No module Published on Offcanvas position

2.5.Способы выделения и очистки белков

Все методы разделения смесей основаны на том, что разделяемые компоненты в результате каких-либо манипуляций оказываются в разных участках системы и могут быть механически отделены друг от друга. Выделение индивидуальных белков является ступенчатым процессом, т.к. на первых этапах очистки фракции содержат множество примесей.

На каждой ступени разделения должна получаться фракция, более богатая необходимым веществом, чем предыдущая. Такой процесс часто называют фракционированием. На каждой стадии разделения белок находится либо в виде раствора, либо в виде осадка.

  • Осаждение. Для осаждения необходимо понизить каким-либо способом растворимость белка. Известно, что растворимость белка зависит от их способности к гидратации. У глобулярных водорастворимых белков высокий уровень гидратации обеспечивается расположением гидрофильных групп на поверхности. Добавление органических растворителей понижает степень гидратации и приводит к осаждению белка. В качестве таких растворителей используют ацетон. Осаждают белки также с помощью солей, например, сульфата аммония. Принцип этого метода основан на том, что при повышении концентрации соли в растворе происходит сжатие ионных атмосфер, образуемых противоионами белка, что способствует сближению их до критического расстояния, на котором межмолекулярные силы ван-дер-ваальсова притяжения перевешивают кулоновские силы отталкивания противоионов. Это приводит к слипанию белковых частиц и их выпадению в осадок.
  •  Изоэлектрическое осаждение. Заряд белков обусловлен в первую очередь остатками аспаратата и глутамата (отрицательный заряд) и остатками лизина и аргинина (положительный заряд). По мере повышения рН различными способами заряд белков проходит от положительных к отрицательным значениям и в изоэлектрической точке оказывается равен нулю. В результате белок лишается своей ионной атмосферы и его частицы слипаются, выпадая в осадок.
  •  Центрифугирование. Выпавший осадок белка можно выделить фильтрованием. Для этого часто пользуются центрифугами. Частицы осажденного вещества под действием центробежной силы оседают на дне центрифужных стаканов и сжимаются в плотный осадок, с которого оставшийся раствор (надосадочная жидкость, или супернатант) легко сливается или отсасывается. Скоростные центрифуги (ультрацентрифуги) создают центробежное ускорение порядка 105 g (т.е. 105 ускорений свободного падения), что позволяет осаждать даже некоторые крупные надмолекулярные агрегаты - рибосомы и вирусы.
  • Сорбция. Основана на различном сродстве компонентов смесей к определенным веществам - сорбентам. Наиболее часто используемый сорбент - гель фосфата кальция (гидроксиапатит) или активированный уголь. Эффективную сорбцию можно получить на ионитах - сорбентах, имеющих на поверхности заряженные группы. В исходном состоянии эти заряды скомпенсированы какими-либо подвижными противоионами. Практически при сорбции на ионитах происходит обмен этих противоионов. Если на поверхности сорбента находятся отрицательно заряженные группы, то он связывает катионы и его называют катионитом, соответственно сорбент с положительно заряженными группами называют анионитом. В качестве ионитов чаще всего используют материалы (после соответствующей химической обработки) на гидрофильной основе - целлюлозе, декстране, силикагеле или пористых стеклах.
  • Ситовой эффект. Молекулярные сита представляют собой материалы с очень маленькими порами определенного размера. Следует отметить отличие этих “сит”: крупные частицы не остаются на поверхности материала сита, а обтекают его частички (гранулы), тогда как мелкие вещества примесей диффундируют в частицы сита и таким образом задерживаются.

Материалом для молекулярных сит может служить сефадекс (полисахарид декстран, у которого после соответствующей обработки цепи оказываются сшитыми трехуглеродными мостиками) или полиакриламид, линейные цепи которого сшиты метиленовыми мостиками.

В перечисленных методах в конечной смеси остаются вспомогательные низкомолекулярные вещества - органические растворители, соли и кислоты. Для очищения от них используется метод диализа, который основан на применении мембран проницаемых для воды и низкомолекулярных веществ и непроницаемых для белков. Чаще всего с этой целью используют пленки из целлофана (нитрат целлюлозы). В лаборатории подлежащий диализу раствор белка помещают в мешок из целлофана и погружают в сосуд с водой.

Непрерывный ток воды через сосуд приводит к полному переходу в него всех проходящих через целлофан веществ, а белки остаются внутри. Некоторые гидролизаты, особенно из растительных белков, часто содержат высокомолекулярные примеси, которые необходимо удалять, для чего применяют, например, ультрафильтрацию растворов гидролизатов через полупроницаемые мембраны с различным размером пор, обеспечивающую не только фракционирование, но и очистку, в частности осветление растворов.

В случае необходимости можно ограничиться обычной фильтрацией гидролизатов через активированные угли различных марок, бентониты, неорганические соединения кальция. Из-за низкой скорости фильтрации гидролизатов, особенно ферментативных, существует достаточно высокая вероятность микробного загрязнения, поэтому перед сушкой гидролизатов целесообразно проводить их микро или ультрафильтрацию.

Значительно более сложной является очистка кислотных гидролизатов, а также дрожжевых автолизатов. В случае кислотного гидролиза или автолиза белковые гидролизаты наряду со свободными аминокислотами и пептидами содержат продукты нейтрализации минеральных и органических кислот, амины, нуклеотиды, окрашенные смолообразные примеси (гуминовые компоненты) и другие остатки клеточных биополимеров и продуктов их деградации.

Для осветления окрашенных гидролизатов и адсорбции пигментирующих веществ применяют активированные угли или ионообменники. В отдельных случаях для этих целей могут быть также использованы природные или синтетические комплексообразователи, например танины, соли цинка или олова. Смеси выпавших в осадок нерастворимых солей отфильтровывают, чаще в виде суспензии с добавленным твердым адсорбентом, например активированным углем или другим осветляющим сорбентом. В случае использования синтетических ионообменников обычно отбирают отдельные фракции с максимальным содержанием аминокислот, затем проводят выпаривание и высушивание с целью получения конечного продукта. Отмечается возможность выпадения из полученных растворов некоторых аминокислот, в частности глутаминовой кислоты и тирозина.

Существует возможность потери некоторых аминокислот, в частности глутаминовой, при обработке гидролизатов автоклавированием при 120- 125°С в течение 3-4 ч. Образующуюся одновременно пироглутаминовую кислоту удаляют экстракцией раствора этилацетатом. За счет столь длительного автоклавирования в растворе увеличивается содержание гуминовых компонентов из-за протекания реакции Майяра при наличии в растворе даже небольшого количества Сахаров. После автоклавирования раствор приходится дополнительно осветлять на активированном угле, в результате чего происходит существенное уменьшение фенилаланина, что в отдельных случаях позволяет рекомендовать такой гидролизат, например, для больных фенилкетонурией.

При получении кислотных гидролизатов существует проблема удаления анионов. Сульфаты удаляют из гидролизатов в виде гипса или связыванием в виде Na2SO4 • 10Н2О, который легко отделяют от сконцентрированного раствора гидролизата при пониженных температурах. Одновременно с сульфатом натрия происходит отделение гуминовых компонентов.

В случае проведения солянокислого гидролиза часть кислоты обычно удаляется в процессе концентрирования раствора под вакуумом с последующей нейтрализацией оставшейся кислоты добавлением NaOH, Na2CO3 и удалением солей либо при помощи анионитов различных марок, либо электродиализом или обратным осмосом. В этом случае удается получить растворы аминокислот и пептидов, практически не содержащие ионов натрия, калия и хлора.

Эффективная очистка солянокислотного гидролизата крови убойных животных достигалась при обработке гидролизата активированным углем и фильтрацией через анионит марки ЭДЭ-10п, причем для уменьшения потерь аминокислот в процессе фильтрации смолу рекомендуют обрабатывать раствором гидроокиси натрия до рН 8.0-9.0. Последующая очистка гидролизата на смоле типа КУ 2 х 20 и добавление к раствору недостающего триптофана позволяют получать инфузионные растворы для парентерального белкового питания с низким содержанием пептидов.

В процессе очистки и фракционирования дрожжевых автолизатов и гидролизатов обычно проводят следующие операции: отделение нерастворимых клеточных остатков, обесцвечивание раствора, отделение аминокислот и пептидов от примесных компонентов и, в случае необходимости, дополнительный гидролиз пептидов до свободных аминокислот. Из-за длительности очистки, с целью уменьшения возможности бактериального загрязнения гидролизатов, к реакционной массе целесообразно добавлять 4-5% мас. толуола, спирта или хлороформа, а также, в отдельных случаях, ацетата натрия, обладающего бактериостатическим действием.

Важная технологическая операция процесса очистки - отделение клеточных оболочек, которые, как известно, плохо усваиваются организмом млекопитающих. Для этого могут быть использованы сепараторы различных марок, центрифуги, барабанные вакуум-фильтры или другие виды фильтрации. Для более полного отделения клеточных оболочек сепарированием или центрифугированием приходится совмещать операции с микро- и ультрафильтрацией.

Раствор, полученный после отделения клеточных оболочек, обычно содержит до 60-80% свободных аминокислот и может быть использован после удаления из него остатков нуклеиновых кислот и нуклеотидов для пищевых и других целей. Это обычно осуществляется фронтальной фильтрацией раствора через различные аниониты, например ИА-1p, АН-511, ЭДЭ-10п и др. В случае необходимости можно осуществить концентрирование аминокислот и пептидов на сульфокатионите КУ 2 х 8 с последующей их десорбцией растворами гидроксида натрия или водноаммонийными растворами при 50°С. В последнем случае удается существенно увеличить десорбцию со смолы триптофана и аргинина.