5.6.1 Техника посева аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (посев на чашки Петри)

Посев на чашки Петри проводят, используя твердые (плотные) питательные среды, содержащие 0,8-1,5 % агара или 10-15 % желатина, которые дают возмож­ность для роста и подсчета отдельных колоний микроорганизмов.

Для посева обычно готовят 3 стерильные чашки Петри и такое же число про­бирок с какой-либо плотной питательной средой (в зависимости от поставленной за­дачи). Затем выбирают те разведения исследуемого материала, которые должны дать десятки, сотни и тысячи колоний соответственно.

На крышках чашек Петри предварительно делают надписи восковым каран­дашом, маркером или др., отражающие следующую информацию.

• о материале (продукте), из которого сделан посев,
• о соответствующем разведении;
• о дате проведения посева.

Перед началом посева необходимо заранее подготовить соответствующим образом все необходимые материалы (чашки, пробирки, пипетки, спиртовку и т.д.), обработать спиртом рабочую поверхность стола, руки, расположить на рабочем сто­ле наиболее удобным образом материалы. Посев проводят, соблюдая правила сте­рильности.

После тщательного перемешивания соответствующего разведения стериль­ной пипеткой берут 1 см³ материала и вносят в чашку Петри, слегка приоткрывая крышку со стороны спиртовки и выдувая содержимое пипетки. Таким образом про­водят посев всех намеченных разведений.

При посеве на чашки Петри посевной материал вносят от большего раз­ведения к меньшему. В этой случае пользуются одной пипеткой.

Затем осторожно приподняв (с одного края) крышку чашки Петри, выливают расплавленную и охлажденную до 40°С питательную среду. Количество питательной среды, вносимой на одну чашку, должно составлять около 10-15 см³ .

Все операции при использовании для посевов агаровых сред необходимо проводить быстро, без задержек, чтобы избежатьь преждевременного застывания агара. Начинающим рекомендуется использовать водяную баню для поддержания температуры агаровых сред на уровне 40-45 °С.

Сразу после внесения питательной среды ее смешивают с посевным мате­риалом легким вращательным покачиванием чашки, но так, чтобы не смочить крыш­ку. Затем чашку с посевом ставят для застывания среды на горизонтальную поверх­ность.

5.6.2 Техника посева аэробных микроорганизмов

Посев аэробных микроорганизмов проводят на поверхности плотных (твер­дых) питательных сред, обеспечивая тем самым аэробные условия для их развития.

Расплавленную питательную среду разливают в чашки Петри и ставят для застывания на горизонтальную поверхность. Застывшую среду подсушивают, так как влажная поверхность ее способствует слиянию колоний. Подсушивать среду в чашках Петри рекомендуется в термостате при температуре 37-45° С, расположив открытые чашки на стерильной бумаге в перевернутом виде. Время подсушивания - 1 ч. Можно проводить подсушивание в боксе на столе при включенных бактерицидных лампах.

5.6.2.1 Для количественной оценки аэробной микрофлоры исследуемых объектов в подготовленную чашку Петри на поверхность плотной питательной сре­ды вносят 0,1-0,2 см³ исследуемого материала (объем зависит от конкретных усло­вий) и стерильным шпателем Дригальского втирают посевной материал в питатель­ную среду равномерно по всей поверхности.

5.6.2.2 Для оценки видовой (групповой) принадлежности микрофлоры, со­держащейся в материале, поверхностный посев проводят с использованием бакте­риологической петли. При этом материал на питательной среде распределяют па­раллельными штрихами по всей чашке в одном направлении. При таком способе по­сева материал, находящийся на петле, расходуется постепенно и по линиям, нане­сенным в конце посева, вырастают изолированные колонии микроорганизмов.

5.6.3 Техника посева анаэробных микроорганизмов

Для создания условий развития анаэробных микроорганизмов могут быть ис­пользованы следующие приемы:

• посев в высокий столбик питательной среды;
• культивирование посевов в анаэростатах или других устройствах, создающих анаэробные условия;
• применение специальных реагентов для создания анаэробных условий.

Посев анаэробных микроорганизмов проводят в пробирках с простерилизо­ванной питательной средой, разлитой высоким столбиком. Для анализа анаэробных микроорганизмов, как правило, используют твердые или полутвердые питательные среды.

Непосредственно перед посевом для снижения содержания свободного ки­слорода питательные среды, разлитые по пробиркам и закрытые ватными пробками, кипятят в водяной бане в течение 10-20 мин. При кипячении из среды вытесняются газообразные вещества, в том числе кислород.

Пробирки с прокипяченными питательными средами быстро охлаждают до 40 °С и используют для посева.

Засев среды проводят соответствующим разведением посевного материала пипеткой. Посевной материал при этом должен свободно стекать из пипетки без принудительного выдувания.

Для уменьшения диффузии кислорода из воздуха питательные среды можно сверху заливать стерильным вазелиновым или парафиновым маслом или водным агаром (толщина слоя 1-1,5 см).

При посеве анаэробных микроорганизмов возможно использование анаэробных инкубаторов или настольных анаэробных систем с газогенераторными пакетами.

5.6.4 Метод предельных разведений

При проведении анализов методом предельных разведений учет количества определяемой группы микроорганизмов ведется по наиболее вероятному числу (НВЧ).

Проведение анализа

Готовят ряд последовательных разведений исследуемого продукта в стериль­ной воде с таким расчетом, чтобы последние разведения не содержали учитывае­мых микроорганизмов.

Из разведений делают посевы по 1 см³ в два параллельных ряда пробирок с питательной средой. Последнее засеваемое разведение берут с таким расчетом, чтобы в нем отсутствовали определяемые микроорганизмы.

Посевы термостатируют при оптимальной температуре развития микроорга­низмов учитываемой группы. Время культивирования, необходимое для проявления признаков роста на питательной среде, также зависит от группы микроорганизмов.

Обработка результатов

НВЧ микроорганизмов определяют по количеству пробирок с признаками роста.

Сначала составляют числовую характеристику, которая состоит из трех цифр, указывающих число пробирок с признаками роста.

Первая цифра числовой характеристики соответствует тому разведению, при котором в двух пробирках есть признаки роста. Следующие цифры означают число пробирок с признаками роста в двух последующих разведениях. Выбор трех после­довательных разведений для составления числовой характеристики желательно проводить таким образом, чтобы в первом из выбранных разведений обе пробирки имели признаки роста, а в последнем разведении признаки роста в обеих пробирках отсутствовали.

По числовой характеристике таблицы 3 находят НВЧ, которое умножают на то разведение, с которого составляют числовую характеристику. Полученное число со­ответствует статистически достоверному количеству клеток бактерий в 1 г или 1 см³ продукта.