4.6.1 Рабочие питательные среды для посевов готовят из сухих питательных сред путем их растворения в воде с последующей стерилизацией в соответствии с инструкцией по приготовлению, приведенной на этикетке или в сопроводительных документах.

Для приготовления рабочих питательных сред используют водопроводную или дистиллированную воду. Водопроводную воду рекомендуется готовить по 4.3.2.1. Использование дистиллированной воды оговаривается в соответствующих пунктах при приготовлении конкретной рабочей среды.

4.6.1.1 Определение активной кислотности (pH) питательных сред

Определение активной кислотности (pH) питательных сред проводят потен­циометрическим методом с помощью анализатора потенциометрического для кон троля pH по прилагаемым инструкциям.

4.6.1.2 Среда Кесслер для определения БГКП

А Жидкая среда Кесслер

Приготовление

16 г сухой среды Кесслер растворяют в 1 дм³ питьевой водой. Смесь разме­шивают и кипятят при помешивании 2-5 мин. Разливают в пробирки с поплавками по 5 см³ или колбочки с поплавками по 40-50 см³ и стерилизуют при (121+1) °С в тече­ние (11+1) мин. Готовая для применения среда должна иметь темно-фиолетовый цвет. Допускается наличие небольшого осадка.

Признаком роста является наличие газа, образование которого в поплавке определяется визуально.

Рекомендации к применению

Используется для индикации и количественного учета БГКП в молоке и мо­лочных продуктах по ГОСТ 9225, в смывах с оборудования, рук и халатов персона­ла, во время приемо-сдаточных испытаний.

Б Плотная среда Кесслер

Приготовление

16 г сухой среды Кесслер и 8 г агара помещают в колбу и вносят 1 дм³ воды. Смесь размешивают и кипятят при перемешивании 2-5 мин до полного расплавле­ния агара. Расплавленную среду разливают по 7-8 см³ по пробиркам и стерилизуют при (121+1) °С в течение (11±1) мин.

Признаком роста является наличие газа, образование которого определя­ется визуально по разрывам столбика со средой.

Рекомендации к применению

Используется для индикации и количественного учета БГКП в молоке и мо­лочных продуктах, в смывах с оборудования, рук и халатов персонала при внутри­производственном контроле при отсутствии поплавков, необходимых для посева на жидкую среду Кесслер.

4.6.2.3 Среда Кода - жидкая элективная среда для определения БГКП в объ­ектах окружающей среды.

Приготовление

30 г сухой среды растворяют в 1 дм³ воды. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20-30 % раствором гидроокиси натрия или 20 % раствором молочной кислоты до 7,4-7,6 ед. pH. Среду кипятят 5 мин при постоянном перемешивании. Готовую среду разливают в стериль­ные пробирки по 5 см³.

Цвет среды должен быть зеленым.

Признаком роста лактозоположительных энтеробактерий (БГКП) является изменение цвета среды с темно-зеленого до ярко-желтого; лактозоотрицатель­ных энтеробактерий (шигелл, сальмонелл) - помутнение среды без изменения цвета.

Рекомендации к применению

Среда применяется при контроле санитарно-гигиенического состояния произ­водства и определении БГКП в смывах.

4.6.2.4  Глюкозопептонная среда (ЛПС) или лактозопептонная среда (ЛПС)- жидкие элективные среды для определения БГКП в воде.

Приготовление

Среду готовят двух видов: концентрированную и нормальную.

Концентрированная среда

К 20 г сухой среды при постоянном перемешивании добавляют 100 см³ воды с температурой 90-95 °С. Контролируют активную кислотность готовой питательной среды и в случае необходимости корректируют ее 20-30 % раствором гидроокиси натрия или 20 % раствором молочной кислоты до величины 7,2-7,6 ед. pH. Готовую среду разливают по 10 см³ в колбы и по 1 см³ в пробирки с ватными пробками или тампонами.

Среда нормальной концентрации

К 10 см³ концентрированной питательной среды добавляют 90 см³ воды. Гото­вую среду разливают по 10 см³ в пробирки с поплавками или комочками ваты.

Среды стерилизуют в автоклаве при 112 °С (0,5 атм) в течение 12 мин.

Признаками роста БГКП является помутнение, газообразование и изме­нение окраски сред с буровато-зеленой (для концентрированной) или голубой (среда нормальной концентрации) на желтую.

Рекомендации к применению

Среды служат для определения БГКП в воде в соответствии с ГОСТ Р 51232, ГОСТ 18963 и МУК 4.2.1018.

4.6.2.5 Среда АЖФК (агар желчный фиолетово-красный) - плотная электив­ная среда для количественного определения БГКП в молоке и молочных продуктах.

Приготовление

35 г сухой среды вносят в 1 дм³ дистиллированной воды, тщательно переме­шивают, затем нагревают и кипятят при помешивании 5 мин. Среду готовят непо­средственно перед посевом.

Готовая среда должна иметь фиолетово-красный цвет.

Допускается хранение среды, разлитой в пробирки или флаконы, прокипячен­ной в водяной бане или пастеризованной текучим паром в автоклаве (30,0+0,5) мин, в течение 7 сут.

Перед выполнением анализа среду расплавляют на водяной бане (или пользу­ются свежеприготовленной средой), охлаждают до (50,0±0,5) °С и разливают в сте­рильные чашки Петри примерно по (11 ±1) см³, чтобы дно чашки было покрыто равно­мерно. Чашки оставляют полуоткрытыми на (60±5) мин для подсушивания. Затем их закрывают, маркируют и используют среду для анализа.

Посев на среду можно проводить двумя способами - поверхностным и глубинным.

При поверхностном посеве БГКП образуют розовато-фиолетовые колонии диаметром больше 0,5 мм с более светлым по сравнению с центром ореолом.

При глубинном посеве БГКП образуют мелкие до 0,5 мм колонии красного цвета (вокруг колоний обычно образуется красный ореол).

Рекомендации к применению

Среда применяется для количественного учета КОЕ БГКП и визуальной оцен­ки характера образующихся колоний.

Среда рекомендуется при проведении контроля производственного процесса выработки сыров и сырных продуктов.

4.6.2.6 Среда Эндо - плотная дифференциально-диагностическая среда для дифференциального определения и идентификации БГКП при контроле санитарного состояния производства и качества готового продукта на предприятиях пищевой промышленности.

Приготовление

40 г сухой среды вносят в 1 дм³ дистиллированной воды, тщательно размеши­вают, затем нагревают и кипятят в течение 3-5 мин, не допуская пригорания. После охлаждения до 40-50 °С среду разливают в стерильные чашки Петри и подсушивают в термостате.

Рекомендации к применению

Посев на среду проводят исключительно с накопительных сред (Кесслер, Ко­да, ГПС, ЛПС), давших признаки роста БГКП.

По характеру колоний на среде Эндо судят о принадлежности микроорганиз­мов, давших рост на накопительных питательных средах, к лактозоположительным или лактозоотрицательным энтеробактериям.

Характерным ростом для БГКП является образование красных или тем­но-красных колоний с металлическим блеском.

4.6.2.7 Среда агаровая для определения дрожжей и плесеней - плотная элективная среда для определения дрожжей и плесневых грибов в молоке и молочных продуктах, а также для микробиологического контроля санитарного состояния производства.

Приготовление

60 г сухой среды вносят в 1 дм³ дистиллированной воды, нагревают до полного растворения, при наличии осадка фильтруют. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20-30 % раствором гидроокиси натрия или 20 % раствором молочной кислоты до 4,6-4,7 ед. pH, разливают в пробирки и стерилизуют 15 мин при температуре 121 °С.

Чашки выдерживают при температуре 20-23° С в течение 3-5 сут. Подсчитывают отдельно типичные колонии дрожжей и плесеней.

Рекомендации к применению

Среду можно применять без антибиотиков. Дрожжи на этой среде формируют блестящие, чаще белые, колонии круглой формы с гладкой поверхностью и ровным краем. Рост плесневых грибов сопровождается образованием мицелия. Молочнокислые микроорганизмы из-за низкого содержания азотистых соединений в среде и низкого уровня pH могут давать точечные колонии в виде пыли, не подлежащие учету.

4.6.2.8 Среда Сабуро - плотная питательная среда основного характера для анализа консервов на стерильность и определения дрожжей и плесневых грибов в молоке и молочных продуктах.

Приготовление

70 г сухой среды вносят в 1 дм³ дистиллированной воды и оставляют на 30 мин для набухания. Среду нагревают до расплавления агара. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20-30 % раствором гидроокиси натрия или 20 % раствором молочной кислоты до (5,8±0,1) ед. pH, разливают в колбы и стерилизуют 30 мин при 112 °С (0,5 атм).

Непосредственно перед применением среду расплавляют, помещая посуду со средой в водяную баню, и вносят растворы антибиотиков согласно таблице 1.

Рекомендации к применению

При анализе продуктов на стерильность среда используется без применения антибиотиков, а для определения дрожжей и плесневых грибов в молоке и молочных продуктах — с обязательным использованием антибиотиков.

Для повышения селективности сред, используемых для определения дрожжей и плесеней по 4.6.2.7 и 4.6.2.8, к средам добавляют антибиотики, приготовленные согласно 4.5, в объемах, указанных в таблице 1.

Водные растворы антибиотиков вносят перед использованием в расплавленную и охлажденную до (46+1) °С питательную среду.

4.6.2.9  Среда СДА - полужидкая среда основного характера для определения общего количества спор мезофильных анаэробных бактерий при контроле молока, сухого молока, при исследовании сыров.

Приготовление

(50+5) г сухой среды вносят в 1 дм³ воды, тщательно перемешивают, нагревают и кипятят 3-5 мин, не допуская пригорания. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20-30 /о раствором гидроокиси натрия или 20 % раствором молочной или соляной кислоты до значения (7,3±0,1) ед. pH. Готовую среду разливают в пробирки по (12±1) см , закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121+2) С в течение (15+1) мин.

Признаками роста являются изменение окраски среды с красной на желтую и образование газа.

Рекомендации к применению

При посеве избегают взбалтывания среды и попадания внутрь среды воздуха для обеспечения анаэробных условий.

4.6.2.10 Среда ЛАОСА - полужидкая дифференциально-диагностическая среда для определения спор и вегетативных клеток лактатсбраживающих маслянокислых бактерий.

Приготовление

(50+5) г сухой среды вносят в 1 дм³ воды, тщательно перемешивают, нагревают и кипятят 3-5 мин, не допуская пригорания. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20-30 % раствором гидроокиси натрия или 20 % расвором молочной кислоты до значения (5,7±0,1) ед. рН. Готовую среду разливают в пробирки по (12±1) см³ , закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121±2)°С в течение (15±1) мин. 

Признаками роста являются изменение окраски среды с малиновой на соломенно-желтую и газообразование.

Рекомендации к применению

При посеве избегают взбалтывания среды и попадания внутрь среды воздуха для обеспечения анаэробных условий.

4.6.2.11 Среда для определения бифидобактерий — плотная питательная среда основного характера для определения бифидобактерий в ферментированных молочных продуктах, бифидосодержащих бактериальных концентратах и заквасках.

Приготовление

(50±5) г сухой среды вносят в 1 дм³ холодной воды, тщательно перемешивают, нагревают, не допуская пригорания, и кипятят 3-5 мин. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20-30 % раствором гидроокиси натрия или 20 % раствором молочной кислоты до значения (7,4±0,2) ед. pH. Среду разливают в пробирки по 20 см³, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121±2) ^вС в течение (15±1) мин.

Непосредственно перед применением пробирки с рабочей средой нагревают в водяной бане до кипения и выдерживают в течение (25±5) мин. По окончании тепловой обработки среду быстро охлаждают до температуры 40-45 °С. Посевы культивируют (72±2) ч при температуре (37±1) °С.

Рекомендации к применению

Среда предназначена для определения бифидобактерий в ферментированных молочных продуктах, содержащих наряду с бифидобактериями молочнокислые микроорганизмы. Поэтому при проведении посева необходимо создавать анаэробные условия, проводя посев «в высокий столбик», и избегать взбалтывания среды и попадания внутрь столбика среды воздуха из пипетки.

Бифидобактерии на данной среде образуют непрозрачные белесые колонии в виде «дисков» или «гречишных зерен».

При определении бифидобактерий в продуктах со смешанной микрофлорой в готовые среды перед расплавлением рекомендуется вносить на 20 см среды 0,2 см³ раствора неомицина, приготовленного по 4.5.5.

4.6.2.12 Среда для культивирования бифидобактерий - полутвердая среда основного характера для культивирования бифидобактерий и дальнейшего их использования при производстве ферментированных молочных продуктов.

Приготовление

50 г сухой среды вносят в 1 дм³ воды. Среду тщательно перемешивают, нагревают, не допуская пригорания, кипятят 3-5 мин. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20-30 % растворок гидроокиси натрия или 20 % раствором молочной кислоты до значения (7,4+0,2) ед. р. Среду разливают в пробирки или колбы, закрывают ватными пробками и стерипизук при температуре (121 ±2) °С в течение (15±1) мин.

Непосредственно перед применением пробирки или колбы со сред нагревают в водяной бане до кипения и выдерживают в течение (25+5) мин. окончании тепловой обработки среду охлаждают до (45+2) °С

Посевы культивируют (48±2) ч при температуре (37±1) °С.

Рекомендации к применению

При посеве избегают взбалтывания среды и попадания внутрь среды воздуха для обеспечения анаэробных условий.

Признаками роста бифидобактерий являются образование колоний в виде «комет», «гвоздиков», «кучевых облаков» различной степени четкости.

4.6.2.13 Водный агар 

Приготовление

20 г микробиологического агара вносят в 1 дм³ воды. Среду тщательно перемешивают, нагревают, не допуская пригорания, кипятят 3-5 мин. Среду разливают в пробирки или колбы, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121 ±2) °С в течение (11 ±1) мин.

Рекомендации к применению

Применяют при определении микроорганизмов, обладающих протеолитической активностью, а также для создания анаэробных условий при определении споровых анаэробных микроорганизмов.

4.6.2.14 Стерильное обезжиренное молоко

Приготовление

Обезжиренное молоко разливают в пробирки по 10 см (возможно использо­вание 10 % восстановленного обезжиренного молока), закрывают ватными пробками и стерилизуют при (121 ±2) °С в течение (11 ±1) мин.

Рекомендации к применению

Применяют при определении молочнокислых микроорганизмов, а также микроорганизмов, обладающих протеолитической активностью.

4.6.2.15 Среда для определения цитратсбраживающих ароматообразующих микроорганизмов - плотная питательная среда на основе среды КМАФАнМ, предназначенная для количественного определения цитратсбраживающих ароматообразующих микроорганизмов.

Приготовление

(50±5) г сухой среды КМАФАнМ вносят в (1000±50) см³ воды. Смесь тщательно перемешивают, затем нагревают и кипятят 3-5 мин, не допуская пригорания. При наличии осадка фильтруют через ватно-марлевый фильтр. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости корректируют ее 20-30 % раствором гидроокиси натрия или 20 % раствором молочной кислоты до значения (7,3±0,1) ед. pH. В расплавленную среду добавляют 10 г цитрата кальция, предварительно хорошо растертого в ступке. Среду, периодически перемешивая до равномерного распределения осадка, разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121 ±2) °С в течение (15±1) мин.

Рекомендации к применению 

Применяют при определении цитратсбраживающих ароматообразующих молочнокислых микроорганизмов закваски, БК и ферментированных молочных продуктов. При определении ароматообразующих микроорганизмов вокруг их колоний образуются просветления.

4.6.2.16 Молочно-солевой агар — плотная питательная среда, предназначен­ная для определения солеустойчивых микроорганизмов.

Приготовление

115 г сухой основы вносят в 1 дм³ дистиллированной воды. Смесь тщательно перемешивают, кипятят 3-5 мин, не допуская пригорания. В полученной среде проверяют активную кислотность и при необходимости устанавливают её 20-30 % раствором гидроокиси натрия или 20 % раствором молочной кислоты на уровне (7,2±0,1) ед. pH. Среду разливают мерно в колбы, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121+2) °С в течение (20±1) мин.

Использование рабочей среды: перед посевом к расплавленной и охлажденной до (45+1) °С среде добавляют 10 % (по объёму) стерильного обезжиренного молока, хорошо перемешивают и разливают по 15-20 см³ среды в чашки Петри. Чашки могут храниться в холодильнике не более 5 сут.

Рекомендации к применению

Применяют при выявлении солеустойчивых микроорганизмов, включающих микрококки, стафилококки, энтерококки, споровые аэробные палочки.

Для выделения среди солеустойчивой микрофлоры микрококков и стафило­кокков (каталазоположительные кокки, расположенные поодиночке, парами, непра­вильными скоплениями) необходимо:

• выполнить пробу на каталазу по 6.3;
• приготовить микропрепарат по 6.4.1.

При выявлении на молочно-солевом агаре каталазоположительных кокков, дающих при рассмотрении микропрепаратов типичную картину для стафилококков, количество которых превышает допустимую норму, определяемую для сырья, про­дукта или рассола, необходимо:

• в молоке-сырье (10⁵ КОЕ/см³) - искать источник стафилококковой инфекции (мастит);
• в рассоле (5-10⁴ КОЕ/см³) — проводить термическую или иную обработку рас­сола;
• в готовом продукте - отдавать в специализированную лабораторию для оп­ределения коагулазоположительных стафилококков.

4.6.2.17 Среда для определения пропионовокислых бактерий - плотная питательная среда, предназначенная для количественного определения пропионовокислых бактерий.

Приготовление

В (1000+50) см³ воды вносят 30 г пептона, 1 г дрожжевого автолизата, 20 г агара. Смесь тщательно перемешивают, затем нагревают и кипятят до расплавления агара, не допуская пригорания. Добавляют 20 см³ 40 % молочной кислоты. В полученной среде проверяют активную кислотность и доводят ее 20-30 % раствором гидроокиси натрия до значения (7,1 ±0,1) ед. pH. Среду перемешивают, разливают в пробирки, закрывают ватными пробками и стерилизуют при температуре (121±2) °С в течение (15±1) мин.

Рекомендации к применению

Применяют при определении пропионовокислых бактерий в производственной закваске, БК и ферментированных молочных продуктах. Пропионовокислые бактерии при росте на этой среде дают кремовые колонии в виде «дисков» и «гречишных зерен».