No module Published on Offcanvas position

5.9. НОВЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ В СОЗДАНИИ ВАКЦИН

Вакцинация – один из основополагающих способов борьбы с инфекционными заболеваниями. Путем поголовной вакцинации животных ликвидирована натуральная оспа, резко ограничено распространение бешенства, ящура и многих других заболеваний. Существенное экономическое значение имеет своевременная разработка вакцин против болезней сельскохозяйственных животных и проводимая с их помощью профилактика. Большинство вакцинных препаратов изготавливают на основе ослабленных или инактивированных возбудителей болезней с использованием различных питательных сред по общепринятым или вновь разработанным технологиям.

Традиционные методы приготовления вакцинных препаратов против инфекционных заболеваний подробно описаны в литературе.

Современные биотехнологические разработки предусматривают создание многочисленных вариантов вакцинных препаратов, наибольший интерес из которых представляют рекомбинантные вакцины и вакцины-антигены. Вакцины обоих типов основаны на генно-инженерном подходе. Для получения рекомбинантных вакцин обычно используют хорошо известный вирус коровьей оспы (осповакцины). В его ДНК встраивают чужеродные гены, кодирующие иммуногенные белки различных возбудителей: гемаглютинин вируса гриппа, гликопротеин D вируса герпеса, поверхностный антиген вируса гепатита В, антиген малярийного плазмодия. К достоинствам вакцин, полученных генно-инженерными методами, относится возможность создания поливалентных препаратов на основе объединения участков ДНК различных патогенов «под эгидой» ДНК вируса осповакцины. Открывается возможность одномоментной комплексной иммунизации крупного рогатого скота и других видов животных против всех опасных инфекций данной местности.

Вакцины-антигены получают, клонируя гены возбудителя болезни в Е. coli, дрожжах, клетках насекомых и млекопитающих. В настоящее время клонирован ген поверхностного антигена HBS-вируса гепатита (сывороточного гепатита), ген белка оболочки VPI – вируса яшура. Вирус ящура существует в виде многих серотипов. Методом белковой инженерии удалось скомбинировать иммуногенные компоненты различных серотипов в рамках одной вакцины-ангтигена.

Вакцины-антигены высокостабильны при хранении и перевозке, сравнительно просты в использовании (в том числе и при крупномасшатбном производстве), содержат минимальное количество белка и поэтому малоопасны как аллергены. Они гарантированы от остаточной вирулентности – способности вызвать инфекционную болезнь вместо того, чтобы предохранять от нее. К сожалению, пока остается проблема низкой иммуногенности вакцин-антигенов. Одной ее из причин может быть то, что вакцина не включает всех компонентов возбудителя, необходимых для создания иммунитета к нему. Так, вирус, покидая клетку, часто «одевается» ее мембраной. Компоненты этой мембраны, отсутствующие в генно-инженерном белке, могут обладать иммуногенными свойствами. Повышению иммуногенности вацин-антигенов способствует добавление адьювантов, иммобилизация вакцин на носителях или их включение влипосомы. Большинство экспериментальных подходов или направлений в биотехнологических исследованиях связаны с медициной и ветеринарией, не ослабевает внимание ученых к поиску новых антибиотиков, что связано с токсичностью существующих препаратов, аллергическими реакциями, вызываемыми ими, нарастанием устойчивости патогенных микроорганизмов к применяемым препаратам, а также с необходимостью изыскания средств борьбы с возбудителями, против которых недостаточно эффективны известные антибиотики.

Основными направлениями поиска в решении этой проблемы являются:

  • испытание новых продуцентов, изучение микроорганизмов, продуцирующих большое количество антимикробных агентов;
  • химическая модификация антибиотиков в целях снижения их токсичности для человека (например, амфотерицин В, используемый по жизненным показателям при тяжелых микозах, вызывает необратимые поражения почек, получены метиловые эфиры амфотерицина, менее токсичные и сохраняющие противогрибковую активность; при модификации пенициллинов и цефаллоспоринов используют иммобилизованные ферменты);
  • получение и применение мутантных штаммов, у которых блокирован синтез отдельных фрагментов молекул антибиотиков, аналоги которых вносят в среду культивирования, микроорганизмы используют эти аналоги для биосинтеза, в результате чего получают модифицированный антибиотик;
  • применение методов клеточной инженерии и получение гибридных антибиотиков, например с новыми комбинациями агликона сахаров;
  • использование методов генетической инженерии – введение в геном микроорганизма информации о ферменте, необходимом для модификации продуцируемого антибиотика, например его метилирования при помощи метилаз.

В настоящее время проведены широкие клинические испытания новой конъюгированной гриппозной вакцины, полученной с использованием консервативных антигенов вируса гриппа. Разработана и оптимизирована технология выделения и очистки антигенного комплекса протективных поверхностных антигенов гемаглютинина и найрамидазы внутренних белков вируса, связанных с иммуностимулятором. Установлено, что эти два белка являются основными факторами кроссреактивности (перекрестной иммуногенности) между актуальными эпидемическими штаммами, что может обеспечить механизм перекрестной защиты вакцинированных животных от большинства эпидемических штаммов.

Основной принцип в создании генно-инженерных вакцин заключается в присоединении к бактериальному или вирусному антигену дополнительных биологически активных молекул, обеспечивающих костимулирующее воздействие на клетки – эффекторы иммунного ответа. Чаще всего для этой цели используются белковые носители, конъюгируемые с полисахаридными антигенами. Однако для создания полисахаридной вакцины против кишечных инфекций на основе бифункциональных молекул была использована технология создания в молекуле иммуногена иммуностимулирующего центра с использованием как полисахаридных, так и белковых антигенов. При этом основой бифункциональных молекул могут быть антиген капсулы или клеточной стенки и активационный центр. В другом варианте – низкоэндотоксичный липополисахарид, включающий О-полисахаридный антиген и липид А – иммуностимулирующего домена молекулы, которые совместно со встроенным адъювантом – полиоксидонием являются основой вакцины Шигеллвак.

Основой субъединичных вакцин являются рекомбинантные белки или синтетические пептиды, содержащие основные эпитопы антигенов, активно распознаваемых иммунной системой. Использование синтетических пептидов при разработке вакцин имеет целый ряд преимуществ по сравнению с традиционными технологиями, однако остается проблема, связанная с низкой иммуногенностью пептидных вакцин. Низкая способность пептидов индуцировать иммунологические реакции обусловлена отсутствием в их составе структурных элементов, ответственных за взаимодействие с молекулами большого комплекса гистосовместимости, в контексте которого происходит распознавание антигена.

Одно из эффективных решений этой проблемы было найдено сравнительно недавно и основано на использовании «белков теплового шока» в качестве универсальных носителей и «суперантигенов» для стимуляции Т-клеточного иммунитета. В настоящее время разработана технология конструирования гибридных белковых молекул, состоящих из целевого антигена и белков теплового шока из М. Tuberculosis Hsp 70 (Hsp 65 ESAT-6 CFP-10). С использованием данной технологии разработаны вакцины против туберкулеза и опухолей, ассоциированных с вирусами папиломы человека. При разработке противотуберкулезной вакцины использовалась смесь белков теплового шока М. Tuberculosis Hsp 70 и Hsp 65, а также два секреторных белка ESAT-6 CFP-10. На экспериментальных животных продемонстрирована высокая протективная активность разработанных вакцинных препаратов.

Большое значение в связи с интесификацией животноводства отводится профилактике инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных с применением рекомбинантных живых вакцин и генно-инженерных вакцин-антигенов, ранней диагностике этих заболеваний при помощи моноклональных антител и ДНК/РНК-проб.

Расширяющееся в настоящее время применение вакцин в ветеринарной медицине делает их производство важной сферой применения методов генетической инженерии. Однако их использование осложняется тем, что условием иммуногенной и антигенной активности антигенных детерминант любого типа является экспонирование, определяющееся их поверхностным расположением и степенью доступности для взаимодействия с антителами. Иными словами, иммуногенные и антигенные свойства вирусных белков сильно зависят от их вторичной, третичной и четвертичной структур. Именно этот факт является причиной значительно более низкой иммуногенной активности субъединиц, в которых локализованы главные антигенные детерминанты, по сравнению с таковой вириантов или образований из элементов оболочки.

До недавнего времени считалось, что наиболее реальным подходом является микробиологический синтез тех поверхностных белков вирусов или бактерий, в которых локализованы главные антигенные детерминанты. Идя по этому пути, уже ставшим традиционным для технологии рекомбинантной ДНК, удалось достичь определенных успехов. Так, осуществлена экспрессия в бактериях вирусных генов, кодирующих гемагглютинин, поверхностные белки вируса гриппа, ящура и некоторых других вирусов.

Однако ни один их этих оболочечных белков, успешно синтезируемых на матрице рекомбинантных плазмид в бактериальной клетке, не стал и врядли в ближайшем будущем станет вакциной субъединичного типа. Это связано с тем, что вирусные белки, синтезированные в бактериальной системе, уступают по иммунногенности и по выходу продуктов эукариотического синтеза. Сегодня широко применяется противоящурная синтетическая вакцина, представляющая собой олигопептид, несущий главную антигенную детерминанту и связанный с ним носитель, такие вацины абсолютно безопасны. Они не обладают побочным действием, но их производство обходится пока дорого. Более перспективным и технологичным является генно-инженерный путь синтеза полиантигенных детерминант к нескольким видам или серотипам вирусов. Антигенные детерминанты должны быть встроены в молекулы белка носителя, специально сконструированного таким образом, чтобы обеспечить экспонирование детерминантных участков белковой молекулы. Такая задача является вполне разрешимой. Разработан методом, позволяющий рассчитывать вторичную и третичную структуру белков в растворе. В этом случае иммунногенная активность таких белков не будет зависеть от их способности формировать мультимерные агрегаты. Их иммунногенность должна однозначно определяться первичной структурой молекулярной полипептидной цепи. В этом случае полиантигенные генно-инженерные вакцины второго поколения, разработка которых уже началась, окажутся технологичными и в микробной системе.

Но этой перспективой не ограничиваются возможности создания искусственных вакцин. У многих вирусов антигенные детерминанты, ответственные за появление вируснейтрализующих антител, расположены в участках белка, первичная структура которых подвержена сильной изменчивости. Поэтому вакцина, приготовленная против одного серотипа вируса, плохо защищает от вируса этого же вида, но с иным серотипом.

Однако при иммунизации животных участками, изолированными из консервативной зоны полипептида, в организме образуются антитела и против этих малоизменчивых участков белка. Этого не наблюдается при иммунизации цельным вирусом или изолированным белком, содержащим антигенные детерминанты. Механизм этого феномена остается пока неизвестным. Он может быть использован при создании вакцин широкого спектра действия. Антитела против консервативных участков белка оболочки вируса гриппа А и В вызывают нейтрализацию всех этих серотипов. Реализация такого подхода означала бы создание нового типа противовирусных вакцин широкого спектра действия.

Разработана общая теория, объясняющая наличие в белках неиммуногенных участков, и ряд приемов, обеспечивающих повышение иммуногенности «молчащих», но потенциально способных «заговорить» участков белка.

В настоящее время для профилактики инфекционных болезней животных получены генно-инженерные вакцины против ящура, бешенства, диареи свиней и других вирусных болезней. Разработаны препараты против бактериальных инфекций. Например, в США открыт белок, токсичный для стафилококков, которые в 55 % случаев являются причиной мастита у КРС. Лабораторные исследования показали, что этот белок действует в течение нескольких минут и убивает клетки антибиотикорезистентных штаммов.

Задача конструирования и производства генно-инженерных вакцин будущего может быть решена лишь как составная часть фундаментальной проблемы – создание методами генной инженерии искусственных белков с заранее заданными свойствами и структурой.

Рекомбинантные ДНК могут быть широко использованы для выявления возбудителей методом молекулярной гибридизации. Этот метод позволяет быстро и точно диагностировать инфекционные болезни. Может использоваться для пренатального диагноза генетических дефектов, выявления животных – носителей возбудителя. Метод основан на использовании зондов – ДНК, меченые радиоактивными соединениями или бочипами, с последующей гибридизацией зондов с образцами ткани животного – носителя возбудителя болезни. Это особенно ценно для выявления скрытых инфекций (хламидиозы, медленные инфекции). Использование молекулярных зондов на основе ДНК позволяет индентифицировать близких по свойствам возбудителей.

Как и в медицине, в ветеринарной науке в перспективе возможно применение генно-терапевтических методов лечения наследственных заболеваний. Искусственное исправление генома особо ценных животных может и должно быть осуществлено. Принципиальная схема такой технологии и ее экспериментальная проверка в медицине проводится. Пересадка определенного количества клеток с нормальным геномом может при определенных условиях дать положительный конечный результат. Эти условия изучаются и проверяются в медицинской практике. Не менее важной задачей является повышение эффективности биосинтеза известных антибиотиков. Значительных результатов ученым и практикам удалось добиться в селекции штамов-продуцентов с применением индуцированного мутагенеза и многоступенчатого отбора. Например, продуктивность штаммов Penicillum по синтезу пенициллина увеличена в сотни раз. Определенные перспективы открываются в связи с возможностью клонирования генов «узких мест» биосинтеза антибиотика или в случае, если все биосинтетические ферменты кодируются единым опероном.

Перспективным подходом является инкапсулирование антибиотиков, в частности их включение влипосомы, что позволяет прицельно доставлять препарат к определенным органам и тканям, повышает его эффективность и снижает побочное действие. Этот подход применим и для других лекарственных препаратов. Например, калазар, болезнь, вызываемая лейшманией, поддается лечению препаратами сурьмы. Однако лечебная доза этих препаратов токсична для человека. В составе липосом препараты сурьмы избирательно доставляются к органам, пораженным лейшманией,– селезенке и печени.

Вместо антибиотика в организм человека может вводиться его продуцент, антагонист возбудителя заболевания. Этот подход берет начало с работ И.И. Мечникова о подавлении гнилостной микрофлоры в толстом кишечнике человека посредством молочнокислых бактерий. Важную роль в возникновении кариеса зубов играет обитающая во рту бактерии S. mutans, которая при введении в ротовую полость почти не образует коррозивных кислот, вытесняя дикий штамм.

Для повышения продуктивности животных путем дачи полноценного корма микробиологическая промышленность в настоящее время выпускает кормовые белки на базе различных микроорганизмов-бактерий, грибов, дрожжей, водорослей. Богатая белковая биомасса одноклеточных усваивается сельскохозяйственными животными. Так, 1 т кормовых дрожжей позволяет получить 0,4–0,6 т свинины, до 1,5 т мяса птиц, 25–30 тыс. яиц и сэкономить 5–7 т зерна. Это имеет большое народнохозяйственное значение, поскольку 30 % площадей сельскохозяйственных угодий в мире отводятся для производства кормов для скота и птицы:

– в пищевой промышленности это создание новых методов переработки и хранения пищевых продуктов, получение пищевых добавок (например, полимеров, продуцируемых микроорганизмами аминокислот), использование белка, синтезируемого одноклеточными организмами, и ферментов при переработке пищевого сырья; применение ферментов для усовершенствования средств диагностики, создание тестовых систем на основе ферментов, использование микроорганизмов и ферментов при производстве сложных лекарств (например, стероидных), синтез новых антибиотиков и их использование в терапии инфекционной патологии животных.

Таким образом, применение биотехнологии и прежде всего генетической инженерии в ветеринарной медицине открывает широкие возможности для более эффективного решения главной задачи – обеспечение санитарного благополучия в животноводстве и получение безопасной для человека животноводческой продукции.