No module Published on Offcanvas position

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ЛИЗИНА

Наиболее точным методом определения лизина в гид­ролизате является его определение аминоанализатором. Возможно также его определение методом электрофореза на бумаге. Ниже приводится менее точный, но доступный производственным лабораториям метод.

Определение содержания лизина в муке и хлебе мето­дом А. С. Мусейко и А. Ф. Сысоева. Сущность ме­тода заключается в определении свободных Е = NH2-rpynn лизина без гидролиза белка по их реакции с нингидрино- вым реактивом. Интенсивность возникающего при этом окрашивания измеряют на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре. В качестве раствора сравнения исполь­зуют раствор лейцина, который содержит одну аминогруп­пу и соответствует лизину, имеющему свободные E-NH2- группы в белке. Метод применим для массовых опреде­лений.

Техника определения следующая. В две пробирки вместимостью 20 мл вносят по 200—250 мг измельченного химического стекла, затем взвешивают по 30 мг тонкоиз­мельченной муки или 50 мг воздушно-сухой измельченной крошки хлеба и вносят в каждую пробирку через маленькую воронку с длинной трубкой. К пробам добавляют по I мл 2%-ного раствора карбоната натрия и тщательно пе­ремешивают со стеклянным порошком с помощью стеклян­ной палочки, которую оставляют в пробирке. Затем, устано­вив пробирки в штатив, нагревают их на водяной бане при 80° С в течение 10 мин, после чего содержимое пробирок снова тщательно перемешивают до достижения гомогенного состояния, а затем добавляют 2 мл нингидринового реакти­ва, еще раз перемешивают и выдерживают на той же бане 30 мин.

По истечении 30 мин пробирки охлаждают погружением их вместе со штативом в сосуд с холодной водой. В охлаж­денные пробирки добавляют по 5 мл 95%-ного этанола, взбалтывают и фильтруют.

Оптическую плотность измеряют на фотоэлектроколо­риметре в кювете с рабочей длиной грани 3 мм при зеленом светофильтре. Если окраска раствора очень интенсивна, его дополнительно разбавляют этанолом.

Калибровочную кривую строят ежедневно по трем эта­лонным растворам лейцина, содержащим 100; 200 и 300 мкг его в 1 мл. Определение для каждого эталонного раствора проводят в трех параллельных пробах. В каждую пробирку вносят 0,5 мл эталонного раствора, 0,5 мл 4%-ного раствора карбоната натрия, 2 мл нингидринового реактива и после перемешивания поступают так же, как с опытными образ­цами, помещая их в тот же штатив.

По данным оптической плотности эталонных растворов строят калибровочную кривую или вычисляют по одному из трех образцов, наиболее близкому по оптической плотности к опытному. Полученный результат увеличивают на 1196 для пересчета на лизин. Делают также поправку на аминный азот, который определяют по одному из точных методов (см, с. 43).

Реактивы.

  1. Буферный раствор. В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 30 г натриевой соли муравьиной кислоты, растворяют ее в 60 мл воды, добавляют 10 мл 86—88%-ной муравьиной кислоты и доводят объем до метки дистил­лированной водой.
  2. Нингидриновый реактив. В темную склянку с при­тертой пробкой вносят 1 г химически чистого нингидрина, добавляют 1 г хлористого кадмия (CdCl2 -2,5 Н20), раство­ряют в 25 мл буфера и 75 мл этиленгликоля. Перед употреблением реактив выдерживают 1 сут при комнатной темпе­ратуре.
  1. 2- и 4%-ные растворы безводного Na2C03.
  2. Стандартные растворы лейцина. В мерные колбы вместимостью 100 мл точно отвешивают 10; 20 и 30 мг чис­того лейцина и растворяют в 20%-ном этаноле.

Определение доступного лизина в хлебе динитрофторбензольным методом. Лизин, находящийся в цепи на­тивного белка, имеет свободную е-аминогруппу, способ­ную к взаимодействию с углеводами, продуктами распада жиров или другими веществами. Ферменты организма не способны расщепить эту нетипичную связь и освободить лизин, и он не может быть использован для синтеза белка.

Ферментативно негидролизуемые связи расщепляются при кислотном гидролизе. Поэтому разница между количест­вом общего и доступного лизина может быть определена после кислотного гидролиза.

В основу метода положена способность 2,4-динитро- 1-фторбензола реагировать со свободными ε-аминогруппами лизина белка с образованием ε-динитрофенил (ДНФ) лизина, имеющего ярко-желтую окраску, устойчивую к разрушающему действию кислоты.

Определение доступного лизина состоит их четырех этапов: динитрофенилирование свободных ε-аминогрупп белка; гидролиз ДНФ белка; выделение е-ДНФ лизина; определение оптической плотности и расчет содержания доступного лизина в пробе по сравнению со стандартом.

Техника определения следующая. Тонко измельченный образец хлеба в количестве 100—500 мг (величина навески зависит от количества лизина в образце) помещают в колбу вместимостью 100 мл со шлифом. Добавляют 8 мл 8% -ного водного раствора NaHC03, встряхивают и через 10 мин добавляют 0,3 мл динитрофторбензола, растворенного в 12 мл этилового или метилового спирта. Колбы закрывают и осторожно, чтобы жидкость не попала на горлыш­ко, встряхивают в течение 2 ч или оставляют стоять на ночь.

После удаления спирта на роторном испарителе или во­дяной бане (прекращение вскипания при встряхивании) в колбу добавляют 30 мл 7,75 н. раствора НСl, две стеклян­ные бусинки и гидролизуют образец в течение 16 ч с обрат­ным холодильником, поддерживая легкое кипение при тем­пературе 110—115° С. Затем конденсат из холодильника смывают в колбу дистиллированной водой (50 мл). Разбав­ленный гидролизат желтого цвета охлаждают льдом в те­чение 1—2 ч и фильтруют в колбу вместимостью 200 мл. Фильтр промывают водой и доводят общий объем до 200 мл. Гидролизат хранят в темном месте (желательно использовать сразу после приготовления).

Из разбавленного гидролизата берут три пробы по 2 мл каждая; две из них помещают в пробирки А и В вмести­мостью по 10 мл с притертой пробкой, а третью — в кол­бочку. Последнюю титруют 2 н. раствором NaOH с фенол­фталеином до изменения окраски и отбрасывают.

Определенное таким образом количество щелочи, не­обходимое для нейтрализации, добавляют в пробирку Б, затем прибавляют 2 мл карбонатного буфера с pH 8,5. При этом pH пробы устанавливается в пределах 8,2—8,5. Если необходимо, добавляют еще одну-две капли щелочи.

Все определения следует проводить быстро, так как при этом величина pH раствора ДНФ лизина недостаточно ус­тойчива. Добавив 0,05 мл метоксикарбонилхлорида, раствор встряхивают. Спустя 5—10 мин пробу Б осторожно (чтобы избежать вспенивания и выбрасывания) подкисляют 0,75 мл концентрированной НСl и параллельно с пробой А экстрагируют 5—10 мл диэтилового эфира, свободного от перекисей, до тех пор, пока слой эфира не станет бесцвет­ным. Затем эфир отсасывают пипеткой, остаток удаляют, нагревая пробирку на теплой водяной бане. После охлаж­дения раствор в пробирке доводят до 10 мл: в пробирке А —1 н. раствором НСl, в а пробирке Б — дистиллированной водой. Окрашенные растворы в пробирках фотометрируют при длине волны 570 нм. Рассчитывают разность показа­ний экстинкций и сравнивают с величиной экстинкции эталонного раствора ДНФ лизина.

Для приготовления эталонного раствора ДНФ лизина 0,011 002 83 г этого реактива растворяют в 1 л 0,1 н. рас­твора соляной кислоты. Часть раствора (2 мл) обрабатыва­ют как соответствующую пробу.

Содержание доступного лизина М, %, рассчитывают по формуле

М = Э (А — В) n • 4,39 • 1,09 • 100/(Ээр),

где Э (А — В) — разность экстинкций пробы А и В; n—степень разбавления в 1000 раз; 4,39—содержание лизина в 1 л эталона, мг; 1,09— коэффициент поправки,введенный для корректирования потерь при гидролизе; Ээ— экстинкция эталонного раствора ДНФ-лизина; Р — навеска, г.

Реактивы. 1.8% -ный водный раствор бикарбоната натрия (NaHC03). 2. 8%-ный раствор карбоната натрия (Na2C03). 3. 2,4-дннитро-1-фторбензол. 4. Этиловый или метиловый спирт. 5. 7,75 н. раствор соляной кислоты. 6. 2 н. раствор гидроксида натрия. 7. Карбонатный буфер pH 8,5 (19 частей 8%-ного водного раствора NaHC03 и 1 часть 8%-ного раствора Na2C03) Метоксикарбонилхлорид. 9. Концентрированная НСl. 10. Диэтиловый эфир. 11. ДНФ- лизин (динитрофениллизин). 12. 0,1 н. раствор НСl.