В молочной промышленности микроскопические исследования проводят при изучении микроморфологических особенностей микрофлоры молока, лабораторных и производственных заквасок, сыров на различных этапах их производства и т.д.

Атлас санитарно-показательных, технически вредных и заквасочных микроорганизмов, значимых для молока и продуктов его переработки, пред­ставлен в приложении Д.

Сущность метода

Метод основан на визуальном наблюдении микроорганизмов с помощью при боров (микроскопов), позволяющих многократно увеличивать исследуемый объект, подготовленный определенным образом.

При микроскопическом исследовании учитываются как жизнеспособные, так и нежизнеспособные клетки микроорганизмов, при этом чувствительность метода - не менее 10⁵ клеток в 1 см³ исследуемого образца.

Эффективность и объективность микроскопических исследований зависит от:

• методики подготовки объекта исследования (способ приготовления микро­препарата);
• состояния и правильности подготовки микроскопа.

Подготовка исследуемых объектов (приготовление микропрепаратов)

При контроле молочной продукции наиболее распространенными способами приготовления микропрепаратов являются следующие способы:

• способ фиксирования и окрашивания;
• способ «раздавленной капли».

Приготовление фиксированных и окрашенных микропрепаратов

Приготовление мазка

На чистое, хорошо обезжиренное, профламбированное в пламени горелки и остуженное стекло бактериологической петлей наносят каплю стерильной воды, в которую с помощью прокаленной, охлажденной бактериологической петли вносят исследуемый материал и распределяют его на площади 1-2 см² таким образом, чтобы получить тонкий равномерный мазок.

Если исследуется плотный материал (сыр и т.д.), то материал предварительно тщательно растирается со стерильной водой.

При исследовании колоний микроорганизмов, выросших на плотной питатель­ной среде, часть колонии отбирают с помощью бактериологической петли или иглы и тщательно растирают в капле воды на предметном стекле.

Приготовленные мазки высушивают при комнатном температуре на воздухе.

Фиксирование мазка

Для закрепления клеток микроорганизмов на стекле высушенные мазки фик­сируют. Для этого предметное стекло с высушенным мазком, обращенным вверх, берут пинцетом и проводят несколько раз через верхнюю часть пламени горелки с промежутками 5-6 с. Зафиксированный мазок охлаждают на воздухе.

Окрашивание мазка

Окрашивание мазков проводят после их фиксации.

Простое окрашивание:

• зафиксированный мазок помещают на подставку для окраски мазком вверх;
• пипеткой наносят раствор метиленового голубого по 4.4.2 так, чтобы покрыть весь мазок;
• по истечении 30-60 с краситель осторожно сливают;
• препарат промывают легкой струей воды, направляя струю на ребро пред­метного стекла, а не на мазок. Краску можно смывать, опуская стекло в емкость с водой;
• окрашенный мазок высушивают на воздухе;
• окрашивание мазков можно проводить с помощью специальных красящих бумажек или фильтровальной бумаги, пропитанной метиленовым голубым.

При использовании для окрашивания фильтровальной бумаги, пропитанной красителем, на сухой зафиксированный мазок наносят каплю дистиллированной во­ды, сверху кладут полоску окрашенной бумаги, наносят еще 1-2 капли воды и вы­держивают определенное время, затем бумагу осторожно убирают, препарат высу­шивают.

Окраска по методу Грама:

• зафиксированный мазок помещают на подставку для окраски мазком вверх;
• на мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают раствор кристаллческого фиолетового по 4.4.1.2. Окраску проводят в течение 1-2 мин;
• снимают бумагу, сливают избыток красителя и, не промывая препарата во­дой, наливают раствор Люголя по 4.4.1.3 на 1-2 мин до почернения препарата;
• раствор Люголя сливают. Предметное стекло погружают несколько раз в ста­канчик со спиртом, процесс обесцвечивания считается завершенным, когда от мазка перестают отделяться окрашенные в фиолетовый цвет струйки жидкости;
• препарат тщательно промывают водопроводной водой.
• препарат окрашивают в течение 2 мин водно-спиртовым раствором фуксина по 4.4.1.5.

Возможно использование вместо основного красителя (кристаллического фиолетового) готовой к использованию фильтровальной бумаги, пропитанной 1 % спиртовым раствором кристаллического фиолетового. На препарат помещают фильтровальную бумагу и наносят на нее 2-3 капли воды. Окрашивание ведут в те­чение 1-2 мин. Затем бумагу снимают и дальнейшую окраску препарата ведут обще­принятым способом.

При проведении окраски по Граму допускается использование готовых тест­наборов для окрашивания.

Микроскопическая картина грамположительных и грамотрицательных микро­организмов приведена в приложении В.

Приготовление микропрепарата способом «раздавленная капля»

На середину чистого предметного стекла бактериальной петлей наносят не­большую каплю стерильной воды или физиологического раствора.

В каплю жидкости той же петлей вносят небольшое количество исследуемого материала. Тщательно перемешивают. При приготовлении препарата из жидких культур допускается наносить каплю исследуемого материала непосредственно на предметное стекло.

Каплю осторожно накрывают покровным стеклом. Для этого одним ребром по­кровное стекло ставят на край капли, затем медленно опускают так, чтобы между стеклами не попали пузырьки воздуха. Излишек жидкости, выступающий за края по­кровного стекла, убирают полоской фильтровальной бумаги.

Правила подготовки микроскопа

В практике работы производственных лабораторий обычно используют биоло­гические световые микроскопы с окулярами и объективами с увеличением от 5^х до 40^х (без иммерсии) и с увеличением от 60^х до 100^х (иммерсионные системы); конден­сором с аппертурой 1,2-1,4; окуляр-микрометром и объектив-микрометром.

Микроскоп следует хранить в специально отведенном месте в деревянном футляре или накрытым стеклянным колпаком или пакетом из полимерной пленки.

Не допускается хранение микроскопа во влажных помещениях, в местах с резкой сменой температуры, вблизи химических реактивов.

Необходимо содержать микроскоп в чистоте и предохранять от механических повреждений.

После работы микроскоп нужно обтереть мягкой тряпкой, иммерсионное мае ло удалить с объектива и конденсора ваткой или мягкой тряпкой, смоченной бензином. Не следует использовать другие органические растворители (спирт, ацетон, эфир), т.к. они разрушают смолы, которыми склеены линзы объектива, что может привести к порче оптической системы микроскопа.

Нельзя протирать оптическую систему микроскопа бумагой или грубой тканью.

Для работы следует использовать специальные иммерсионные масла про­мышленного производства. Нельзя заменять иммерсионное масло растительным или минеральным маслом, которое портит линзу объектива.

Нельзя прикасаться пальцами к поверхности линз, т.к. на них остаются следы, нарушающие четкость изображения.

При попадании пыли на фронтальную линзу объектива или окуляра, их проти­рают мягкой тряпкой, слегка смоченной бензином. При засорении внутренней части объектива или окуляра чистку их рекомендуется проводить в специальных мастер­ских. Разбирать объектив нельзя.

Рабочее положение микроскопа на столе регулируется в соответствии с высо­той стола, стула, положением корпуса и рук исследователя.

При микроскопировании препаратов в светлом поле зрения важное значение имеет установка правильного освещения и подбор («подгонка») объектива и окуляра.

При настройке освещения конденсор поднимают (отпускают) до уровня пред­метного стекла. При этом он должен находиться в центре круглого окна столика. Ес­ли конденсор смещен в сторону, то его осторожно передвигают вращением винтов столика так, чтобы он занял правильное положение.

Диафрагма при настройке освещения должна быть полностью открыта.

В качестве источника света используют или специальные осветители, или рассеянный дневной свет. При использовании рассеянного дневного света обычно применяют плоское зеркало микроскопа. В случае освещения прямым солнечным светом целесообразно использовать белый матовый или синий светофильтр. При недостаточном естественном освещении используют вогнутое зеркало.

При использовании осветителей искусственного света их устанавливают пе­ред микроскопом на расстоянии 300-400 мм и включают в сеть. Открыв диафрагму, направляют свет на вогнутое зеркало микроскопа.

Настройку освещения проводят, используя объектив малого увеличения. Для этого поворотом револьвера устанавливают объектив с увеличением 8^х (10^х) и опус­кают его на расстояние 5-10 мм от предметного столика. Глядя в окуляр, вращая зеркало, добиваются равномерного и яркого освещения всего поля зрения.

При проведении исследований микропрепаратов при различных увеличениях пользуются разными сочетаниями окуляров и объективов. Выбор нужного увеличе­ния определяется микроскопируемым объектом, разрешающей способностью мик­роскопа, целями исследования. Обычно при изучении дрожжевых клеток и плесне­вых грибов используют объектив 40^х, для изучения бактерий применяют иммерсион­ный объектив И90 или И100.

Порядок работы

На предметный столик микроскопа помещают приготовленный препарат и за­жимают его клеммами.

Осторожно опускают с помощью макрометрического винта тубус микроскопа почти до соприкосновения объектива с покровным стеклом, а иммерсионный объек­тив погружают в каплю иммерсионного масла, нанесенного на препарат, наблюдая сбоку (глаза должны находиться на уровне предметного столика).

Нельзя опускать объектив резко и низко, тем более давить объективом на окуляр, т.к. при этом можно раздавить покровное и предметное стекло, повредить фронтальную линзу объектива. Особенно осторожно следует опускать тубус микро­скопа при работе с иммерсионной системой, т.к. рабочее расстояние между препа­ратом и объективом в этой системе составляет около 0,15 мм.

После того как тубус будет опущен, смотря в окуляр, медленно вращают мак­рометрический винт до появления в поле зрения микроскопа контура объекта (гру­бая наводка).

Наиболее четкого и резкого изображения добиваются вращением микромет­рического винта.