных и/или фекальных мазков, 15 образцов куриной печени, 15 образцов мяса грудки и 10 образцов корма для птицы) метода IMS с предварительным обогащением оказался явное предпочтительнее (39 положительных образцов), чем традиционный референтный метод ISO 6579 (31 положительный образец) и метод IMS без предварительного обогащения (лишь 20 положительных образцов).

Для целевого обнаружения в целях выделения S. enteritidis из яиц и сухого обезжиренного молока метод иммуномагнитного разделения был успешно совмещен с методом ELISA. Вместе с тем исследования на сыром курином мясе с использованием этого комбинированного метода дали значительное количество ложноотрицательных результатов, что было обусловлено высоким содержанием конкурирующих микроорганизмов. Для оценки модифицированного метода IMS-ELISA, включавшего повторное суспендирование комплексов «бусины-бактерии» и инкубацию их в бульоне для грамотрицательных бактерий при температуре 42 °С в течение 6 ч перед проведением ELISA-анализа, было предпринято отдельное иссле-дование, которое может служить примером слишком ограниченного плана эксперимента. В его первой стадии использовались лишь 2 типа пищевых продуктов – корм для животных и сырое куриное мясо, искусственно инокулированное, причем не в пищевом матриксе, а в BPW-бульоне для предварительного обогащения, с весьма высоким уровнем инокулята (2000,200 и 20 КОЕ/мл). Кроме того, для демонстрации того факта, что прямое применение совмещенного IMS-ELISA-метода в большинстве случаев потерпело неудачу, использовались лишь три серотипа Salmonella (при 18 образцах), хотя RV-XLD-метод (ксилоза-лизин-дезоксихолат, традиционный культуральный метод) и IMS-XLD позволили успешно обнаружить сальмонеллы. Вторая стадия исследования была еще более ограниченной – факт лучшего обнаружения видов Salmonella с использованием метода IMS-GN-ELISA, чем при использовании традиционной методологии RV-XLD, основывался на анализе лишь 15 образцов, включая 3 повторности бульона для предварительного обогащения с сырым куриным мясом, которые были искусственно инокулированы S. enteritidis в пяти различных концентрациях.

12.4.2. Молекулярные методы обнаружения
и идентификации патогенных микроорганизмов

Тест-система Probelia® для выявления сальмонелл на основе ПЦР В последнее время в пищевой микробиологии в качестве диагностического инструмента все больше стали применять полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Система Probelia® для выявления сальмонелл на основе ПЦР-амплификации (фирмы Bio-Rad Laboratories) одобрена AFNOR для анализа пищевых продуктов. Эта тест-система Probelia® основана на амплификации iagA-гена Salmonella (участвующего в бактериальной инвазии), после чего следует гибридизация зонда в планшете на 96 лунок для колориметрического обнаружения. Тест-система Probelia® оценивалась на быстроту и специфическое обнаружение Salmonella в молочных продуктах и сравнивалась со стандартным австралийским методом. С помощью препаратов бактериальной ДНК, полученные из десятикратных серийных разведений чистой культуры S. agona, предел обнаружения системы Probelia® был определен как 8-79 КОЕ/мл, что эквивалентно 0,2-2 КОЕ на 1 ПЦР реакцию. Кроме того, было проведено сравнительное исследование с использованием сухого обезжиренного молока, искусственно инокулированного S. agona (5-10 КОЕ/г) и анализировавшегося сразу же и после хранения при 5,15 или 25 °С до 6 нед. (пять повторностей каждого отбора проб). В качестве второго типа пищевых продуктов был выбран сыр «рикотта» (мягкий сыр, напоминающий творог, с очень коротким сроком годности), искусственно инокулированный 1-2, 10-20 и 100-200 КОЕ/25г (каждая концентрация – в трех повторностях). Для всех 40 образцов сухого молока и 12 образцов сыра результаты, полученные с помощью системы Probelia®, не противоречили результатам, полученным с помощью стандартного австралийского метода. Следует отметить, что сравнительное исследование было ограничено лишь двумя видами молочных продуктов и одним штаммом Salmonella, причем не было исследовано ни одного образца, контаминированного естественным образом.

В 2002 г. тест-система Probelia® была вытеснена тест-системой на базе ПЦР в реальном времени, а именно системой iQ-Check™ Salmonella. Она основана на флуоресцентном зонде (молекулярном маячке), который гибридизируется с образующимися амплифицированными продуктами и позволяет измерять флуоресценцию непосредственно в ходе отжига ПЦР. Эту тест-систему оценивали относительно обнаружения Salmonella в искусственно и естественно контаминированных пищевых продуктов и пробах окружающей среды. Искусственно контаминированные образцы (мяса птицы и говяжьего фарша) охлаждали и замораживали, из-за чего микроорганизмы испытывали состояние стресса. В составе 120 естественно контаминированных образцов были кожа шеи птицы и смывы со свиных туш с различных боен, пробы, взятые в птицеводческих хозяйствах, специализирующихся на производстве яиц, а также пробы мяса и мяса птицы с предприятий торговли. Все пробы исследовались на присутствие Salmonella с использованием метода на основе полутвердой культуральной среды DIASALM и с системы iQ-Check™ PCR через 24 ч обогащения в BPW. В случае сильного стресса клеток Salmonella (например, после замораживания при температуре -18 °С в течение 7 сут) инокулированные образцы при использовании аналитической системы iQ-Check™ PCR дали ложноотрицательные результаты. Перенесшие стресс клетки характеризуются более длительной лаг-фазой, которая может быть очень разной, особенно если численность микроорганизмов относительно мала. В стрессовых условиях обычный период обогащения может снизить суммарную чувствительность ПЦР-анализа. В целом Salmonella-положительными при использовании метода DIASALM оказались 45 из 120 естественно контаминированных образцов. Система iQ-Check™ PCR показала 92%-ное совпадение результатов с данными системы DIASALM. В 2004 г. этот ПЦР-метод обнаружения Salmonella прошел валидизацию в AFNOR.

Система TaqMan®
для выявления сальмонелл на основе ПЦР

Система TaqMan® фирмы Applied Biosystems представляет собой систему определения ПЦР-продуктов в реальном времени с помощью инструмента Roche Molecular Systems TaqMan®. В этой системе в целях гидролизации встроенного флуорогенного зонда для осуществления мониторинга амплификации ДНК-мишени (invA ген Salmonella) используется 5'-нуклеазная активность Taq ДНК-полимеразы. Для подтверждения специфичности и чувствительности этого метода применительно к чистым культурам Salmonella и продуктам, контаминированным Salmonella, были проведены специальные исследования. Были обнаружены 164 штамма Salmonella, относящиеся ко всем подвидам S. enterica, а 52 штамма, не относящиеся к Salmonella, выявлены не были. При использовани десятикратных последовательных разведений чистой культуры S. typhimurium (ПЦР-анализ проводили в двух повторностях и повторяли в разные дни) предел обнаружения ПЦР-анализа составил 2 КОЕ на 1 ПЦР-реакцию. Был разработан соответствующий протокол приготовления проб для выделения из пищевых продуктов пригодной для ПЦР-амплификации ДНК. В случае образцов пищевых продуктов, прошедших обогащение (говяжий и свиной фарши) и инокулированных десятикратными разведениями Salmonella, был получен предел обнаружения 3-7 КОЕ на 1 ПЦР-реакцию, тогда как при инокуляции сырого молока, говяжьего и свиного фарша двукратными разведениями того же штамма Salmonella и обогащения в течение ночи бактерии были выявлены в концентрации около 3 КОЕ/25 г. Оба эксперимента проводились без повторностей. Наконец, естественно контаминированные пищевые продукты (50 образцов воды после ополаскивания куриных тушек и 60 образцов сырого молока) исследовались на наличие сальмонелл с использованием и флуорогенного TaqMan®-анализа и культурального метода MSRV(модифицированного метода обнаружения сальмонелл с использованием полутвердой среды Раппапорта-Вассилиадиса) – последний использовался в качестве референтного. Соответствие между этими двумя методами составило более 98%. Два образца оказались Salmonella-положительными по ПЦР-анализу, но отрицательными – по методу MSRV.

Тест-система PCR-ELISA для обнаружения STEC
(E. coli, продуцирующих шигатоксин)

В 1990-х гг. было признано, что продуцирующие шигатоксин Е. coli (STEC), в частности, штаммы серогруппы О157, – это важные патогенные микроорганизмы пищевых продуктов. Для оценки специфичности и чувствительности тест-системы PCR-ELISA относительно обнаружения STEC в молочных продуктах с использованием чистых культур, обогащенных и естественно контаминированных образцов, было проведено специальное исследование. Специфичность тест-системы PCR-ELISA определяли с использованием 94 штаммов STEC, включая большую группу серотипов STEC, выделенных у человека и животных, и 84 штаммов, не относящихся к STEC. Чувствительность этой системы определяли с помощью трех штаммов STEC в двух повторностях с последовательным десятикратным разведением с 10⁶ до 1 КОЕ/мл. Предел обнаружения бактерий в молочных продуктах определяли на пяти различных пастеризованных сырах, искусственно контаминированных тремя штаммами STEC четырьмя концентрациями инокулята (0,10,100 и 1000 КОЕ/10 г, примерно по 30 повторностей для каждой за исключением инокулята самой высокой концентрации, где использовали около 15 повторностей), после чего сразу же проводили анализ. При сравнительном исследовании системы PCR-ELISA и тестирования референтным методом на вероцитотоксичность было проанализировано 527 естественно контаминированных образцов (сырого молока, непастеризованных сыров и проб, взятых с оборудования молочного производства). Результаты, полученные как PCR-ELISA-анализом, так и анализом на вероцитотоксичность показали присутствие STEC в 30 из исследовавшихся образцов, причем только один образец, который оказывал цитотоксический эффект на веро-клетки, оказался ПЦР-отрицательным. Система PCR-ELISA позволила обнаружить STEC в 74 образцах, оказавшихся отрицательными при анализе на вероцитотоксичность. Таким образом, результаты PCR-ELISA-анализа и анализа на вероцитотоксичность совпадали не полностью. Общий уровень совпадений (отрицательных и положительных) составил 85,8%.

ПЦР/рестрикционный анализ
для идентификации термофильных Campylobacter spp.

В развитых странах термофильные Campylobacter spp. (Camp, jejuni, Camp, coli, Camp, lari и Camp, upsaliensis) считаются наиболее распространенными бактериями, вызывающими гастроэнтерит у человека. Использованию традиционных стенотипических тестов для дифференциации и идентификации этих микроорганизмов зачастую препятствует то, что эти бактерии являются весьма привередливыми к условиям роста и размножения, не расщепляют сахара и характеризуются небольшим количеством фенотипических различий. Было проведено сравнение PCR/REA метода со стандартными фенотипическими тестами по идентификации этих микроорганизмов, в рамках которого исследовались 182 предположительно термофильных Campylobacter spp. Методом PCR/REA 95% изолятов были идентифицированы либо как принадлежащие к одному из четырех вышеуказанных видов, либо как не принадлежащие к этой группе бактерий. Методом стандартного фенотипирования были идентифицированы как представители того или иного термофильного вида 174 из 182 изолятов, причем эти методы дали лишь 67% соответствия идентифицированных видов. Тем не менее для большинства из 52 изолятов, идентифицированных этими двумя методами по отдельности, дополнительные тесты позволили объяснить полученное несоответствие и доказать правильность PCR/REA. Например, было показано, что 19 гиппуратотрицательных изолятов, первоначально идентифицированных фенотипическими тестами как Camp, coli, согласно методу PCR/REA являются Camp, jejuni, что обусловлено наличием у них гена гиппуриказы.

12.5. ПРИМЕНЕНИЕ ВАЛИДИЗИРОВАННЫХ МЕТОДОВ
В АККРЕДИТОВАННЫХ ЛАБОРАТОРИЯХ

Уверенность в результатах того или иного метода микробиологического анализа зависит от его применимости (установленной в ходе валидизационного исследования) для данного исследования и от способности сотрудников данной лаборатории обеспечить получение правильных, надежных и воспроизводимых результатов. Аккредитация лабораторий, выполняющих микробиологические анализы пищевых продуктов, позволяет их заказчикам надеяться, что результаты анализа будут надежными. Аккредитация лаборатории – это формальное подтверждение государственным компетентным органом (в Европе – Европейской ассоциацией аккредитованных лабораторий, EAL), свидетельствующее, что данная лаборатория имеет право проводить специфические анализы и соблюдает общие принципы обеспечения качества. Подробные условия аккредитации лабораторий приведены стандарте EN/ISO/IEC17025, и мы рассмотрим их в главе 13.

Понятно, что для соблюдения требований вышеуказанного стандарта аналитическая лаборатория должна использовать только валидизированные методы. Тем не менее, исходя из опыта аудита микробиологических лабораторий, проводивших анализы пищевых продуктов, можно утверждать, что валидизационные исследования в этих лабораториях не всегда проводились надлежащим образом. Такие исследования необходимы в процессе аккредитации для доказательства того, что сотрудники лаборатории обладают достаточными знаниями и умениями для проведения соответствующего метода анализа и правильной интерпретации его результатов. Иногда, однако, стандартизированной процедуры, применимой для валидизаци-онных исследований, просто нет, и детали отрабатываются по принципу ad hoc без какого-либо систематического подхода.

Кроме того, валидизация может проводиться на основе лишь эталонных (референс-) штаммов без анализа пищевых матриксов (или количество и тип пищевых матриксов ограничены, несмотря на то что аккредитация необходима для исследования разнообразных пищевых продуктов с разной степенью контаминации). В некоторых случаях пищевые продукты перед инокуляцией целевыми микроорганизмами автоклавируют, исключая действие «фона» других микроорганизмов, что может улучшить результаты анализа при низком содержании инокулята, который в случае присутствия «фоновых» микроорганизмов может оказаться ниже предела обнаружения. Зачастую при валидизационных исследованиях нецелевые микроорганизмы не вносят в исследуемый образец, а те микроорганизмы, которые для этого используются, могут быть нерепрезентативными для потенциально «фоновой» микробиоты. В качестве репрезентативных микроорганизмов должны выступать те, которые встречаются с наибольшей вероятностью и таксономически связаны с целевыми штаммами. Соответственно, можно ожидать, что при используемом методе анализа их реакция будет такой же. В крайнем варианте при валидизационных испытаниях иногда используют только холостые образцы, проверенные на отсутствие целевых микроорганизмов и не инокулированные искусственно. Такие испытания свидетельствуют о компетентности сотрудников лаборатории, позволяющей не получать ложноотрицательных результатов, но не дают никакой гарантии, что целевой патогенный микроорганизм будет обнаружен (особенно если он присутствует как естественный контаминант довольно редко). Иногда не все сотрудники лаборатории, принимающие участие в проведении того или иного анализа, были задействованы в валидизационном исследовании или имеют официальное свидетельство о профессиональной подготовке или подтвержденную квалификацию, позволяющую работать с данным методом. Подобные факты свидетельствуют, что во многих лабораториях валидизационным исследованиям все еще не уделяется достаточного внимания, что еще более требует разработки единого стандартизованного подхода. С другой стороны, валидизационные исследования в целях аккредитации или внутрилабораторного использования конкретных методов не должны быть слишком обширными, трудоемкими и длительными процедурами – они должны лишь показать профессиональную компетентность сотрудников, причем с учетом экономической эффективности самой процедуры валидизации.

Помимо необходимости применения валидизированных методов, соответствующим образом задокументированных в инструкциях по конкретным видам работ в целях аккредитации лаборатории, существует также необходимость в систематическом подходе к контролю качества, что позволяет обеспечить получение надежных результатов анализа с помощью любого валидизированного метода, используемого в данной лаборатории. Пример основных требований приведен ниже.

• Проверяйте свойства культуральных сред перед их использованием. Для твердых сред можно использовать модифицированный метод инокуляции Miles- Подробная информация по приготовлению и получению культуральных сред – в рекомендациях и стандарте CEN/ISO/TS111333, части 1 и 2.Регулярно проверяйте работоспособность всех приборов и составьте график их мойки и технического обслуживания. Проверять температуру, например, можно только калиброванным термометром. Относительно недавно в рамках европейского проекта FOOD-PCR был разработан биохимический тест для проверки эффективности термоциклера, используемого при выполнении ПЦР-анализа.
• Используйте утвержденные процедуры контроля качества, включая первую, вторую и третью линии контроля. Первая линия контроля – это проверки, выполняемые самими лаборантами в ходе каждой серии испытаний в сходных условиях. К ним могут относиться анализ холостых (без исследуемого микроорганизма), положительных (с целевым микроорганизмом) и отрицательных (с нецелевым микроорганизм) контрольных образцов с помощью референтных материалов или обогащенных образцов. Результаты, полученные проверкой положительных контролей, можно использовать для создания контрольных диаграмм (карт), показывающих общий результат деятельности и постоянство результатов во времени. Вторую линию контроля используют реже. В нее входят проверки, инициируемые руководителями лаборатории, которые следует выполнять с привлечением нескольких специалистов, – например, анализ одного и того же образца (естественно или искусственно контаминированного) или интерпретацию результатов инкубации культуральных сред более чем одним специалистом-микробиологом. Полученные результаты могут использоваться при анализе воспроизводимости результатов в рамках данной определении лаборатории. Третья линия контроля касается участия данной лаборатории в утвержденных программах межлабораторного контроля в целях обеспечения качества аналитических работ (профессионального тестирования) и имеет целью сравнить работу конкретной лаборатории с работой других, проводящих такие же анализы. Полученные результаты могут использоваться для определения «истинности» результатов того или иного метода анализа. Данные внутреннего контроля качества наряду с результатами внутренних валидизационных исследований можно использовать для оценки общей «ошибки измерений».
• Необходимо обеспечить должный уровень квалификации сотрудников лаборатории. Именно наличие квалифицированного персонала, способного выполнять требуемые анализы и имеющего стимул для профессионального роста, является главным фактором при аккредитации лаборатории.

Одним из требований для аккредитации лаборатории является наличие внедренной системы обеспечения качества, позволяющей обеспечить строгий контроль выполнения лабораторных анализов и надежность получаемых результатов. Все чаще государственные органы и предприятия пищевой промышленности требуют от микробиологических лабораторий, выполняющих анализы по их заказам, наличия официальной аккредитаций.

12.6. НЕКОТОРЫЕ ТЕНДЕНЦИИ

Диалог между международными организациями, участвующими в разработке и валидизации микробиологических методов, очень важен для их унификации и должен обеспечить приемлемость методов для государственных лабораторий и лабораторий при пищевых и торговых предприятиях, облегчив, тем самым, ведение внешней торговли сырьем и пищевыми продуктами. Международное сотрудничество осуществляется, как свидетельствуют различные международные симпозиумы и семинары, организуемые совместно ISO, CEN, AOACI, для обмена микробиологами опытом и идеями. Встречи членов рабочих комиссий и групп ISO ТС 34/5С9 и CEN ТС275/ WG 6 проводятся ежегодно в одну и ту же неделю и в одном и том же месте, что облегчает координацию работ, причем их посещают также эксперты из AOACI и IDF. Все это должно привести к принятию более унифицированных стандартных протоколов, что не всегда достижимо из-за огромного разнообразия интересов и опыта. Что касается альтернативных методов, то в интересах и поставщиков, и пользователей новейших тест-наборов согласовать протоколы их валидизации. В 2002 г. европейский стандартный «Протокол валидизации альтернативных методов» был принят в качестве общеевропейского стандарта (CEN) и был утвержден в качестве стандарта ISO. С AOACI было достигнуто соглашение об обоюдном признания схем валидизации, что должно привести к большей координации процедур валидизации в Европе и, хочется надеяться, в других странах. В конечном счете это будет способствовать облегчению торговли продовольственными товарами в Европе. В 2005 г. была начата работа по пересмотру стандарта EN/ISO 16140; в рамках ISO была учреждена рабочая группа для выработки рекомендации по внутрилабораторной оценке или валидизации методов, модифицированных в научно-исследовательских лабораториях, а также по верификации модифицированных стандартных методов, используемых при аккредитации лабораторий.

Применение валидизированных методов – это только часть обеспечения надежных результатов. Не менее важно проведение анализа квалифицированным персоналом с использованием валидизированных приборов и лабораторной посуды, а также наличие в ней системы обеспечения качества. Все эти условия должны признаваться и распространяться все шире. Кроме того, следует ясно осознавать, что результат, полученный каким-либо методом анализа (особенно вблизи предела обнаружения), не может служить безусловным показателем присутствия или отсутствия целевых микроорганизмов в случае проведения качественного анализа, а при количественном определении таким абсолютным показателем не может являться количество КОЕ. Результат неизбежно зависит от степени неопределенности, которая должна быть известна по результатам валидизационного исследования. В действующем стандарте ISO по аккредитации микробиологических лабораторий EN/ ISO/IEC 17025 недвусмысленно подтверждается необходимость определения степени достоверности измерений. В 2006 г. был принят стандарт ISO/TS 19036 относительно методов определения погрешности измерений с использованием данных либо внутри-, либо межлабораторной валидизации, и показателей контроля качества, полученных в рамках программы аккредитации при определении воспроизводимости результатов данной лаборатории.

По результатам анализа принимается много важнейших решений. Интерпретация этих результатов, однако, требует знания используемой процедуры пробоотбора, включая первичный отбор проб из партии, транспортирования образцов и способов вторичного отбора суб-проб в лаборатории, умений адекватно поставить задачу анализа или определить его цель, а также от наличия адекватной информации об анализируемых пищевых продуктах и технологиях их переработки. Только в таком случае можно установить реальные критерии правильности интерпретации результатов исследования. В ближайшем будущем, вероятно, будет расти потребность в квалифицированном персонале, имеющем навыки выполнения анализов и обладающем широкими микробиологическими знаниями, а также знаниями в области пищевых технологий и пищевой химии, позволяющими правильно интерпретировать получаемые результаты.