8.2.1  Метод индикации бактериофагов с использованием индикаторных чашек Петри 

Сущность метода

Метод основан на посеве исследуемой пробы на плотную питательную среду с индикаторными культурами, культивировании посевов при оптимальной для раз­множения тест-культур температуре и учете негативных колоний (участков отсутст­вия видимого роста тест-культур на сплошном бактериальном газоне).

А Метод «стекающей капли»

При проведении испытаний указанным методом на поверхность подготовлен­ных по 8.1.4 индикаторных чашек Петри с помощью пипетки наносят каплю исходной пробы, подготовленной по 8.1.3, наклоняют чашку так, чтобы капля стекла к противоположному краю.

Чашку Петри помещают в термостат и выдерживают при режимах, приведен ных в таблице 21.

При наличии в пробе бактериофагов, способных лизировать тест-культуры, на месте стекания капли формируются, в зависимости от количества фаговых частиц в пробе, либо сплошная зона лизиса тест-культуры, либо отдельные негативные коло­нии (точечный лизис).

При использовании данного метода может быть проведено ориентировочное определение количества фаговых частиц в пробе.

Для ориентировочной оценки вероятного количества фагов в исследуемой про­бе оценивают характер лизиса тест-культуры в «стекающей капле»:

• не обнаружено видимого лизиса и негативных колоний - бактериофаг, спо­собный лизировать тест-культуру, либо отсутствует в исследуемой пробе, либо его количество менее 1 фаговой частицы в 1 см³ пробы;
• в «стекающей капле» пробы содержится до 10 негативных колоний - титр бактериофагов в пробе составляет 10³-10⁴;
• в «стекающей капле» формируется зона сплошного лизиса - вероятный титр бактериофагов в пробе 10^е и более.

Б Метод «капли»

Дно каждой из подготовленных чашек Петри по 8.1.4 с тест-культурами, с на­ружной стороны, делят на сектора или квадраты. В каждый сектор (квадрат) на по­верхность газона тест-культуры с помощью пастеровской пипетки с оттянутым кон­цом или бактериологической петли диаметром 2,0-2,5 мм (или стеклянной палочки с оттянутым концом или репликатором) наносят каплю исследуемой пробы.

При этом петлю (или стеклянные папочки) после каждого нанесения иссле­дуемого материала прожигают, а пипетки меняют на новые.

Посевы выдерживают в термостате при оптимальных режимах (таблица 21) и отмечают те пробы, на месте нанесения которых образовалась негативная колония, свидетельствующая о наличии в пробе фага, лизирующего тест-культуру.

8.2.2 Методы индикации бактериофагов с использованием индикаторных пробирок

Сущность метода

Метод основан на посеве исследуемой пробы в жидкую питательную среду с индикаторными культурами, культивировании посевов при оптимальной для раз­множения тест-культуры температуре и выявлении задержки или отсутствия роста тест-культуры по отсутствию признаков роста (помутнение среды, образование сгу­стка, изменение кислотности и т.д.).

А Обнаружение бактериофагов с использованием в качестве питатель­ной среды бульона из гидролизованного молока

При проведении исследований в пробирки с (10,0+1,0) см³ гидролизованного молока вносят бактериологической петлей (диаметром 2 мм) рабочие или активизи­рованные тест-культуры, или суспензию тест-культур.

В пробирки вносят по 1-2 капли подготовленной пробы по 8.1.3.

В контрольные пробирки с разными тест-культурами (которые служат для кон­троля за ростом тест-культур) вносят по 1-2 капли стерильной воды или физиологи­ческого раствора.

Пробирки термостатируют при оптимальной для роста тест-культур темпера­туре (таблица 21), наблюдая за ростом культуры (помутнением среды) через 4, 6, 10 и 24 ч.

Учет результатов проводят только при наличии роста тест-культур в контроль­ных пробирках (помутнение среды).

Отсутствие или задержка роста тест-культур по сравнению с контролем сви­детельствует о наличии в испытуемой пробе бактериофага, способного лизировать ту или иную тест-культуру.

Примечания

• Воздействие бактериофага на тест-культуру в гидролизованном молоке может про­являться в первоначальном нормальном развитии тест-культуры в опытной пробирке (по­мутнение питательной среды в первые 3-5 ч) с последующим просветлением культуральной среды.
• Контроль за развитием тест-культур может быть осуществлен как визуально, так и по оптической плотности, определяемой с помощью ФЭК или другой спектрофотометриче­ской аппаратуры.         

• Для подтверждения присутствия бактериофага в исследуемой пробе из опытной пробирки делают высев и испытания на плотных питательных средах по одному из методов 8.2.1.

Б Обнаружение бактериофагов с использованием в качестве питательной среды стерильного молока

В колбы с (95,0±5,0) см³ стерильного молока вносят по 0,1-0,2 см^-' тест­культур и тщательно перемешивают круговыми движениями. В колбы, шифрованные как опытные, добавляют по (10,0+1,0) см³ пробы, подготовленной по 8.1.3. В колбы, шифрованные как контрольные, вносят по (10,0+1,0) см³ стерильной воды.

Контрольные и опытные колбы помещают в термостат и выдерживают при оп­тимальной для жизнедеятельности тест-культур температуре (таблица 21), опреде­ляя титруемую кислотность молока через 0 (исходная), (6,0±0,5) ч, (12,0+1,0) ч и (22,0±2,0) ч, рассчитывая прирост титруемой кислотности (ΔТ) за указанные выше промежутки времени (т.е. за 6 ч - ΔТ₆; за 12 ч - ΔТ₁₂; и за 22 ч - ΔТ₂₂ по формуле ΔТi = Ti-To,

где ΔТi - прирост титруемой кислотности за определенный промежуток времени (i), °Т;

Тo - исходная титруемая кислотность, °Т;

Ti - титруемая кислотность через i ч, °Т.

Достоверное торможение кислотообразования тест-культур в опытных колбах (или в одной из опытных колб) по сравнению с соответствующими контрольными свидетельствует о наличии в исследуемой пробе бактериофага к тест-культуре.

Торможение считается достоверным, если различия в приросте титруемой ки­слотности в контрольной и опытной колбах составляют через (6,0+0,5) ч - не менее 3 °Т, через (12,0+1,0) ч - не менее 5°Т, через (22,0+2,0) ч - не менее 8 °Т.

Предварительно учет результатов проводят через (6,0+0,5) ч. При получении недостаточно четких результатов (близких к критическим) опытные и контрольные колбы выдерживают еще 6 ч, а при необходимости - до 24 ч.

Для подтверждения наличия бактериофага в опытных колбах проводят иссле­дования одним из методов по 8.2.1 с использованием индикаторных чашек с теми же тест-культурами.