Ферменты - это высокомолекулярные вещества белковой природы, активность которых зависит от состава и последовательности аминокислот.

Ферменты - функциональные единицы клеточного метаболизма. Дей­ствуя в строго определенной последовательности, они катализируют сотни многостадийных реакций, в ходе которых расщепляются молекулы пита­тельных веществ, запасается и преобразуется химическая энергия и из про­стых молекул-предшественников строятся макромолекулы, входящие в со­став клетки. С помощью ферментов обеспечивается гармоничное равновесие между различными метаболическими процессами, необходимыми для под­держания жизнеспособности отдельных клеток и организма в целом.

В настоящее время известно и изучено почти 2000 различных фермен­тов, многие из которых успешно применяются в медицине, пищевой техно­логии, перерабатывающей промышленности, бытовой химии и других отрас­лях народного хозяйства.

Основное внимание в ранний период развития энзимологии было со­средоточено на исследовании ферментов пищеварения (пепсин, трипсин, хи- мотрипсин) и брожения, поэтому именно они наиболее изучены. Сейчас осознана важная роль внутриклеточных ферментов. Современный уровень развития энзимологии характеризуется открытием их новых представителей, которое позволило понять механизм многих фундаментальных жизненных процессов. Знания о закономерностях развития автолитических процессов, например, при переработке промышленных животных значительно пополни­лись благодаря выделению и изучению свойств внутриклеточных протеиназ (катепсинов) и ферментов, ответственных за двигательную функцию клетки.

Насущной проблемой энзимологии является расшифровка механизма действия ферментов на основе изучения их химического строения, которое обеспечивает исключительно высокую и специфическую каталитическую активность.

По химическому составу различают однокомпонентные ферменты - простые белки, сходные с глобулинами, которые при гидролизе образуют только аминокислоты, и двухкомпонентные, представляющие собой сложные белки, в которых небелковыми компонентами являются нуклеотиды, вита­мины, металлы и т. д.

Именно благодаря ферментам клеток живого организма осуще­ствляются различные химические превращения, обеспечивающие все про­цессы жизнедеятельности.

Свое название ферменты получили от латинского слова «fermentum», что означает закваска, перебродивший сахар. Это соответствует первым представлениям о ферментах, которые были получены при изучении броже­ния (fermentation означает брожение). Синоним термина «ферменты» - энзи­мы происходит от греческого слова «enzyme», что означает закваска, дрож­жи, с помощью которых начали изучать спиртовое брожение.

Структура ферментов. На основе фундаментальных исследований ус­тановлено, что все ферменты обладают свойствами белков, причем их ката­литическая активность зависит от степени сохранности нативной структуры белка.

Первичная структура ферментов, как известно, представлена последо­вательностью аминокислот, соединенных в цепь пептидными связями. Пер­вичная структура расшифрована для таких протеолитических ферментов, как трипсиноген, химотрипсиноген, папаин и некоторых микробных протеиназ.

Вторичная структура молекул ферментов регулирует конформацию ее главной цепи. Она возникает в результате образования упорядоченной структуры в виде спирали посредством водородных связей между группами СО - и NH - и встречается в пептидных цепях на отдельных участках.

Под третичной структурой фермента понимают специфическую ук­ладку регулярных и аморфных участков полипептидных цепей в глобулу. При этом углеводородные радикалы, направленные наружу по отношению к оси спирали, образуют гидрофобное ядро молекулы фермента.

В создании и стабилизации третичной структуры принимают участие все типы химических связей, включая ковалентные. Имеются сведения, что в формировании третичной структуры нередко важную роль играют катионы металлов, например в а-амилазах - это ионы кальция.

Для некоторых ферментов установлена четвертичная структура, ко­торая возникает в результате ассоциации двух или более глобулярных субъе­диниц с образованием составной или комплексной глобулы (например, папа- ин или а-амилаза Bacillus subtilis).

Классификация ферментов. Современная классификация строится с учетом природы, катализируемой ими реакции. Различают 6 классов фермен­тов.

1. Оксидоредуктазы - катализируют окислительно-восстановительные реакции (дегидрогеназы, электроназы, цитохромы).
2. Трансферазы - катализируют перенос отдельных радикалов, частей молекул от одних соединений к другим (фосфотрансферазы, ацетилтрансфе- разы и т. д.).
3. Гидролазы — катализируют реакции расщепления сложных органи­ческих соединений в присутствии воды (амилазы, протеазы, эстеразы, пектиназы, изомеразы, оксидазы, липазы и др.).
4. Лиазы — катализируют реакции отщепления от субстратов опреде­ленных групп с образованием двойных связей или присоединением отдель­ных групп по месту двойных связей (например, карбоксилаза).
5. Изомеразы - ферменты изомеризации, превращающие органические соединения в их изомеры (фосфогексоизомеразы и пр.)
6. Лигазы - катализируют синтез сложных органических соединений из простых (например, карбоксилаза).

Учитывая значение в питании протеолитических ферментов пи­щеварительного тракта, а также катепсинов мышечной ткани, целесообразно остановиться на них более подробно. Тем более, что при переработке и хра­нении сырья и продуктов животного происхождения биокаталитические про­цессы под воздействием экзогенных аналогов различного происхождения в последнее время получили достаточно широкую популярность. Они приме­няются для интенсификации процессов, биомодификации сырья, улучшения качества продуктов, увеличения их выхода, привлечения нетрадиционных ресурсов при решении проблем экологической безопасности производств.

Согласно современной классификации, протеолитические ферменты относятся к классу гидролаз (III) и образуют подкласс протеаз. Протеазы обычно подразделяют на пептидазы и протеиназы. Однако, четкого разделе­ния по этому признаку нет, так как установлено, что протеиназы (пепсин, трипсин, папаин и др.) гидролизуют пептидные связи не только в белках, но и в различных полипептидах. Позднее это было доказано для целого ряда протеиназ микробного происхождения.

За последние годы значительно изменились представления о протеоли­тических ферментах. Сейчас выяснено, что одни ферменты для своего дейст­вия не нуждаются в присутствии примыкающих концевых карбоксильных или аминных групп, а другим, наоборот, необходимо наличие свободных концевых групп.

Ферменты первой группы (эндопептидазы) могут действовать на центральные участки пептидной цепи и расщеплять молекулы белка на более мелкие фрагменты; небольшие пептиды они расщепляют только в том слу­чае, когда их концевые группы искусственно, химическим путем блокирова­ны.

Ферменты второй группы (экзопептидазы) не могут гидролизовать пептидные связи, находящиеся в середине цепи, и действуют (либо с карбок­сильного, либо с аминного конца цепи), отщепляя последовательно одну за другой концевые аминокислоты.

Часто на практике протеолитические ферменты, известные и тем более мало изученные, подразделяют на группы в зависимости от оптимального значения рН действия на субстраты. Как правило, выделяют три группы.

1. Щелочные протеиназы, которые стабильны и активно действуют в области рН 5-10, хотя максимальная их активность наблюдается при рН 9,5­10,5.
2. Нейтральные протеиназы с оптимумом рН для протеолиза около 7,0.
3. Кислые протеиназы - ферменты, активные при рН 2-5.

Протеолитические ферменты синтезируются практически всеми живы­ми существами. Они распространены в природе и широко используются в промышленной энзимологии. В качестве источника получения протеаз ис­пользуются животные ткани, растения и клетки микроорганизмов.

Животные ферменты для различных целей получают из собираемого на мясокомбинатах сырья, среди которого наибольший интерес представляют поджелудочная железа и слизистая оболочка желудков и сычугов убойных животных (свиней и крупного рогатого скота). Эти ткани секретируют вне­клеточные ферменты, из которых получают кристаллические медицинские и технические препараты пепсина, трипсина, химотрипсина, панкреатина, коллагеназы и эластазы. В технологии переработки мяса огромную роль иг­рают внутриклеточные протеолитические ферменты, называемые катепсина- ми, локализованные в клеточных органеллах - лизосомах.

Из растений промышленный интерес представляют плоды дынно­го дерева, побеги и листья инжира и отходы переработки ананасов. Техноло­гия получения ферментных препаратов из растительного сырья отработана за рубежом, в странах, где успешно экспортируются препараты соответствую­щих протеолитических ферментов (папаин, фицин, бромелаин) различной степени чистоты.

Наиболее перспективным источником получения различных протеаз следует признать микроорганизмы, по ряду существенных преимуществ, свя­занных с неограниченностью источников, возможностью широко варьиро­вать свойствами и методами селекции, генетической инженерии и подбором условий биосинтеза; широким спектром ферментных комплексов и глубиной воздействия на различные субстраты, включая труднодоступные, а также простотой и относительной дешевизной технологии.

Продуценты протеолитических ферментов обнаружены среди самых различных групп микроорганизмов: бактерий (Bacillus, Micrococcus, Pseudo­monos), микромицетов (Aspergillus, Rhizopus, Penicillium), актиномицетов (Streptomyces, Actinomyces). На их основе у нас в стране и за рубежом созда­но крупнотоннажное производство ферментных препаратов протеолитиче­ского действия.

Ферментные препараты животного происхождения. Секрет подже­лудочной железы и слизистые оболочки сычугов, желудков, кишечного трак­та содержат сложный набор гидролитических ферментов, в том числе проте­аз. Практически все животные протеазы синтезируются тканями в виде неак­тивных предшественников - зимогенов и превращаются в активные фермен­ты уже в самих секретах. В настоящее время эти ферменты получены в кри­сталлическом виде и достаточно изучены. Трипсин, пепсин пищевой свиной или говяжий вырабатываются мясной промышленностью. Однако, трипсин не нашел практического применения вследствие его низкого температурного оптимума и преимущественного воздействия на мышечные белки.

Трипсин. Кристаллический трипсин впервые получен Дж. Х. Нортро- пом в 1931 году путем насыщения раствора белка коммерческого препарата трипсина. Трипсин имеет оптимум активности в интервале рН от 7,0 до 9,0 при температуре 50⁰С. Относительная молекулярная масса бычьего трипсина 23800. Первичная структура бычьего трипсина состоит из 229 аминокислот­ных остатков, соединенных пептидными связями. Трипсин гидролизует свя­зи, в которых карбоксильные группы принадлежат основным аминокислотам - лизину или аргинину. Трипсин не способен гидролизовать эластин и колла­ген. Его используют, в основном, для обработки сырья, имеющего грубую структуру мышечных волокон.

Пепсин - фермент слизистой оболочки желудков свиней и сычугов крупного рогатого скота, впервые получен Дж. Нортропом в 1929-1930 гг. Препараты кристаллического пепсина не отличаются высокой степенью од­нородности, что связано с наличием в слизистой желудка нескольких форм пепсиногена (неактивной формы пепсина), а также с самоперевариванием фермента.

Пепсин обнаружен в желудочном соке всех позвоночных.

Активация пепсиногена происходит с помощью соляной кислоты же­лудочного сока по схеме:

Относительная молекулярная масса пепсина равна 34163. Молекула пепсина имеет 321 аминокислотный остаток. Характерной особенностью аминокислотного состава пепсина является подавляющее преобладание ди­карбоновых аминокислот над основными. Изоэлектрическая точка пепсина лежит около рН 1,0. Пепсин гидролизует белки и пептиды, но гораздо мед­леннее, чем другие протеиназы.

Возможность использования пепсина из-за того, что оптимум его дей­ствия при рН 1,5-2,5, ранее не рассматривалась вообще. Однако, позже было установлено, что пепсин имеет второй оптимум протеолитической активно­сти в области значений рН 5,6-5,9. Действие пепсина заключается в его спо­собности инактивировать водородные и дисульфидные связи между поли­пептидными цепями, что приводит к образованию «открытых» форм белко­вых молекул мясного сырья. В результате наблюдаются морфологические изменения мышечных, коллагеновых и эластиновых волокон и, как следст­вие, повышается скорость и равномерность фильтрационно-диффузионного распределения посолочных веществ по объему мяса в процессе его посола.

Коллагеназа - фермент, секретируемый в растущих или подвергаю­щихся метаморфозу тканях земноводных и млекопитающих.

Впервые коллагенолитическая активность коллагеназы была выявлена в хвостовом плавнике головастиков в период метаморфоза, когда в течение нескольких дней происходит резорбция больших количеств коллагена в тка­ни.

Для определения этой активности маленькие кусочки хвостового плавни­ка в период метаморфоза культивировали на слое коллагеновых волокон. Спустя несколько часов на непрозрачном фоне фиксировали прозрачные зо­ны, что указывало на высокую активность коллагеназы.

Коллагеназа головастика обладает весьма высокой специфичностью. Этот фермент расщепляет тропоколлаген, как бы делая срез через все три це­пи в единственном месте - вблизи аминокислотного остатка 750 в последова­тельности из 1000 остатков. Два фрагмента, составляющие соответственно ^ и % исходной цепи, при температуре тела спонтанно развертываются и ста­новятся доступными действию других протеолитических ферментов.

Кроме того, коллагеназа выделена из поджелудочной железы млекопи­тающих, которая имеет специфичность к гидролизу коллагена. Степень гид­ролиза коллагена достигает 75,0-87,5%.

Коллагеназно-эластазный комплекс получают на мясокомбинатах из экстрактов поджелудочной железы крупного рогатого скота, но из-за ограни­ченности использования препарат выпускается лишь для медицинских целей. На практике для обработки различных белковых субстратов, в том числе, с высокой массовой долей соединительно-тканных компонентов, применяют ферменты пепсин, трипсин, химотрипсин или комплекс ферментов поджелу­дочной железы.

Катепсины - тканевые ферменты, локализованные в лизосомах мышечного волокна. При посоле и созревании мяса они незаменимы, но при обработке мясного сырья не используются, так как источник катепсинов - ценнейший пищевой продукт. Однако, закономерности их воздействия на белки мышечной ткани имеют большое практическое значение и должны учитываться при дополнительном внесении ферментов той или иной специ­фичности. При разработке новых препаратов ферментов, для ускорения про­цессов созревания мяса, свойства катепсинов принимают за образец для сравнения.

Свойства катепсинов достаточно изучены при традиционном характере автолиза. В последнее время сведения значительно расширены в результате развития теории и практики различных аспектов созревания и посола мяса.

Ферменты, гидролизуюшие концевые участки полипептидных цепей, - катепсины В₁, D, Н, L и G. Внутренние участки полипептидов активно рас­щепляют катепсины А, В₂ и С. Очевидно, гетерогенность ферментных ком­плексов и их специфичность играют решающую роль в характере и глубине изменений мышечных белков при посоле и созревании мяса.

Катепсин В1- тиоловая (цистеиновая) протеиназа с оптимумом дейст­вия в области рН 6,0, проявляет более высокую, чем коллагеназа, способ­ность к гидролизу коллагена в кислой зоне рН.

Катепсин D - карбоксильная протеиназа с оптимумом действия в об­ласти рН 2,8-4,0 и проявляющая низкую атакующую способность при расще­плении низкомолекулярных пептидов.

Катепсин Н - типичная аминопептидаза, способная гидролизовать бел­ки и производные аминокислот с максимальной скоростью при рН 6,0.

Катепсин L - тиоловая эндопептидаза, локализованная в лизосомальной фракции и максимально расщепляющая белки при рН5,0.

Катепсин А - лизосомальный фермент, карбоксипептидаза, проявляю­щая максимальную активность по отношению к пептидам при рН 5,6-5,9. По отношению к белкам мяса катепсины А и D проявляют синергизм.

Катепсин В₂ — относительно неспецифичная карбоксипептидаза, акти­вируемая сульфгидрильными соединениями; оптимум действия лежит в пре­делах рН 5,5-5,6. Предполагается, что катепсин В₂ осуществляет глубокий гидролиз полипептидных фрагментов, образующихся в результате действия эндопептидаз.

Катепсин С - типичная тиоловая экзопептидаза, максимально расщеп­ляющая полипептиды и их производные при 5,0 - 6,0.

Предполагается, что катепсины L, В, Н и D играют определяющую роль в деградации белков, где важное место отводится катепсину D - фер­менту с высокой активностью и широкой субстратной специфичностью, ко­торый в комплексе с другими протеиназами инициирует скорость процесса распада белков в лизосомах.

Среди ферментов, обнаруженных в саркоплазме, плазматических мем­бранах и в миофибриллярных структурах, идентифицированы фракции с протеолитической активностью при рН-оптимуме 7-8. Они инициируются поступлением ионов Са²⁺ в клетку.

Ферменты растительного происхождения действуют на волокна со­единительной ткани, но не на нативный, а на денатурированный при нагре­вании коллаген. Растительные протеазы сначала разрушают мукополисаха­риды основного вещества ткани, а затем превращают его волокна в аморф­ную массу. К наиболее известным следует отнести следующие ферменты: папаин из дынного дерева, фицин из инжира, бромелаин из ананасов, к менее известным — асклепаин из ваточника, мацин из маклюры оранжевой и др.

Папаин представляет собой гетерогенную систему протеиназ, отли­чающихся молекулярной массой и изоэлектрической точкой, имеет оптимум действия при рН 5-7 и температуре 60-70⁰С, подвергается инактивации при 80-85 °С. Наибольшую активность папаин проявляет в отношении актомио­зина. При температуре 60°С хорошо гидролизует не только белки мышечной ткани, но и коллаген и эластин. На нативный коллаген, практически, не дей­ствует.

Кристаллы папаина получают из жидкого или сухого латекса дынного дерева. Несколько раз перекристаллизованный папаин ведет себя при элек­трофорезе как однородное вещество основного характера с изоэлектрической точкой около рН 9. Относительная молекулярная масса равна 20 700.

Фицин - протеолитический фермент, выделенный из плодов, стеблей и листьев тропических растений рода Ficus. Это протеиназа типа папаина, прояв­ляющая активность в широких пределах рН, температурный оптимум актив­ности находится в пределах 60-65⁰С, инактивируется при 80 °С. Оказывает за­метное воздействие на мышечную и соединительную ткань. Есть сведения, что фицин способен гидролизовать нативный коллаген, хотя активность его по от­ношению к этому субстрату, заметно слабее и хорошо проявляется при рН 3,0, резко возрастая при температуре выше 60 °С.

Кристаллы фицина отличаются по форме от кристаллов папаина. Подобно папаину, в акте катализа важную роль играет цистеин. Кроме того, структура мо­лекулы фицина имеет некоторую аналогию с папаином. Относительная молеку­лярная масса фицина равна 25 000-26 000.

Фицин - единственный представитель группы растительных протеиназ, способный гидролизовать нативный коллаген. Вместе с тем он обладает вы­сокой активностью по отношению к мукополисахаридному комплексу внут­римышечной соединительной ткани; рН и температура в наибольшей степени влияют на активность фицина по отношению к коллагену и эластину.

Бромелаин выделен из плодов ананаса и по своему отношению к ин­гибиторам и активаторам, а также по ряду других свойств близок к папаину. Относительная молекулярная масса бромелаина - около 33 000. Молекула бромелаина содержит 285 аминокислотных остатков и представляет собой одну полипептидную цепь, стабилизированную пятью дисульфидными свя­зями.

Бромелаин - сложный белок, содержащий в качестве небелковой части прочно связанный углеводный компонент. Его активность повышается в присутствии цистеина, цианида, маркаптоэтанола; угнетается веществами, специфически реагирующими с SH-группами.

Кроме белков бромелаин активно гидролизует и некоторые синтетиче­ские пептиды.

По способности гидролизовать белки мяса бромелаин напоминает па­паин.

Бромелаин проявляет активность в широком диапазоне рН (от 4,5 до 8,5). Он, как и другие растительные ферменты, не способен гидролизовать нативные коллаген и эластин, однако проявляет высокую коллагеназную и эластазную активности при температурах 60°С и выше.

Однако следует подчеркнуть, что протеиназы растительного происхо­ждения, подобно животным, не могут полностью удовлетворять потребности в протеолитических ферментах. В связи с этим будущее принадлежит протеиназам микробного происхождения.

Ферменты микробного происхождения. Многие широко распростра­ненные микроорганизмы секретируют значительные количества протеолити­ческих биокатализаторов в окружающую среду, что значительно облегчает задачу их выделения и очистки. Возможность управления образованием ферментов за счет подбора соответствующей питательной среды и условий культивирования позволяет не только увеличить выход протеолитических ферментов, но и получать ферментные препараты с определенными свойст­вами. Методы селекции и генной инженерии значительно увеличивают воз­можности целенаправленного биосинтеза ферментов. Микроорганизмы об­ладают способностью вырабатывать ферменты, уникальные по своей суб­стратной специфичности (например, кератиназы, коллагеназы, эластазы). Большое внимание, уделяемое изучению протеолитических ферментов мик­роорганизмов, привело к получению значительного числа препаратов бакте­риальных и грибных протеиназ в высокоочищенном состоянии.

Производство протеолитических препаратов организовано на основе микроскопических грибов родов Aspergillus и Rhizopus при поверхностном культивировании продуцентов, а также на основе бактерий Bacillus (subtilis, mesentericus, licheniformis, cereus и др.) при глубинном культивировании.

Семейство субтилиновых (на основе бактерий Bacillus) протеиназ от­носится к группе сериновых и характеризуется свойствами, близкими к хи- мотрипсину, трипсину, проявляя аналогичные действия на мясные белки. Из­вестные стрептококковые протеиназы относятся к группе тиоловых, или, как их еще называют, «цистеиновых», к которой принадлежат папаин, фицин, бромелаин.

Наибольший интерес для обработки мясного сырья представляют раз­личные коллагеназы. Продуценты этих ферментов были обнаружены среди обширного представительства (Actinomyces rimosus, Streptomyces griseus, Ac­tinomyces fradiae 119 и др.), на основе некоторых разработаны бактериаль­ные препараты протелин и проназа, специфичные к гидролизу тропоколлаге­на с образованием мономеров.

Изучены протеолитические ферменты, полученные из бактерий рода Bacillus. Определенный интерес представляют грибные коллагеназы, на­пример, из Aspergillus.

Активное воздействие на коллагенсодержащее сырье установлено на примере ферментов, полученных из грибов рода Penicillium.

Экзогенные протеолитические ферменты, частично гидролизуя пептид­ные связи, способствуют повышению растворимости белков актомиозинового комплекса и увеличению продуктов их расщепления. Внесение ферментных препаратов в сырье в процессе посола мяса улучшает консистенцию готового продукта и облегчает атакуемость его белков ферментами желудочно­кишечного тракта человека. Ферментативный гидролиз белков мясного сырья сопровождается деструктивными изменениями мышечных волокон, разрыхле­нием соединительно - тканных прослоек, что повышает качество готовых продуктов. Эффективность этого процесса зависит от температуры, концен­трации вводимых растворов, рН среды и продолжительности воздействия на мясную систему. При этом может наблюдаться различная глубина протеоли­за. Поверхностный протеолиз, при котором происходит частичная деструкция белковых молекул, приводит к росту содержания свободных аминокислот и сопровождается некоторым улучшением консистенции мяса при полной со­хранности нативной макроструктуры. Глубокий протеолиз мяса выражается в деструкции всех четырех структурных уровней макромолекул белка, при этом резко увеличивается количество свободных аминокислот (до 20-30 % от общего их содержания в белке). Мясо сильно размягчается, практически пол­ностью изменяя свою исходную структуру. С учетом этого факта, все более перспективным представляется ферментативная модификация мясного сырья с высоким содержанием соединительной ткани.