Ферменты являются биологическими катализаторами белковой природы. Реакции, катализируемые фермента­ми, протекают в мягких условиях (в отношении pH и температуры), с большой скоростью и избирательно­стью. Очень незначительные изменения в строении или пространственной конфигурации молекул субстрата мо­гут сделать его. невосприимчивым к действию фермента [И, 43]. Ферментативные свойства молекулы ферментно­го белка, его активность и специфичность зависят ог определенной части этой молекулы, которую обозначают обычно термином «активный центр». Активный центр состоит из ряда функциональных групп, определенным образом ориентированных в пространстве. Он представ­ляет собой структуру, приспособленную для тесного сближения и взаимодействия с молекулой субстрата. Однако отграничение активного центра, как такового, от остальных частей молекулы фермента носит доволь­но относительный характер, так как эти части играют роль в обеспечении трехмерной конформации активного центра и влияют на реакционную способность его групп [И]-, Учитывая специфичность действия ферментов, пред­ставлялось возможным применить определенные фермен­ты для гидролиза именно тех веществ пива, которые вызывают помутнение. Поскольку вначале доминирую­щую роль в процессе помутнения приписывали белкам, то исследования в области применения ферментов для стабилизации пива проводили в направлении поиска и изучения протеолитических ферментов. Поэтому подав­ляющее большинство работ в этой области касается применения ферментов, гидролизующих белки (поли­пептиды).

Рис. 30. Схема действия пептид-гидролаз.

Ферментативный гидролиз белков (полипептидов). Протеолитические ферменты (пептид-гидролазы) ката­лизируют гидролиз пептидных связей —СО—NH—. Они подразделяются на эндопептидазы (пептид-пептид-гид- ролазы) и экзопептидазы [37]. Первые гидролизуют связи внутри молекулы белка, переводя ее в довольно высо­комолекулярные полипептиды, вторые воздействуют на терминальные пептидные связи с отделением от моле­кулы белка определенных аминокислот. В зависимости от того, где происходит гидролиз пептидной связи: около концевой карбоксильной или аминной группы, экзопептидазы подразделяются на карбоксипептидазы и аминопептидазы (рис. 30). Большинство протеолити­ческих ферментов гидролизует преимущественно связь между строго определенными- аминокислотами. Так, трипсин гидролизует только те пептидные связи, кото­рые образованы при участии карбоксильных групп ами­нокислот лизина или аргинина.

Ферментные препараты применяются для стабилиза­ции пива довольно давно [71]. В 1911 г. Валлерстейн получил ряд патентов на применение для стабилизации пива препаратов протеолитических ферментов, активных в слабокислой среде. Он использовал препараты из со­лода и поджелудочной железы животных, а также папаин и бромелин, к протеолитическим препаратам добавлял особым образом приготовленный водны!/ рас­твор лупулина [71].

В настоящее время за рубежом производится и при­меняется (там, где это разрешено) значительнее число различных препаратов-стабилизаторов [179]: Чилко— фирма «Зибель» (США); Коллупулин — «Валлерстейн» (США); Кристаллаза — «Интерекс» (ФРГ); Мальтоли­зин—«Байрол» (ФРГ); Протезал — «Шварц» (США); Симбиаза — «Интермаг» (ФРГ); Стабилозим— «Бай­рол» (ФРГ). Некоторые из этих препаратов содержат животные протеазы, но большинство приготовляется с использованием растительных протеолитических фермен­тов: папаина, бромелина и фицина. Из протеаз живот­ного происхождения используют пепсин (3.4.4.1) [37] — фермент желудочного сока с молекулярной массой 34 400. Расщепляет он главным образом белки (протеи­ны), являясь эндопептидазой. Пепсин активен в кислой среде (оптимум pH 1,5—2,0), на белки пива действует главным образом при пастеризации, при низкой темпе­ратуре действие его незначительно.

Наиболее широко в промышленных препаратах-ста­билизаторах используются растительные протеиназы типа папаина (3.4.4.10) [37]. Этот фермент находится в млечном соке плодов дынного дерева Carica papaja, откуда и получил свое название. Папаин активен в сла­бокислой, нейтральной и щелочной средах (оптимум pH 5,0—6,5). Молекулярная масса его 20 700. Папаин получен в кристаллическом виде. В настоящее время строение молекулы папаина довольно хорошо изучено, установлена первичная структура молекулы, т. е. после­довательность аминокислот. Молекула папаина состоит из 212 аминокислотных остатков, содержит 3 дисуль­фидных мостика и одну сульфгидрильную группу. Для ферментативной активности папаина нужны не все ами­нокислоты, входящие в молекулу. Показано, что можно удалить из нее 120 аминокислот и ферментативная ак­тивность не будет потеряна [41].

Отличительной особенностью ферментов типа папаи­на является их способность увеличивать свою актив­ность (активироваться) различными восстанавливающи­ми агентами (цианиды, сероводород, сульфгидрильные соединения) и инактивироваться окисляющими агента­ми (перекись водорода, йодацетат и др.).

При окислении папаина происходит, очевидно, сое­динение двух молекул белка через дисульфидную связь активного центра. Восстановление приводит к образо­ванию сульфгидрильной группы, что переводит фермент в каталитически активное состояние. Папаин гидролизу­ет белки, пептиды, естественные и синтетические амиды и эфиры аминокислот, особенно по связям между основ­ными аминокислотами — аргинином и лизином, а также между лейцином и глицином. Поэтому различные белки в зависимости от содержания в них этих аминокислот могут гидролизоваться с различной интенсивностью.

В пивоварении папаин целесообразно вносить в ла­герный танк при дображивании, так как низкое значе­ние гН, устанавливающееся в пиве к концу этого перио­да, создает условия для активации фермента восстанав­ливающими веществами, имеющимися в пиве. Однако часто папаин добавляют в специальный танк после предварительной фильтрации пива, а более чистые, хо­рошо растворимые препараты можно вносить в сборник фильтрованного пива. Последнее возможно еще и по­тому, что многие препараты на основе папаина содер­жат в своем составе необходимые активаторы.

Японские исследователи [135] сообщили о способно­сти папаина свертывать белки пива. На свертывающую способность папаина влияют температура пива (или модельных растворов) и продолжительность действия. О наличии свертывающей активности судили по увели­чению мутности раствора. В опытах Окада и Ашида [175] мутность растворов, содержащих выделенные и очищенные белки солода, сначала увеличивалась (до 1 мин), а затем падала. Эти исследователи полагают, что соединение папаина с белками (солодовый белок, казеин, яичный альбумин) обусловлено различием их зарядов: папаин в пределах pH 4,3—7,0, где происходит наиболее сильное свертывание, заряжен положительно, белки — отрицательно, что объясняется различием их изоэлектрических точек (папаин — 8,5, казеин — 4,6).

При внесении содержащих папаин препаратов, так же как и других протеолитических препаратов, приме­няемых для стабилизации пива, Необходимо избегать слишком больших доз. Де Клерк подчеркивает, что ферменты в больших дозах сами могут отрицательно влиять на коллоидную стойкость.

В табл. 51 приведены данные Драверта и др. [109] о зависимости стойкости пива к холодному помутнению от дозы препарата.

Т а б л и ц а 51 Зависимость стойкости пива от дозы препарата

Из данных табл. 51 видно, что оптимальное действие оказывает препарат в дозе 0,1 мг. С увеличением дозы интенсивность действия препарата снижается. Анало­гичные данные получены и другими исследователями (Вайсслер и Гарза, Покровская, Кислякова и др.) [64, 242].

Доза препаратов, содержащих папаин, зависит от чистоты препарата. Обычно промышленные препараты используются в дозе 2—10 г/гл пива.

Бергман [86] указал,- что при приготовлении суспен­зии препарата необходимо уменьшить возможный кон­такт с воздухом или добавить к воде небольшое коли­чество (0,1%) метабисульфита натрия для уменьшения окислительной инактивации.

Действие протеолитических ферментных препаратов тем эффективнее, чем лучше осветлено пиво. Поэтому их, так же как и адсорбенты, целесообразно добавлять к пиву после предварительной фильтрации по схеме, приведенной на с. 170.

К числу растительных протеолитических ферментов, применяемых для стабилизации пива, относятся препа­раты протеаз из солодовых ростков, полученные во ВНИИПБПе [44].

Валлерстейн отмечает, что препараты микробной природы можно также с успехом применять для стаби­лизации пива [71].

Получение ферментных препаратов путем культиви­рования микроорганизмов — значительно более простой способ, чем выделение ферментов из растительного или животного сырья. Быстрое размножение микроорганиз­мов, использование ими простых, дешевых питательных сред, исключительная пластичность этих организмов привели к тому, что все больше ферментных препаратов производится с использованием культур микробов. Мно­гие бактерии и плесневые грибы образуют вне- и внутри­клеточные протеазы, имеющие различное строение и действие, а также, что особенно важно, различную способность гидролизовать разные белки. Последнее за­висит от способности фермента преимущественно ата­ковать связи между определенными аминокислотами в белковых молекулах.

Гидролиз различных субстратов, например казеина, желатина, альбумина, гемоглобина и других белков, протекает неодинаково при действии различных препа­ратов. Активность папаина, фицина, бромелина, бакте­риальной и грибной протеиназ, измеренная по измене­нию вязкости раствора желатина, резко отличается от активности, определенной на казеине. Еще больше пре­параты протеолитических ферментов различаются по интенсивности гидролиза белков растительного и живот­ного происхождения [6, 64].

Протеолитические ферменты микроорганизмов тлеют широкий спектр свойств. Поэтому среди ферментов мож­но найти такие, которые будут гидролизовать только те полипептидные соединения пива, которые участвуют в образовании коллоидной мути, не затрагивая другие, необходимые для пенистых свойств и полноты вкуса пива.

Японские исследователи [214] разработали метод «скриннинга», т. е. быстрого, отсеивающего анализа на способность микроорганизмов продуцировать протеазы, снижающие или предотвращающие появление в пиве коллоидного помутнения. Они проверили большое число, в основном японских, протеолитических препаратов на их способность предотвращать помутнение пива на хо­лоде. Проверка показала, что, несмотря на высокую протеолитическую активность, определенную на казеине и гемоглобине, препараты животного и микробного про­исхождения не проявили способности стабилизировать пиво. Авторы считают, что эти ферменты не способны атаковать полипептиды пива, участвующие в образова­нии сложных комплексов. Из 1670 штаммов различных микроорганизмов они выявили 38 штаммов, обладаю­щих способностью продуцировать соответствующие про­теазы. Наиболее сильно образовывали ферменты не­сколько видов Pseudomonas и некоторые штаммы Serratia marcescens (Bacterium prodigiosum). Остальные виды бактерий, плесневые грибы и актиномицеты такой способностью не обладали. Однако, по нашему мнению, методические детали проведения этих исследований ста­вят под сомнение категоричность полученных выводов. Поиск эффективных для стабилизации пива препаратов микробной поироды продолжается во многих странах [15, 26, 64, 87].

Большое внимание обращается на культуры плес­невых грибов, особенно Asp. oryzae. При выращивании штаммов этого гриба поверхностным способом на отру­бях или глубинным способом на средах различного простого состава образуется целый набор протеолити­ческих ферментов. Поэтому попытки использовать куль­туру этого гриба для получения стабилизаторов пива [17] продолжаются. Другие плесневые грибы также об­разуют ферменты, гидролизующие полипептиды пива. В табл. 52 приведены результаты обработки пива пре­паратами из культур различных микроорганизмов [41].

Под влиянием препаратов из культур Asp. oryzae, Asp. flavus и Asp. terricola сильно уменьшалась фрак­ция высокомолекулярных полипептидов пива и увеличи­валась фракция пептидов средней молекулярной массы (фракция В). Пепсин в этих опытах действовал слабо, а препарат из культуры Вас. mesentericus почти не оказывал никакого влияния.

Протеолитические ферменты гриба Asp. oryzae изу­чались многими авторами. Движение [3] установил на­личие в неочищенном препарате из поверхностной культуры этого гриба пять протеолитических фракций с оптимумом pH 4,5—5,0—7,2—10,0. Фракции различа­лись по способности к гидролизу синтетических ди- и трипептидов. Одна фракция сильно расщепляла глицил- глицин, другая — глицил-фенилаланин, глютаминил- аспарагин и а-аланил-глицил-глицин, третья — глицил- тирозин и а-аланил-глицил-глицин. Остальные 2 фрак­ции почти не расщепляли испытанные пептиды. Эти данные могут указывать на преимущественные точки гидролиза белковых молекул ферментами Asp. oryzae. Молекулярная масса выделенных фракций колебалась от 26 000 до 89 000. Но не все фракции обладали спо­собностью гидролизовать полипептиды пива (табл. 53).

Влияние ферментных препаратов микробного происхождения на азотистые вещества пива

Только одна из фракций (IV) проявила способность значительно снижать величину фракции А и увеличи­вать время хранения пива на холоде без помутнения.

На способность грибов Asp. oryzae синтезировать кислые, нейтральные и щелочные протеазы (по оптиму­му pH для их действия) указывают и многие другие исследователи.

Действие фракций препарата из культуры Asp. oryzae на полипептиды пива [4]

Протеиназы бактериальной природы, как правило, более термостойки по сравнению с грибными, и оптимум pH их активности сдвинут несколько в щелочную сторо­ну (6,5—8,0). Наиболее изучены и применяются фермен­ты, образуемые бактериями Вас. subtilis и Вас. mesen- tericus [5].

В Японии фермент, придающий пиву холодоустойчи­вость, выделен из культуральной жидкости бактерии Serratia marcescens В 103. Молодое пиво хранили с раствором фермента при 0°С в течение 30 дней. Было установлено, что способность фермента стабилизировать пиво сходна с действием папаина [87].

Препараты, вносимые в готовое пиво для его стаби­лизации, не должны, по возможности, содержать боль­шого количества других ферментов, помимо протеоли­тических. Однако промышленная выработка таких чис­тых препаратов сложна и дорога, поэтому обычно при­меняются препараты, частично освобожденные от клеток продуцентов, остатков питательной среды и некоторых метаболитов. Тем не менее все препараты содержат в большей или меньшей степени целый комплекс различ­ных ферментов.

Во ВНЙИПБПе [62] было установлено, что некото­рые грибные препараты, особенно Амилоризин ШОх и Г Юх, гидролизуют полисахариды и полипептиды сусла и пива как при высокой (50° С), так и при низкой (6° С) температуре. В результате гидролиза препаратами оли­госахаридов и декстринов до глюкозы и частично до мальтозы значительно повышается конечная степень сбраживания сусла (рис. 31, 32).

В дальнейшем изложении препараты, содержащие комплекс фер­ментов (главным образом а- и (5-глюкозидазы и глюкоамилазы), под действием которых из олигосахаридов и декстринов сусла образуют­ся сбраживаемые сахара, будут для краткости называться сахароген­ными препаратами.

Многочисленные опыты, проведенные в лаборатор­ных и производственных условиях (на Москворецком пивоваренном заводе), показали, что пиво, полученное с использованием препаратов Амилоризин П10х и Ами- лоризин Г Юх, содержит больше спирта и меньше дей­ствительного экстракта; оно, как правило, лучше освет­лено и имеет хорошие органолептические качества. 

Рис. 31. Изменение редуцирующей способности раствора декстри­нов сусла под влиянием ферментных препаратов:

/ — Амилоризин ПЮх; 2 — Амилоризин ГЮх; 3 — Амилосубтилин ГЮх. Сплошная линия — при /=«50° С и продолжительности в часах; пунктирная — при /=6" С и продолжительности в сутках.

Рис. 32. Изменение конечной степе­ни сбраживания сусла в зависимо­сти от дозы препаратов.

Эти препараты были рекомендованы ВНИИПБПом для по­вышения сбраживаемости сусла (61, 63].

Поскольку таниновый показатель в опытном пиве был ниже, чем в контрольном, в последующей работе изучалось главным образом влияние ферментных пре­паратов на показатели, характеризующие коллоидную стойкость пива. Было испытано около 20 различных грибных и бактериальных препаратов на их способность понижать в пиве содержание высокомолекулярных по­липептидов и предотвращать или снижать интенсив­ность помутнения пива на холоде (при 0°С).

Многие исследователи отмечают, что для оценки действия протеолитических препаратов на пиво обычные методы анализа, такие, как фракционирование по Лун­дину, высаливание сульфатом аммония или магния, определение коагулируемого азота или других фракций азотистых, веществ, малопригодны. Единственным тес­том, который дает наиболее правильную информацию о склонности пива к помутнению и, тем самым, о его стойкости, является определение интенсивности помут­нения пива на холоде (при 0° С).

Рис. 33. Влияние фермент ых препа­ратов на таниновый юказатель пива:

1 — контроль; 2 — Глюкоамилаза; 3 — Кол- лупулин; 4 — Амилоризин ГЮх; 5 — Прото- субтилин ГЮх; 6 — Амилоризин П10х; 7 — Чилко.

Обычно с этой целью используют так называемые ускоренные тесты (см. с. 247). Для оценки содержания в пиве высокомолеку­лярных полипептидов во ВНИИПБПе использовали бы­стрый и достаточно точный метод, разработанный там же (см. с. 235) и основанный на способности полипептидов образовывать осадок с танином. Этот метод особенно удобен для быстрой оценки препаратов при их отборе. Метод позволяет выявить наиболее опасную для колло­идной стойкости фракцию полипептидов, т. е. фракцию, чувствительную к танину (к полифенолам).

В табл. 54 приведена ферментативная активность (в ед./г) некоторых испытанных препаратов (активность Чилко указана в ед./мл).

Данные табл. 54 показывают комплексную природу всех препаратов, причем протеолитическая активность их, определенная на казеинате натрия при pH 5,0, ко­лебалась от 4,3 до 320 ед./r. Взятые для сравнения импортные стабилизаторы Коллупулин и Чилко облада­ли невысокой протеолитической активностью, чем боль­шая часть других препаратов. На рис. 33 приведена ди­намика снижения танинового показателя пива при дей­ствии некоторых ферментных препаратов.

Рис. 34. Влияние дозы препарата на таниновый показатель и хо­лодное помутнение пива в ускоренном тесте:

1 — Протосубтилин ГЮх; 2 — Амилоризин ШОх; 3 — Глюкоамилаза;-- таниновый показатель.- величина холодного помутнения.

На рис. 34 показана зависимость танинового пока­зателя и интенсивности холодного помутнения пива от дозы препаратов. Из рис. 33—34 видно, что многие фер­ментные препараты, как грибные, так и бактериальные, вызывают снижение в пиве количества высокомолеку­лярных полипептидов, чувствительных к танину. Однако интенсивность холодного помутнения изменяется не па­раллельно снижению количества этих полипептидов, от­четливой корреляции между двумя этими показателями нет. На рис. 34 видно, что в то время как таниновый показатель с увеличением дозы препарата постепенно снижается, интенсивность холодного помутнения снача­ла понижается, а затем повышается. Это говорит о том, что существует оптимальная доза препаратов, выше ко­торой их эффективность снижается.

Наблюдаемая закономерность может быть следстви­ем как уже упоминавшегося проявления белковой при­роды самих вносимых ферментов, так и того, что наря­ду с протеолитическими ферментами препараты содер­жат другие ферменты, под действием которых увеличи­вается мутность.

Особенно сильное помутнение в условиях лаборатор­ных опытов вызывали препараты Амилоризина, причем это действие было неодинаково в разных опытах. В табл. 55 приведены результаты двух опытов, отли­чавшихся условиями проведения ускоренного теста: в одном пиво выдерживалось 5 сут при 55° С, затем на сутки помещалось при 0° С, во втором перед помещени­ем на 24 ч при 0°С пиво выдерживали при температуре 55° С всего 2 сут.

Таблица 5.5

Влияние Амилоризина ПЮх на таниновый показатель и интенсивность холодного помутнения, пива в ускоренных тестах

Из данных табл. 55 отчетливо видно увеличение по­мутнения пива с повышением дозы препарата, несмотря на снижение танинового показателя. Для выяснения вопроса о влиянии на помутнение белка самого препарата была проведена специальная проверка с добавлением различных доз препарата Ами­лоризина к обычному жигулевскому пиву и к пиву им­портному, очень стойкому (вероятно, стабилизированно­му). Образцы пива с препаратом исследовались по уско­ренному тесту.

Таблица 56. 

Влияние Амилоризина ПЮх на помутнение пива

 В табл. 56 приведены результаты проверки. 

Проверка показала, что белок препарата незначи­тельно усиливает помутнение пива (1,5 ед. ЕВС в им­портном пиве при внесении препарата в дозе 10 мг/100 мл). Резкое увеличение мутности жигулев­ского пива при добавлении такой же дозы препарата обусловлено, очевидно, сопутствующим действием.

Как показали многочисленные опыты, увеличение мутности при использовании препаратов Амилоризин ПЮх и Амилоризин Г Юх объясняется происходящими под влиянием этих препаратов окислительными процес­сами. Например, добавление к пробе пива Амилоризина и некоторых других препаратов совместно с препарата­ми глюкозооксидазы значительно снижало интенсив­ность холодного помутнения (табл. 57).

Таблица 57

Влияние глюкозооксидазы на стабилизирующее действие препаратов

* Доза препарата в мл/100 мл.

Из данных табл. 57 видно, что добавление глюко­зооксидазы почти не оказывает какого-либо влияния на таниновый показатель пива, но снижает интенсивность холодного помутнения, особенно сильно в случае при­менения Амилоризина ПЮх и Протосубтилина ГЮх.

Определение активности полифенолоксидазы в этих препаратах по методу Штайнера в модификации Нар­цисса и Сёкина [166] с пирокатехином в качестве суб­страта подтвердило предположение о наличии во многих грибных и бактериальных препаратах ферментов, окис­ляющих полифенолы.

Таким образом, при отборе препаратов для стабили­зации пива против коллоидного помутнения необходимо производить проверку препаратов не только на протео­литическую активность, но и на содержание в них окис­лительных ферментов типа полифенолоксидаз. При на­личии таких ферментов необходима дополнительная очистка препаратов от оксидаз или обязательное приме­нение одновременно с препаратом какого-либо антиок­сиданта. Недоучет этого обстоятельства часто снижает значимость исследовательских работ по подбору фер­ментных препаратов для стабилизации пива.

В обычных препаратах-стабилизаторах всегда со­держится некоторое количество окислительных фермен­тов. Поэтому при использовании ферментных препара­тов необходимо, как подчеркивают многие исследова­тели, принимать меры предосторожности против кон­такта пива с воздухом. Отрицательное действие на стойкость пива окислительных ферментов, содержа­щихся во многих препаратах-стабилизаторах, может проявляться не всегда, а только в тех случаях, когда пиво содержит много воздуха и большое количество полифенолов типа полигидроксифлаванов, особенно легко подвергающихся окислительной полимеризации. От присутствия в препаратах-стабилизаторах окисли­тельных ферментов зависит способ их применения: такие препараты опасно вносить в фильтрованное пиво, их надо добавлять или в начале брожения или в моло­дое пиво во время перекачивания.

Ферментативный гидролиз углеводов. В работе [64] было установлено сильное стабилизирующее действие препарата Глюкоамилазы фирмы «Рапидаз». Это мож­но было объяснить гидролизом декстринов, что могло привести к повышению стойкости. Однако, помимо сни­жения интенсивности холодного помутнения, этот пре­парат приводил к очень сильному уменьшению танино­вого показателя, т. е. производил гидролиз высокомо­лекулярных полипептидов, несмотря на то, что при оп­ределении на казеине он не обнаружил протеолитиче­ской активности.

Проверка нескольких других препаратов глюкоами­лаз показала, что, несмотря на очень сильное расщеп­ление декстринов пива, эти препараты не снижали та­ниновый показатель пива и почти не уменьшали интен­сивность холодного помутнения (табл. 58).

Таблица 58

Коллоидная стойкость пива, обработанного глюкоамилазами [36]

Продолжение табл. 58

Примечание. Буквой А обозначен препарат Глюкоамилаза фир­мы «Рапидаз», остальными буквами обозначены препараты из культур Endomycopsis.

Эти данные заставляют предположить, что стабили­зирующий эффект препарата Глюкоамилазы фирмы «Рапидаз» обусловлен в основном наличием в нем про­теолитических ферментов, гидролизующих растительные белки.

Исследование, проведенное во ВНИИПБПе, показало, что при подборе ферментных препаратов для стабили­зации пива необходимо не только принимать во внима­ние наличие в них ферментов, окисляющих полифенолы, но и учитывать протеолитическую активность по спо­собности препаратов гидролизовать высокомолекуляр­ные полипептиды растительного происхождения.

Протеолитическая активность, определенная на бел­ках животного происхождения, не может быть основа­нием для дозировки препаратов по единицам этой ак­тивности. Эффект действия препаратов нужно оценивать по интенсивности холодного помутнения.

Проверка различных препаратов в производственных условиях. В результате многочисленных исследований ВНИИПБПа в качестве наиболее перспективных стаби­лизаторов отобраны следующие препараты: Протосуб- тилин Г10х, Глюкоамилаза фирмы «Рапидаз», препарат из Asp. oryzae А-4, полученный Татаренко в УкрНИЙППе, и Амилорпзины ШОх и ГЮх. Эффектив­ность двух последних препаратов может быть повышена после дополнительной очистки или при использовании в сочетании с антиоксидантами.

Добавление Амилоризина ШОх в дозе 1 г/гл в начале брожения совместно с глюкозооксидазой (0,5 г/гл.), вно­симой при розливе, позволило в производственных усло­виях на Москворецком пивзаводе получить пастеризо­ванное пиво, остававшееся прозрачным 5 мес, в то вре­мя как контрольное помутнело уже через 2 мес. Стой­кость пива, обработанного одним Амилоризином, соста­вила 3,5 мес.

В работе Ежова и др. {26] показана возможность по­вышения коллоидной стойкости пива в 2 паза с по­мощью четырех ферментных препаратов: Проторизин ШОх, Амилоризин ШОх, Гигролитин Б, Протосубтилин ГЮх. Препараты в дозе 2—3 г вносили в сусло темпе­ратурой 30° С на 30 мин, затем сусло охлаждали и за­севали дрожжами.

Веселовым и Грачевой с сотрудниками для повыше­ния коллоидной стойкости пива применен препарат кислой протеиназы из культуры гриба Asp. oryzae 8Fj. Препарат добавляли в молодое пиво в дозе 5 г/гл перед перекачиванием в лагерный подвал. Количество высо­комолекулярных белков в опытном пиве снижалось поч­ти в 1,5 раза. Стойкость непастеризованного пива, про­шедшего обеспложивающую фильтрацию, увеличилась в 2—3 раза по сравнению с контрольным [19].

Михайловская и Середина [47] проводили испытания двух грибных препаратов — Амилоризина ШОх и Про­тотерризина ШОх, выработанных Московским опытным заводом ферментных препаратов. Опыты проводили в производственных условиях на нескольких заводах, при­чем препараты вносили в дозах 0,2—0,4 г/гл или в мо­лодое пиво при перекачивании, или в сборник. Увели­чение доз не усиливало стабилизирующего действия, но отрицательно сказывалось на ценообразовании. Конт­рольное пиво содержало от 15 до 24,5 мг/100 мл азота фракции А по Лундину, и стойкость его составляла 1—2 мес. В опытном пиве фракция А уменьшалась на 7—45%, а стойкость повышалась до 2—3,5 мес. В сред­нем по 20 опытам повышение стойкости пастеризован­ного пива составило 38% от контроля.

Основная опасность при использовании ферментных препаратов-стабилизаторов протеолитического действия состоит в том, что недостаточно специфичный и слишком глубокий гидролиз высокомолекулярных полипептидов может приводить к ухудшению пенистых свойств. Сле­довательно, необходимо найти такую дозу каждого кон­кретного препарата и условия его действия (продолжи­тельность, температура), при которых будет проходить ограниченный, но специфичный гидролиз только тех полипептидов, которые участвуют в образовании кол­лоидной мути.

Многие ферменты не полностью инактивируются при пастеризации пива и могут продолжать действовать во время хранения разлитого пива [123]. Было установле­но, что довольно значительная активность сохраняется после выдержки пива при 75° С: в течение 5 мин оста­ется 77—87% первоначальной активности; в течение 15 мин — 23—70%; в течение 30 мин—12—45% (в за­висимости от дозы).

Остающаяся активность во время хранения пива может привести к слишком глубокому гидролизу и ухудшению пенистых свойств. Поэтому представляется перспективным применение для стабилизации пива пре­паратов нерастворимых, так называемых иммобилизо­ванных ферментов.

Применение препаратов иммобилизованных фермен­тов. В таких препаратах фермент фиксирован на опре­деленном нерастворимом носителе, причем связь фер­мента с носителем настолько прочная, что фермент не переходит в жидкую фазу, но сохраняет свои катали­тические свойства.

Для иммобилизации используются различные типы связи фермента с носителем: 1) чисто физическая ад­сорбция ферментов на носителях (пористое стекло, дре­весный уголь, целлюлоза, синтетические ионообменные смолы, диатомит, бентонит и др.); 2) включение в гель полимера — полиакриламида или кремниевой кислоты; 3) ковалентное связывание ферментов с би- или поли- функциональными веществами — непосредственно или после активирования поверхности носителя. В качестве носителей используются пористое стекло, силикагель, коллоидный кремнезем, карбоксиметилцеллюлоза, ами- ноалкилцеллюлоза, полимеризаты малеиновой кислоты, дериваты акриламида, полиаминостирол. По мнению большинства исследователей, именно ковалентное свя­зывание ферментов представляется лучшей формой им­мобилизации; 4) микрокапсулирование; 5) закрепление фермента на клеточной стенке микроорганизмов посред­ством ковалентной связи между активными группами ферментного белка и маннаном клеточной стенки при участии солей тяжелых металлов.

Активность иммобилизованных ферментов и воз­можность их практического использования зависят как от формы связи, так и от физико-химических свойств носителя. Для успешного превращения высокомолеку­лярных субстратов большое значение имеет пористость носителя. По мнению Гаина и др. [70], для пищевой промышленности необходимо ориентироваться на разра­ботку высокопористого, механически прочного стекла с достаточным числом реакционных групп и недорогой технологией производства, а также на использование полимерных носителей, устойчивых к микробиальной атаке и не снижающих гигиенических свойств про­дуктов.

Фиксированные на носителе ферменты могут не­сколько, изменять свои свойства в отношении термостой­кости, температурного оптимума действия, оптимума pH и т. д. Наиболее важным изменением является повыше- дне стабильности ферментов, которое и придает им со­вершенно новое качество — пролонгированность дейст­вия. Активность иммобилизованных ферментов остается высокой при хранении в соответствующих условиях в течение нескольких лет.

Необходимо отметить, что при иммобилизации зна­чительная часть активности фермента теряется и в по­лученном комплексе остается примерно 30% активности, иногда и значительно меньше. Неправильный подбор условий иммобилизации может привести к полной инак­тивации ферментов на носителе, что может быть свя­зано с конформационными изменениями молекулы фер­ментного белка, экранированием активного центра фер­мента или высоким диффузионным сопротивлением, за­трудняющим контакт фермента и субстрата. Несмотря на эти трудности, а также на сложность аппаратурного решения гетерогенного катализа, иммобилизованные ферменты начинают находить практическое применение. В настоящее время имеются публикации и патенты о применении иммобилизованных ферментов для разжи­жения и осахаривания крахмала, изомеризации глюко­зы во фруктозу, инверсии сахарозы. Подробный обзор по иммобилизованным ферментам и их применению в пищевой промышленности, в том числе и в пивоварении, опубликован Гаина и др. [70].

Некоторые исследователи [248, 252] предлагают ис­пользовать иммобилизованную амилоглюкозидазу для повышения сбраживаемости сусла, иммобилизованные протеолитические ферменты — для гидролиза полипеп­тидов пива с целью повышения его коллоидной стой­кости.

Драверт с сотрудниками [109] приводят результаты испытания иммобилизованного папаина — энцигеля па­паина (Boeringer Mannheim) для повышения коллоид­ной стойкости пива. В качестве носителя в этом препа­рате использован сополимеризат акриламида, N.N¹— метилен-бисакриламида и малеиновой кислоты. Удельная активность препарата — примерно 80 ед./г. Эффектив­ность препарата сравнивалась с действием растворимо­го препарата папаина, имеющего удельную активность 30 ед./мг (т. е. 30 000 ед./г).

Рис. 35. Устойчивость к холоду (ме­тод 40°С/0°С) пива, обработанного иммобилизованным папаином:

1 — контроль; 2 — доза 20 г/гл (актив­ность 16 ед./л); 3 — доза 48 г/гл (38 ед./л); 4 — доза 72 г/гл (58 ед./л).

В опытах было установлено, что иммобилизованный фермент довольно быстро терял активность — за 24 ч действия на осветленное пивное сусло активность сни­зилась до 34 ед./г, а после 52 ч—до 18 ед./г. Однако было показано, что после инкубации возможна реакти­вация препарата посредством обработки активирую­щим раствором, состоящим из фосфатного буфера с pH 6,5; 0,01 М цистеина и 0,01 М ЕДТА (тетраацетат). Пятидневная инкубация в присутствии активирующего раствора при 4° С дала только незначительное умень­шение активности — с 63 до 57 ед., в другом случае от­мечалось даже увеличение активности до 78 ед.

На рис. 35 показано достигнутое в опытах повыше­ние стойкости обработанного пива к холоду (устанавли­валось по определению мутности в результате 24-часо­вого попеременного нагревания при 40° С и охлажде­ния до 0° С).

Необходимо отметить, что в опытах с иммобилизо­ванным препаратом стойкость улучшалась пропорцио­нально увеличению дозы препарата. В этом случае не наблюдалось установленного при использовании раство­римого папаина снижения эффекта при увеличении до­зы (см. с. 178). Однако и при использовании нераство­римых ферментов надо выбирать такую дозу, которая бы приводила к повышению стойкости, но не снижала пенистые свойства пива.

Физико-химические свойства носителя определяют также особенности аппаратурного оформления процесса. Наиболее прогрессивным, нетрудоемким было бы при­менение колонок, наполненных иммобилизованным фер­ментом, через которые непрерывным потоком протекало пиво или сусло. Но в этом случае должен использо­ваться достаточно крупнодисперсный препарат с хоро­шей дренирующей способностью. Однако при этом может быть снижена ферментативная эффективность препарата. Кроме того, использование колонок в пиво­варении усложняется необходимостью применения дав­ления углекислоты и тщательной предварительной фильтрации пива. Поэтому может быть изучен и затем использован другой способ — обработка пива иммобили­зованными ферментами в реакторе. После одного цикла обработки пиво может быть декантировано с осадка препарата, а реактор заполнен новой порцией пива.

Сообщалось [235] об иммобилизации папаина на кол­лагене и применении коллаген-папаиновых мембран (пленок) для повышения коллоидной стойкости пива. Пиво пропускали через биокаталитический модульный реактор спиралевидной формы, на внутреннюю поверх­ность которого наносили 15 г коллаген-папаиновой пленки. Скорость пропускания пива колебалась от 8,7 до 605 мл/мин. Обработанное пиво обладало удовлетво­рительной прозрачностью на протяжении 1—3 мес, при этом вкус, цвет и пеностойкость его не менялись. Ак­тивность биокаталитического реактора после 5 мес ис­пользования сохранялась на 56%.

Исследования по разработке и испытанию иммоби­лизованных ферментов, аппаратурного решения, их практического применения продолжаются во многих странах, в том числе и в СССР. Во ВНИИПБПе сов­местно с другими организациями (ВНИИбиотехника) проводятся исследования возможности и эффективности применения иммобилизованных протеаз и глюкоамилаз для повышения стойкости пива.