Цель работы: ознакомиться с методами микробиологического исследования воздуха помещений.

Оборудование, реактивы: аппарат Кротова, стерильные чашки Петри, питательные среды – мясопептонный агар, сусло-агар.

Воздух производственных помещений на предприятиях пищевой промышленности может стать источником инфицирования посторонними микроорганизмами сырья и готовой продукции. Обычно в воздухе находятся различные микрококки, сарцины, неспорообразующие палочки, дрожжи, споры бактерий и мицелиальных грибов, могут встречаться и болезнетворные микроорганизмы.

При микробиологическом исследовании в 1 м3 воздуха определяют общее количество микроорганизмов, наличие плесневых грибов, а при необходимости – группу санитарно-показательных микроорганизмов: гемолитический стрептококк (посев на кровяной агар) и золотистый стафилококк (посев на желточно-солевой агар).

Для определения количества микроорганизмов в воздухе используют различные методы. Наиболее распространенными являются седиментационный и аспирационный методы.

11.1. Седиментационный метод Седиментационный метод (метод Коха) основан на оседании пылинок и капель вместе с микроорганизмами на поверхность питательной среды в открытых чашках Петри. Контроль воздуха помещений проводят следующим образом. Готовят две стерильные чашки Петри. Одну из них заливают расплавленным мясопептонным агаром (МПА), другую – сусло-агаром (СА). После застывания агара чашки переносят в исследуемое помещение, открывают крышки, сдвигают их на края бортиков так, чтобы вся поверхность питательной среды была открыта полностью. Чашки оставляют открытыми в течение 5, 10 или 15 мин в зависимости от степени загрязненности воздуха. Затем чашки закрывают, переворачивают вверх дном и помещают в термостат.

В н и м а н и е! Если чашки не переворачивать вверх дном, то конденсационная влага, выделяющаяся из агаризованной среды, бу-

дет попадать с внутренней стороны крышки на поверхность среды и размывать колонии микроорганизмов.

Чашки с МПА выдерживают при температуре 37 ºС в течение 24 ч, а чашки с СА – при 30 ºС в течение 48 ч.

Для определения количества микроорганизмов в 1 м3 воздуха пользуются формулой В.Л. Омелянского, согласно которой на поверхность чашки площадью 100 см2 оседает в течение 5 мин столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 дм3 воздуха:

Х = а 100 5 100/ST, где а – число колоний, выросших на чашке; 100 – пересчет площади чашки на 100 см2 ; 5 – экспозиция чашки по Омелянскому, мин; 100 – пересчет на 1 м3 воздуха; S – площадь чашки Петри (78,5 см2); Т – время экспозиции открытой чашки, мин.

11.2. Аспирационный метод Аспирационный метод (метод Кротова) основан на использовании щелевого аппарата конструкции Ю.А. Кротова. Прибор, смонтированный в портативном ящике, состоит из узла для отбора пробы, куда на специальную площадку помещают чашку Петри без крышки, электромотора, вентилятора и ротаметра. Вентилятор, вращаясь с частотой 4–5 тыс. об/мин, засасывает воздух, струя которого ударяется о поверхность питательной среды в чашке Петри, оставляя на ней мироорганизмы. Воздух выходит из прибора через ротаметр. Для равномерного распределения микроорганизмов на поверхности среды диск с чашкой вращается с частотой 60 об/мин. Скорость протягивания воздуха составляет 25 дм3/мин. При определении общей численности бактерий количество пропущенного воздуха должно составлять 100 дм3. Засеянные чашки вынимают из аппарата, закрывают их крышками, помещают на 24 ч в термостат при температуре 37 ºС, затем вынимают и оставляют при комнатной температуре на 24 ч. Подсчитывают число выросших колоний и производят перерасчет на 1 м3 воздуха:

Х = а V, где а – количество выросших на чашке колоний; V – объем пропущенного через прибор воздуха; 1000 – искомый объем воздуха, дм3.

Кроме количественной, дается качественная характеристика микрофлоры воздуха. Для этого проводят описание колоний бактерий, выросших на чашках Петри, и готовят микроскопические препараты из этих колоний. Описание колоний бактерий проводят, как это указано в разд. 5.3.

Результаты исследования оформляют в виде таблицы по форме табл. 11.1, микроскопические препараты из колоний зарисовывают в тетрадь.

Таблица 11.1

Изучение морфологии колоний бактерий, выросших на МПА

Санитарное состояние воздуха обследуемого помещения оценивают согласно санитарным нормам и правилам. В табл. 11.2 приведен фрагмент формы журнала санитарно-микробиологического контроля на предприятиях пищевой промышленности.

Таблица 11.2 Санитарно-микробиологический контроль на предприятии

Пользуясь данными, приведенными в табл. 11.2, дать заключение о микробиологической чистоте воздуха обследованного помещения.

Контрольные вопросы 1. Какими методами производят микробиологический анализ воздуха помещений?

2. Каковы критерии санитарной оценки воздуха производственных помещений на предприятиях пищевой промышленности?

3. Какие микроорганизмы наиболее часто встречаются в воздухе помещений?

12. САНИТАРНО-БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВОДЫ

Цель работы: изучение методов оценки санитарнобактериологического состояния питьевой воды и воды из естественных водоемов.

Вода, используемая на предприятиях пищевой промышленности, должна отвечать требованиям, предъявляемым к питьевой воде действующими нормативными документами. Безопасность воды в эпидемиологическом отношении определяют по общему числу микроорганизмов и количеству бактерий группы кишечных палочек в ее определенном объеме.

Качество воды централизованных систем питьевого водоснабжения определяют в соответствии с санитарными правилами и нормами. Питьевая вода должна быть безопасна в эпидемиологическом и радиационном отношениях, безопасна по химическому составу и иметь благоприятные органолептические свойства (табл. 12.1).

Таблица 12.1 Безопасность питьевой воды в эпидемиологическом отношении (по микробиологическим и паразитологическим показателям) СанПиН 2.1.4.1074–01

* БОЕ – бляшкообразующие единицы.

12.1. Отбор проб и подготовка их к анализу Воду для санитарно-бактериологического контроля отбирают в количестве 500 см3 в бутылки, предварительно простерилизованные в бумажных пакетах, с ватно-марлевой пробкой, покрытой сверху бумажным колпачком.

Перед отбором пробы кран или край трубы обжигают зажженным ватным тампоном, пропитанным спиртом. Открывают кран и в течение 10–15 мин воду спускают, затем производят отбор пробы. Вода подлежит анализу не позже чем через 2 ч после отбора.

Пробы воды из открытых водоемов – колодцев, бассейнов, рек, озер – отбирают с помощью батометров, представляющих собой металлический каркас с массивным свинцовым дном – грузилом. В металлический каркас вставлена бутылка. Батометр погружают на заданную глубину и открывают бутылку, потягивая за веревку, привязанную к пробке. После наполнения бутылки батометр извлекают и закрывают ее стерильной пробкой.

Пробы хлорированной воды берут во флаконы с дехлоратором, так как под действием хлора микробы в воде погибают. В качестве дехлоратора используют серноватистый натрий из расчета 10 мг на 500 см3 исследуемой воды.

К отобранным пробам воды прилагают сопроводительный документ с указанием соответствующих данных. Доставку проб питьевой воды осуществляют в контейнерах-холодильниках при температуре от 4 до 10 °С.

12.2. Определение общего микробного числа воды

Общее микробное число (ОМЧ) – это количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, образующих колонии на мясопептонном агаре при посеве 1 см3 воды с последующей инкубацией посевов при температуре 37±0,5 ºС в течение 48 ч. ОМЧ должно быть не более 50 КОЕ/см3.

В зависимости от степени предполагаемого загрязнения производят посев не менее двух различных объемов воды, выбранных с таким расчетом, чтобы на чашках вырастало от 30 до 300 колоний. Водопроводную и артезианскую воду засевают в неразведенном виде по 1 см3. При бактериологическом исследовании загрязненных вод делают посевы разведенной воды. Разведения готовят так, как указано в разделе 8.3.

Из исследуемого образца и из пробирок с его разведениями в соответствии со степенью предполагаемого микробного загрязнения отбирают по 1 см3, вносят в стерильные чашки Петри и заливают 10–12 см3 расплавленного и остуженного до температуры 45 ºС мясопептонного агара. Круговыми движениями руки, вращая чашки по го-

ризонтальной поверхности стола, распределяют их содержимое равномерным слоем по всей площади дна. После застывания агара чашки с посевами помещают на 24 ч в термостат при температуре 37 ºС. После инкубации подсчитывают число выросших колоний.

Определение микробного числа указанным методом позволяет выявить лишь мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы.

12.3. Определение содержания колиформных бактерий в воде С эпидемиологической точки зрения особенно важным является обнаружение в воде патогенных микроорганизмов – возбудителей кишечных инфекций (брюшного тифа, дизентерии, холеры и др.) Однако в связи с большой трудностью обнаружения патогенных микроорганизмов при бактериологических анализах ограничиваются определением так называемых санитарно-показательных микроорганизмов (СПМ). К санитарно-показательным относят микроорганизмы, постоянно находящиеся в естественных полостях человека или животных. Присутствие СПМ в различных объектах внешней среды является индикатором их загрязнения человеком. Чем больше СПМ во внешней среде, тем более вероятным становится присутствие специфических возбудителей инфекционных заболеваний.

В качестве СПМ наибольшее значение имеют бактерии группы кишечных палочек (БГКП). К группе кишечных палочек относят колиформные бактерии родов Escherichia, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Serratia.

При определении количества СПМ в воде используют следующие характеристики:

• коли-титр – наименьший объем воды, в котором обнаружена одна кишечная палочка. Для питьевой воды, прошедшей очистку, титр кишечной палочки должен быть не менее 300 см3;
• коли-индекс – количество кишечных палочек в 1 дм3 воды. Коли-индекс для питьевой воды должен быть не более 3.

Колиформные бактерии определяют в воде методом мембранных фильтров или бродильным методом.

Бродильный метод. Сущность бродильного метода заключается в посеве определенных объемов исследуемой воды, инкубации

посевов при температуре 37 ºС в средах накопления с последующим высевом на среду Эндо, дифференциацией выросших колоний и определением наиболее вероятного числа БГКП в 1 дм3 воды.

При исследовании воды централизованного водоснабжения исследуемый материал дважды засевают в три объема: 100, 10 и 1 см3. Для исследования речной, озерной, прудовой воды готовят десятикратные разведения 1:10, 1:100, 1:1000 и засевают еще 10 см3 и 1 см3 без разведения. Посев воды производят в бродильные сосуды (колбы, бутылки, пробирки с поплавками), заполненные глюкозопептонной средой Эйкмана. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 ºС в течение 24 ч.

Обработка результатов анализа. По окончании инкубации посевы просматривают и делают следующие выводы:

а) при отсутствии газообразования и изменения цвета среды дают отрицательный ответ на наличие БГКП в исследуемом объеме воды, дающим право закончить исследование через 24 ч;

б) при образовании кислоты и газа производится высев материала из бродильных сосудов на среду Эндо. Высев делается бактериологической петлей густым штрихом для получения изолированных колоний. Чашки с посевами инкубируют при температуре 37 ºС в течение 24 ч. После инкубации посевы просматривают. Отсутствие на среде Эндо характерных для кишечных палочек колоний дает основание на выдачу отрицательного ответа и окончание исследования;

в) при обнаружении на среде Эндо лактозоположительных темно-красных колоний, с металлическим блеском или без него, необходимо установить принадлежность выросших микроорганизмов к семейству кишечных бактерий. С этой целью производится микроскопирование препарата из колоний и постановка оксидазного теста.

Оксидазный тест предложен для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от грамотрицательных бактерий семейства Pseudomonodaceae и других водных сапрофитов, которые, в отличие от кишечных бактерий, вырабатывают фермент оксидазу.

Для постановки оксидазного теста со среды Эндо снимают петлей по 2–3 колонии каждого типа. Микробную массу наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную специальным реактивом (30 г ά-д-нафтола растворяют в 2,5 см3 этанола, прибавляют 7,5 см3 дистиллированной воды и 40 мг диметил-парафенилендиамина. Раствор готовят непосредственно перед определением).

При отрицательном результате оксидазного теста бумага при контакте с колонией цвета не меняет. Если же бумага синеет в течение 1 мин при контакте с колонией, то оксидазный тест считают положительным.

Наличие в препарате грамотрицательных неспорообразующих палочек, не обладающих оксидазной активностью, позволяет немедленно дать ответ о наличии в воде БГКП.

При обнаружении на среде Эндо розовых и бесцветных колоний ведут подсчет и пересевают 2–3 изолированные колонии каждого типа в глюкозо-пептонную среду Эйкмана. Посевы инкубируют при температуре 37 ºС в течение 3–4 ч. При образовании кислоты (изменение цвета среды) и газа, накапливающегося в поплавке, результат считается положительным, при отсутствии кислото- и газообразования – отрицательным.

После проведения анализа записывают в лабораторный журнал окончательные результаты (положительные и отрицательные) по каждому засеянному объему и определяют коли-титр и коли-индекс.

Метод мембранных фильтров. Сущность метода заключается в концентрировании бактерий из определенного объема воды на мембранных фильтрах с последующим выращиванием их на среде Эндо при температуре 37 ºС, дифференцированием выросших колоний и подсчетом количества БГКП в 1 см3 воды.

Подготовка мембранных фильтров. Для фильтрования воды отбирают мембранные фильтры № 3, помещают их в подогретую до температуры 80 ºС дистиллированную воду и ставят на небольшой огонь для кипячения. Кипячение проводят трижды по 10 мин. После первого и второго кипячения воду сливают, а после третьего фильтры оставляют в воде до употребления.

Подготовка фильтровального аппарата. Фильтровальный аппарат стерилизуют в автоклаве или протирают ватным тампоном, смоченным в спирте, и обжигают в целях стерилизации. На столик фильтровального аппарата стерильным пинцетом помещают мембранный фильтр. Во избежание повреждения фильтра под него подкладывают кружок стерильной фильтровальной бумаги. На фильтровальный столик с положенными на него фильтрами устанавливают и закрепляют верхнюю часть прибора – воронку (рис. 12.1).

Фильтрование воды и выращивание микроорганизмов. В воронку фильтровального аппарата стерильно наливают исследуемый объем воды и с помощью водоструйного насоса создают вакуум

в приемном сосуде. При анализе питьевой воды, поступающей в водопроводную сеть, необходимо брать объем не менее 333 см3. По окончании фильтрования мембранный фильтр профламбированным пинцетом переносят на поверхность питательной среды Эндо в чашки Петри. В настоящее время выпускают фильтры, пропитанные соответствующими питательными средами. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 ºС в течение 18–24 ч.

Рис. 12.1. Определение количества микроорганизмов методом мембранных фильтров Обработка результатов анализа. По окончании инкубации посевы просматривают и делают следующие выводы:

а) отсутствие микробного роста на фильтрах или обнаружение на них колоний, не характерных для БГКП, позволяет закончить ис-

следования на этом этапе анализа с выдачей отрицательного результата на присутствие БГКП в анализируемом объеме воды;

б) при обнаружении на фильтре колоний, характерных для БГКП, исследование продолжают. Из нескольких колоний каждого типа готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Отсутствие в мазках мелких грамотрицательных неспороносных палочек является основанием для прекращения анализа с выдачей отрицательного результата на присутствие БГКП в исследуемом объеме воды;

в) при наличии в мазках грамотрицательных палочек, морфологически сходных с кишечными, ставится оксидазная проба. При обнаружении на мембранных фильтрах однотипных лактозоположительных колоний (темно-красных с металлическим блеском или без него), не вырабатывающих оксидазы, анализ воды на этом этапе заканчивают и подсчитывают число выросших на мембранном фильтре колоний кишечных палочек. Результат выражают в виде колииндекса в пересчете на 1 дм3 воды;

г) при обнаружении на мембранных фильтрах розовых и бесцветных колоний подсчитывают их число и пересевают 2–3 изолированные колонии каждого типа в глюкозо-пептонную среду Эйкмана. После инкубации в течение 3–4 ч при температуре 37 ºС отмечают изменение цвета среды за счет образования кислоты и накопления газа в поплавке. В этом случае результат считается положительным. Если изменений в среде нет, то дают отрицательный результат на присутствие БГКП.

Пример определения колииндекса: профильтровано три объема воды по 100 см3. На первом и втором фильтрах выросло по три колонии, на третьем – девять колоний. Всего выросло пятнадцать колоний. Таким образом, колииндекс исследуемого образца воды равен: (1000×15):300 = 50. Колииндекс переводится в колититр следующим образом: 1000:50 = 20.

Контрольные вопросы 1. Какие Вы знаете показатели эпидемиологической безопасности питьевой воды?

2. Что такое общее микробное число, колититр и колииндекс? 3. Какие роды микроорганизмов входят в БГКП? 4. Какими методами определяют колиформные бактерии? 5. Каковы основные критерии, по которым устанавливают присутствие колиформных бактерий в питьевой воде?

6. С какой целью проводят тест на оксидазу?

13. САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОЧВЫ

Цель работы: провести микробиологическое исследование почвы как источника контаминации пищевых продуктов посторонними микроорганизмами.

Почва обильно заселена микроорганизмами. В ней встречаются все формы микроорганизмов, которые существуют на Земле: бактерии, вирусы, актиномицеты, дрожжи, грибы, простейшие. Общее микробное число (ОМЧ) в 1 г почвы может достигать от 1,0 до 10 млрд. В разных слоях почвы количество микроорганизмов неодинаково. В самом верхнем слое (0,5 см) микроорганизмов очень мало. На глубине от 1–5 см до 30–40 см число микроорганизмов максимально – в среднем от 10 до 50 млн в 1 г. После 30–40 см глубины ОМЧ постепенно снижается и в более глубоких слоях оно минимально.

Микрофлору почвы делят на 2 группы: 1) аутотрофная – питается минеральными веществами; 2) гетеротрофная – питается органическими веществами. Обе группы участвуют в процессах самоочищения почв, их минерализации. Однако в группе гетеротрофных микроорганизмов может присутствовать патогенная микрофлора. При загрязнении почвы фекалиями людей, больных кишечными инфекциями, продукты растительного происхождения могут быть контаминированы возбудителями дизентерии, холеры, брюшного тифа, сальмонеллеза, энтеровирусами. Установлена прямая зависимость между уровнем заболеваемости человека и животных кишечными инфекциями и неудовлетворительным санитарным состоянием почвы. Через почву передаются возбудители таких инфекционных заболеваний, как сибирская язва, газовая гангрена, столбняк и др.

При санитарно-микробиологическом анализе почвы определяют общее микробное число, колититр, перфрингенс-титр, титр нитрифицирующих бактерий и количество протеев и термофильных бактерий. Микробное число характеризует загрязненность почвы органическими веществами. Присутствие в почве бактерий группы кишечных палочек свидетельствует о ее фекальном загрязнении. Обнаружение в почве палочки Clostridium perfringens также указывает на ее фекальное загрязнение. Наличие в почве бактерий рода Proteus дает основание считать возможным загрязнение почвы органическими веществами животного происхождения или фекалиями человека. Присутствие термофильных микроорганизмов указывает на загряз-

нение почвы навозом или компостами. В чистых почвах термофильные микроорганизмы, как правило, не обнаруживаются.

Взятие проб почвы. При проведении микробиологических исследований поверхностных слоев почвы образцы берут на глубине 15–20 см, снимая верхний слой толщиной 2 см (из разных мест исследуемой территории не менее 10 проб). Отбирают пробы маленькой железной лопаткой или совком в стерильные широкогорлые банки, завернутые в бумагу и снабженные этикеткой. Каждый взятый образец должен весить 200–300 г, а смешанный образец (средняя проба) – не менее 1 кг.

Подготовка почвы для анализа. Образцы почвы освобождают от крупных включений, размельчают, просеивают через стерильное 3-миллиметровое сито, затем пробу почвы высыпают на стерильную бумагу, тщательно перемешивают и отвешивают 10 г. Навеску почвы помещают в колбу емкостью 250 см3 с 90 см3 стерильной водопроводной воды. Получают разведение 1:10, которое соответствует 0,1 г исследуемой почвы. Колбу встряхивают в течение 10 мин, дают отстояться грубым частицам почвы в течение 30 с и затем делают от 3 до 6 десятикратных разведений в зависимости от загрязненности почвы.

13.1. Определение микробного числа почвы В две стерильные чашки Петри, слегка приоткрыв крышку, вносят по 1 см3 10–4 и 10–5 разведений почвенной суспензии и затем заливают их расплавленным и охлажденным до 45 ºС питательным агаром (МПА или картофельно-глюкозный агар). После застывания агара чашки помещают в термостат на 24–48 ч при температуре 37±2 ºС, а затем выдерживают столько же при комнатной температуре. Подсчитывают число выросших на чашках колоний и определяют микробное число в 1 г почвы с учетом засеянного разведения.

13.2. Определение колититра почвы Наличие бактерий группы кишечных палочек свидетельствует о свежем фекальном загрязнении почвы. Титром кишечной палочки (колититр) называют наименьшее количество почвы (в г), в котором обнаруживаются кишечные палочки. Колииндексом почвы называют количество кишечных палочек в 1 г почвы.

Для определения колититра по 1 см3 разведений почвенной суспензии от 10–1 до 10–5 засевают в пробирки со средой Кесслера, в которых находятся поплавки. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37 ºС в течение 18–24 ч, после чего отмечают накопление газа в поплавках.

13.3. Определение перфрингенс-титра почвы Перфрингенс-титр – титр грамположительных облигатноанаэробных спорообразующих палочек, восстанавливающих сульфиты. Присутствие C. perfringens (споровых форм) свидетельствует о давнем фекальном загрязнении.

Для определения перфрингенс-титра используют железо-сульфитный агар (среда Вильсона–Блера). Обнаружение C. perfringens на этой среде основано на способности данного микроорганизма восстанавливать Na2S2O3 до Na2S, который, взаимодействуя с хлорным железом, приводит к образованию сернистого железа (FeS), имеющего черный цвет.

Пробирки с разведениями почвенной суспензии прогревают на водяной бане с температурой 80–85 ºС в течение 15 мин. Затем пробирки охлаждают до комнатной температуры и засевают по 1 см3 разведений почвенной суспензии от 10–1 до 10–4 в пробирки с расплавленной и охлажденной до 45 ºС средой Вильсона–Блера. Вращением пробирки между ладонями почвенную суспензию равномерно распределяют в среде, после чего пробирки охлаждают в проточной водопроводной воде до застывания агара. Посевы инкубируют в течение 18–24 ч при температуре 43 ºС. О наличии C. perfringens судят по росту черных колоний в пробирках со средой.

13.4. Определение количества термофильных микроорганизмов в почве Для определения индекса термофильных бактерий в стерильные чашки Петри вносят по 1 см3 разведений почвенной суспензии от 10–1 до 10–3, заливают их расплавленным и охлажденным до 45 ºС МПА. После застывания агара чашки инкубируют в течение 24 ч при температуре 60 ºС, после чего подсчитывают число выросших колоний и определяют количество термофильных бактерий в 1 г почвы с учетом разведения.

13.5. Обнаружение в почве палочек протея Бактерии рода Proteus попадают из почвы на пищевые продукты и при благоприятных условиях размножаются в них. Продукты жизнедеятельности палочек протея могут вызвать пищевое отравление.

Для обнаружения в почве палочек протея по методу Шукевича в конденсационную воду свежескошенного МПА вносят 0,1 см3 соответствующего разведения почвенной суспензии. Пробирки выдерживают в течение 24–48 ч в термостате при температуре 37 ºС, после чего регистрируют рост протеев по образованию тонкой вуалевидной пленки на скошенной поверхности агара. При наличии такой пленки готовят микроскопический препарат с ее поверхности, окрашивают его по Граму, определяют подвижность и способность образовывать Н2S.

Результаты санитарно-микробиологического исследования почвы анализируют и дают ей оценку, пользуясь данными, приведенными в табл. 13.1.

Таблица 13.1 Схема оценки санитарного состояния почвы по микробиологическим показателям

Контрольные вопросы 1. В каких слоях почвы меньше всего микроорганизмов? 2. Какие группы микрооорганизмов определяют в почве? 3. Возбудители каких инфекционных заболеваний могут встречаться в почве?

4. Как осуществляют взятие пробы почвы и ее подготовку к анализу?

5. Что такое колититр и колииндекс почвы?

14. ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИЙ, ВЫЗЫВАЮЩИХ ПОРЧУ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Цель работы: ознакомиться с морфологическими и физиологическими признаками бактерий, наиболее часто размножающихся на пищевых продуктах и вызывающих их порчу.

14.1. Род Micrococcus Представители рода Micrococcus имеют клетки сферической формы диаметром 0,5–2,0 мкм, располагающиеся поодиночке или в неправильных скоплениях. У некоторых видов микрококков наблюдается тенденция к соединению клеток в тетрады. Микрококки грамположительны, неподвижны, спор не образуют.

Облигатные аэробы. Каталазоположительны. Многие представители этого рода образуют пигменты, в результате чего колонии окрашены в белый, желтый, оранжевый, розовый, золотистый цвет.

Род Micrococcus luteus (рис. 14.1). Клетки крупные, диаметром до 1,5 мкм, располагаются одиночно. На плотной среде образует круглые выпуклые колонии правильной формы с блестящей поверхностью желтого цвета.

Micrococcus roseus. Клетки мелкие диаметром около 0,6 мкм. На плотной среде образует круглые блестящие колонии небольшого размера с ровными краями, окрашенные в розовый цвет.

Оптимальная температура роста микрококков от 25 до 30 ºС. Отдельные виды могут выдерживать нагревание до 63–65 ºС в течение 30 мин и кратковременную пастеризацию при температуре 72–75 ºС.

Микрококки часто встречаются в воздухе, откуда попадают в пищевые продукты. Интенсивное размножение микрококков в молоке приводит к появлению в нем горького вкуса и свертыванию при низкой кислотности (40–60 ºТ), что обусловлено их способностью выделять фермент типа сычужного. В сгущенном молоке с сахаром наряду с появлением горького вкуса образуются хлопья или происходит его загустевание. При размножении на поверхности пищевых продуктов микрококки образуют окрашенные в разные цвета пигментные пятна.

14.2. Род Enterococcus По современной систематике, род Enterococcus входит в семейство Enterococcaceae, порядок Lactobacillales. Энтерококками называют стрептококки кишечного происхождения, они являются представителями нормальной микрофлоры кишечника человека и животных. В настоящее время энтерококки, как и кишечные палочки, считаются санитарно-показательными микроорганизмами.

Клетки энтерококков сферические или овальные диаметром от 0,6 до 2,5 мкм, располагаются попарно или цепочками (рис. 14.2). Грамположительные, неподвижные, спор и капсул не образуют.

Рис. 14.2. Enterococcus faecalis

По отношению к кислороду воздуха энтерококки являются факультативными анаэробами. На поверхности плотных питательных сред образуют мелкие выпуклые бесцветные колонии, глубинные колонии напоминают лодочку. Типичными представителями рода являются Enterococcus faecalis, E. faecies.

Энтерококки осуществляют метаболизм бродильного типа, сбраживают углеводы с образованием, в основном, молочной кислоты. Оптимальная температура роста энтерококков 30–37 ºС, температурный диапазон роста от 10 до 45 ºС. Энтерококки довольно устойчивы к воздействию факторов внешней среды, выдерживают кратковременное нагревание до температуры 75–80 ºС, могут расти в среде, содержащей 6,5 % хлорида натрия, и в щелочной среде с рН 9,6. Энтерококки расщепляют белки с образованием горьких пептидов, что приводит к появлению горечи в пищевых продуктах.

14.3. Род Sarcina Род Sarcina включен в семейство Peptococcaceae. Клетки почти сферические, диаметром 1,5–3,0 мкм, собранные в пакеты (кубы) по восемь или более кокков, поскольку деление клеток происходит в трех взаимно перпендикулярных плоскостях (рис.14.3).

Грамположительные, неподвижные, не образующие эндоспор. Исключение составляет вид Sporosarcina urea, имеющий жгутики и образующий споры.

Тип питания – хемоорганотрофы. Типовой вид – Sarcina ventriculi.

Рис. 14.3. Sarcina ventriculi

На поверхности плотной среды в чашках Петри сарцины образуют округлые, выпуклые колонии средних размеров с ровными краями, гладкие или бугристые, зернистой структуры, желтого, лимонно-желтого, иногда розового или белого цвета. Вызывают пигментацию пищевых продуктов.

14.4. Род Staphylococcus Стафилококки встречаются в основном на кожных покровах и слизистых оболочках теплокровных животных, но часто могут быть выделены из воздуха, пищевых продуктов. Некоторые виды способны вызывать оппортунистические инфекции у человека и животных

Клетки бактерий рода Staphylococcus имеют сферическую форму диаметром 0,5–1,5 мкм, встречаются поодиночке или парами, а также образуют характерные неправильные скопления, напоминающие виноградную гроздь, что является результатом деления клеток в трех взаимно перпендикулярных плоскостях (рис.14.4).

Стафилококки грамположительны, неподвижны, спор и капсул не образуют.

Факультативные анаэробы. Это хемоорганотрофы, обладающие дыхательным и бродильным типами метаболизма.

На плотной среде стафилококки образуют круглые, выпуклые, блестящие колонии белого, желтого или золотистого цвета. Основными представителями рода являются S. epidermidis, S. saprophyticus, S. aureus (золотистый стафилококк).

Рис. 14.4. Staphylococcus aureus

Оптимальная температура роста стафилококков 30–37 ºС. Представители этого рода устойчивы к повышенной температуре, которая применяется при тепловой обработке пищи. Размножение золотистого стафилококка в пищевых продуктах вызывает в них накопление экзотоксина, являющегося причиной пищевых отравлений.

14.5. Род Escherichiа Род Escherichiа относится к семейству Enterobacteriaceae. Типичные представители этого рода – мелкие грамотрицательные палочки с закругленными концами размером (0,5–0,7)×(2,0–3,0) мкм. В мазках располагаются беспорядочно. Подвижные в жидких средах за счет перитрихиально расположенных жгутиков. У большинства клеток обнаруживаются пили. Спор, цист и капсул не образуют. Типовой вид Escherichia coli.

Escherichia coli – кишечная палочка (рис. 14.5) – факультативный анаэроб, хорошо растет на простых питательных средах при оптимальной температуре 37 ºС. Колонии на мясопептонном агаре гладкие, блестящие, с ровными краями, слабовыпуклые, сероватые.

Размножение кишечных палочек в пищевых продуктах приводит к развитию таких пороков, как нечистый вкус, вспучивание.

Присутствие кишечной палочки в пищевых продуктах является показателем нарушения санитарного режима на производстве.

14.6. Род Proteus Род Proteus относится к семейству Enterobacteriaceae. Представители рода часто встречаются в кишечнике человека, животных, в навозе, почве и загрязненных водах. Протеи легко идентифицировать благодаря их способности к роению. Роение протеев приводит к образованию вуалевидного налета на поверхности плотной питательной среды. Типовой вид – Proteus vulgaris.

Proteus vulgaris (палочка протея). Клетки протеев – мелкие грамотрицательные палочки размером (0,4–0,6)×(1,0–3,0) мкм. Не образуют эндоспор и капсул. Очень подвижны – перитрихи (рис. 14.6).

Факультативные анаэробы. Хемоорганотрофы, обладающие дыхательным и бродильным типами метаболизма. Оптимальная температура роста 37 ºС.

Рис. 14.6. Proteus vulgaris Палочка протея обладает активными протеазами и вызывает гнилостную порчу мяса и мясных изделий, рыбы, молочных продуктов. При разложении белков образует сероводород, аммиак и индол. Размножение протеев в продуктах может привести к пищевому отравлению.

14.7. Род Pseudomonas Род Pseudomonas относится к семейству Pseudomonodaceae. Псевдомонады широко распространены в природе. Их обнаруживают в почве, воде, пищевых продуктах. Клетки псевдомонад – мелкие грамотрицательные палочки размером (0,5–1,0)×(1,5–5,0) мкм, спор и капсул не образуют, подвижны за счет одного или нескольких полярно расположенных жгутиков.

Строгие аэробы. На плотных средах образуют круглые или неправильной формы колонии, плоские и выпуклые, слизистые, часто пигментированные. Метаболизм только дыхательного типа с использованием кислорода в качестве конечного акцептора электронов. Способны расти в диапазоне температур от 4 до 43 ºС.

Pseudomonas fluorescens (флюоресцирующая палочка), образует на питательном агаре крупные слизистые колонии, окрашенные в желтый или желто-зеленый цвет, часто флюоресцирующие (рис. 14.7).

Рис.14.7. Pseudomonas fluorescens Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка), выделяет в среду синий пигмент пиоцианин, поэтому ее колонии окрашены в синий цвет. Является условно-патогенным микроорганизмом.

Большинство псевдомонад являются психрофилами, способными размножаться при низких температурах хранения пищевых продуктов (от 2 до 4 ºС).

Псевдомонады обладают активными протеолитическими и липолитическими ферментами, вызывая распад белков и жиров, что приводит к быстрой порче мясных, молочных и рыбных продуктов.

14.8. Род Bacillus Род Bacillus относится к семейству Bacillaceae. Бактерии этого рода представляют собой палочки разной длины и толщины, грамположительные, в большинстве подвижные, образующие эндоспоры.

Аэробы или факультативные анаэробы. Хемоорганотрофы, метаболизм дыхательного или бродильного типа.

Bacillus subtilis (сенная палочка) – тонкие, короткие, грамположительные палочки размером (0,5–2,5)×(3,0–5,0) мкм, располагающиеся одиночно или цепочками. Клетки подвижные за счет перитрихиально расположенных жгутиков. Споры овальные, размером от 0,6 до 0,9 мкм, занимают центральное положение внутри клетки (рис. 14.8, а).

На мясопептонном агаре B. subtilis образует сухие морщинистые или бархатистые плоские колонии с волнистым краем, бесцветные или розоватые.

Споры сенной палочки весьма термоустойчивы, выдерживают кратковременную стерилизацию. Оптимальная температура роста 25–37 ºС. Сенная палочка относится к гнилостным бактериям, она обладает активными протеазами, разлагающими белки молока, мяса, а также амилазами, вызывающими «картофельную болезнь» хлеба.

Bacillus megaterium (земляная палочка, от лат. terra – земля) – крупные зернистые палочки с закругленными концами размером (5–7)×(1,2–1,5) мкм, располагающиеся длинными цепочками. Споры эллиптические, располагающиеся в центре клетки (рис. 14.8, б).

На плотной питательной среде образует крупные, гладкие, матовые или блестящие колонии с волнисто-бахромчатыми краями, серовато-белые. Обладает активными протеазами, расщепляет углеводы с образованием кислоты.

Bacillus mycoides (грибовидная палочка) – мелкие палочки размером (5–7)×(0,8–1,2) мкм, в цитоплазме имеются вакуоли и гранулы запасных питательных веществ. Споры овальной формы (рис. 14.8, в).

На питательном агаре образует колонии, напоминающие рост гриба: ризоидные или мицелевидные, стелющиеся по поверхности агара.

Грибовидная палочка обладает активными протеазами, разлагает белки с образованием горьких пептидов.

Bacillus cereus (от лат. cera – восковой) – короткие толстые клетки размером (3–5)×(1,0–1,5) мкм, одиночные или соединенные в цепочки. Споры овальные (1,5×0,9) мкм, располагаются субтерминально (смещены от центра к концу клетки).

Колонии на питательном агаре восковидные, толстые, матовые со складчатым центром и ризоидными волнистыми краями, иногда

мелкобугристые с бахромчатыми краями, от которых отходят тонкие сплетения нитей.

а б в

Рис. 14.8. Род Bacillus: а – Bacillus subtilis; б – Bacillus megaterium; в – Bacillus mycoides B. cereus является потенциально опасным микробом, так как контаминированные им пищевые продукты могут вызвать отравление.

14.9. Род Clostridium Род Clostridium входит в семейство Clostridiaceae. Палочковидные бактерии, грамположительные, в молодом возрасте, как правило, подвижные (перитрихи). Образуют эндоспоры, которые обычно превышают диаметр клетки.

Строгие анаэробы. Одни представители клостридий являются сахаролитическими, которые расщепляют сахара при маслянокислом и ацетоно-бутиловом брожении; другие – протеолитическими, вызывающими гнилостные процессы. Некоторые клостридии способны провоцировать пищевые отравления: ботулизм – возбудитель Clostridium botulinum, токсикоинфекции – возбудитель Clostridium perfringens. Среди клостридий встречаются и патогенные для человека виды, являющиеся возбудителями газовой гангрены (Clostridium septicum, C. perfringens, C. novyi), столбняка (Clostridium tetani).

Clostridium butyricum – маслянокислые бактерии. Крупные палочки размером (0,5–1,5)×(5–12) мкм, грамположительные, подвижные до момента спорообразования. Споры располагаются терминаль-

но или субтерминально. Клетки со спорами имеют вид булавы, теннисной ракетки или ложки.

Маслянокислые бактерии относятся к группе сахаролитических клостридий; они сбраживают углеводы с образованием масляной, уксусной, муравьиной кислот и большого количества газов, в связи с чем вызывают такие пороки пищевых продуктов, как прогорклый вкус, бомбаж консервов, вспучивание сыров.

Clostridium perfringens – крупная палочка размером (1–2)×(5–8) мкм, в отличие от других клостридий неподвижная, в организме человека и животных образует капсулу. Споры располагаются терминально или субтерминально (рис. 14.9).

Хемоорганотрофы, метаболизм бродильного типа. На плотной среде бактерии образуют мелкие круглые колонии с гладким или зубчатым краем. При росте на кровяном агаре колонии палочки перфрингенс круглые, гладкие, сероватые, впоследствии приобретающие зеленую окраску и окруженные зоной β-гемолиза.

Бактерии этого вида синтезируют ряд ферментов агрессивности: лецитиназу, коллагеназу, гиалуронидазу и др.

Рис. 14.9. Clostridium perfringens Палочка перфрингенс относится к сахаролитическим клостридиям. Этот вид вызывает быстрое свертывание молока с образованием губчатого сгустка. Споры термоустойчивы, способны выдержать кипячение в течение 2 ч. Обладает сульфитредуцирующей способностью. Некоторые серологические варианты этого вида (А и С) образуют эндотоксины, поэтому способны вызвать пищевые токсикоинфекции.

Clostridium putrificum – крупная грамположительная палочка, имеющая овальные споры, располагающиеся на конце клетки. Микроб относится к группе протеолитических бактерий, разлагает белки с образованием сероводорода и аммиака. Вызывает порок «гниющий сыр».

Clostridium sporogenes – подвижная палочка длиной 3–4 мкм и диаметром 0,9 мкм с закругленными концами. Крупные овальные споры располагаются в центре клетки. Характерным является быстрое образование спор (в течение первых суток роста). Сбраживает углеводы с образованием кислоты и газа. При разложении белков наблюдается обильное выделение сероводорода. Оптимальная температура роста от 35 до 40 ºС, минимальная 8 ºС. Является возбудителем порчи баночных мясных, рыбных, овощных консервов.

Clostridium botulinum – крупные палочки размером (3,4–8,6)×(1,0–1,3) мкм, грамположительные, подвижные до момента спорообразования, капсул не образуют. Споры располагаются терминально. Клетки со спорами имеют вид теннисной ракетки, лодочки, ложки (рис. 14.10).

Рис. 14.10. Clostridium botulinum C. botulinum образует два экзотоксина: нейротоксин и гемолизин. Накопление в пищевых продуктах нейротоксина приводит к тяжелому пищевому отравлению, часто с летальным исходом.

Контрольные вопросы 1. Какие виды порчи пищевых продуктов вызывают бактерии, обладающие высокой протеолитической активностью?

2. Какие из описанных бактерий вызывают пищевые отравления? 3. Как относятся к кислороду воздуха бациллы и клостридии? 4. Перечислите роды бактерий, образующие и не образующие эндоспоры.

5. Какие из указанных родов относятся к семейству Enterobacteriaceae?

15. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ 15.1. Определение количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ)

Микробиологическое исследование пищевых продуктов проводят с целью выявления КМАФАнМ путем высева на чашки Петри с питательной средой (мясопептонным агаром) или отдельных групп микроорганизмов путем высева на элективные питательные среды. Количество микроорганизмов определяют в 1 см3 продукта жидкой консистенции или в 1 г продукта плотной консистенции.

Отбор средней пробы. При анализе партии продукта готовят среднюю пробу. Для разных пищевых продуктов установлены нормы отбираемых средних проб и правила их отбора. Однако во всех случаях необходимо соблюдать условия, исключающие контаминацию исследуемого продукта посторонними микроорганизмами.

При исследовании жидкие и полужидкие продукты (молоко, сметана, соусы и др.) тщательно перемешивают и затем отбирают в стерильную посуду простерилизованным черпаком емкостью 50–100 см3. Пробы плотных продуктов (мясо, колбаса, рыба, кулинарные изделия и др.) отбирают из толщи продукта в разных местах. Предварительно поверхность исследуемых участков прижигают раскаленным ножом и по ней делают глубокий разрез стерильным скальпелем. Края разреза раздвигают стерильным пинцетом и вырезают стерильными ножницами небольшие кусочки продукта. Отобранные таким образом из разных мест образцы измельчают, собирают в стерильную тару и составляют из них среднюю пробу.

При оборе средней пробы таких продуктов, как сливочное масло, творог, сыр используют стерильный щуп, который вводят в продукт с одного края и доводят до противоположного вглубь и наискосок. Затем стерильным скальпелем из нескольких мест отобранной пробы берут кусочки, измельчают их и помещают в стерильную посуду.

Подготовка пробы к анализу. При исследовании плотных продуктов из средней пробы берут навеску массой от 1 до 10 г, переносят ее в стерильную ступку и тщательно растирают. Если продукт очень плотный, то его растирают в ступке с предварительно прогретым кварцевым песком. Растертый продукт вносят в колбу, содержа-

щую от 90 до 99 см3 стерильного физиологического раствора (0,5 %-й раствор хлорида натрия). Содержимое колбы осторожно взбалтывают в течение 5 мин. В колбе получается первое разведение продукта (1:10), из которого готовят последующие разведения.

Навеску сливочного масла расплавляют на водяной бане при температуре не выше 45 °С, после чего в 9 см3 физиологического раствора вносят стерильной пипеткой 1 см3 продукта, получая разведение 1:10.

Для исследования жидких и полужидких продуктов из полученной средней пробы после тщательного перемешивания отбирают стерильной пипеткой 1 см3 продукта и вносят его в пробирку, содержащую 9 см3 стерильного физиологического раствора.

Приготовление разведений. Пищевые продукты могут содержать значительное количество микроорганизмов, поэтому, чтобы получить изолированные колонии, необходимо приготовить десятикратные разведения продукта.

Полученное 1-е разведение продукта тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, вбирая в нее и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру выполняют 3–5 раз, затем той же пипеткой отбирают 1 см3 суспензии и переносят еѐ во 2-ю пробирку с 9 см3 стерильного физиологического раствора. Получают 2-е разведение (1:100). Пипетку нельзя погружать в жидкость во избежание смывания микроорганизмов с ее наружной поверхности. Новой стерильной пипеткой тщательно перемешивают содержимое 2-го разведения, набирают из него 1 см3 и переносят в следующую пробирку с 9 см3 стерильной воды, получая третье разведение (1:1000). Таким же образом готовят последующие разведения до получения необходимого результата.

В н и м а н и е ! Для приготовления каждого разведения следует использовать отдельную стерильную пипетку. Пренебрежение этим правилом может привести к получению ошибочного результата.

Посев в чашки Петри. Для определения КМАФАнМ используют метод глубинного посева на плотные питательные среды. Схема посева приведена на рис. 15.1. На крышках чашек стеклографом отмечают исследуемый вариант и разведение. Каждое разведение высевают не менее чем в 2–3 параллельные чашки. Разведения выбирают с таким расчетом, чтобы на чашке выросло от 30 до 300 колоний. Стерильной пипеткой отбирают из пробирки по 1 см3 соответствующего разведения суспензии и переносят его в 2–3 пустые стерильные чашки Петри. После внесения разведения суспензии чашки заливают питательной средой не позднее чем через 15 мин. Для этого над пла-

менем спиртовки вынимают пробку из пробирки или колбы с расплавленной и остуженной до 45алом, после чего оставляют на 10–15 мин в горизонтальном положении–50 ºС питательной средой и обжигают края. Затем приоткрывают крышку чашки так, чтобы только вошло горлышко колбы, и осторожно вливают 10–15 см3 питательного агара, толщина слоя которого должна быть около 5 мм. Чашку закрывают крышкой и сразу же легкими вращательными движениями перемешивают питательную среду с посевным матери для застывания среды. Засеянные чашки переворачивают вверх дном и помещают на 24–48 ч в термостат с температурой 37±1 °С.

Рис. 15.1. Схема посева продукта для определения КМАФАнМ Подсчет выросших колоний. После инкубации отбирают чашки, на которых выросло от 30 до 300 колоний, подсчитывают их визуально или с помощью специального прибора для подсчета колоний. При подсчете колоний чашки просматривают в проходящем свете и отмечают подсчитанные колонии чернилами или тушью. В случае, если на чашке с максимальным разведением выросло более 300 коло-

ний, можно вести их подсчет при помощи лупы и сетки из оргстекла со стороной квадрата 1 см при боковом освещении. Подсчет колоний проводят не менее чем в 20 квадратах, определяют среднее их число на 1 см2 и умножают на площадь поверхности среды в чашке.

Количество микроорганизмов в 1 см3 (или в 1 г) продукта (КМАФАнМ) определяют как произведение количества выросших колоний (N) на показатель разведения (n):

КМАФАнМ = N 10n КОЕ/см3. Примечание. Анаэробные микроорганизмы не определяются чашечным методом, так как для их выращивания необходимо создать анаэробные условия. Культивирование анаэробов осуществляют в анаэростатах (см. рис. 4.1) или используют питательные среды с редуцирующими веществами.

15.2. Определение бактерий группы кишечных палочек (БГКП) в пищевых продуктах Определение БГКП в пищевых продуктах проводят в соответствии с ГОСТ Р 50474–93. Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечной палочки (колиформных бактерий).

Метод определения БГКП основан на обнаружении образования газа и кислоты при высеве определенного количества продукта (или смыва с его поверхности) в жидкие питательные среды, содержащие лактозу (среда Кесслера) с последующим подтверждением принадлежности выросших микроорганизмов к группе кишечных палочек по морфологическим и культуральным признакам.

Исследование на наличие БГКП проводят в несколько этапов: I э т а п – приготовление разведений продукта. Если продукт плотный (колбаса, сыр, масло, творог и др.), то результат выражают в отсутствии БГКП в определенной его массе (г). Если продукт жидкий (молоко, кисломолочные напитки, сок и т.д.), то БГКП должны отсутствовать в определенном его объеме (см3 или дм3).

II э т а п – посев определенного количества продукта или его разведений в среду Кесслера. Среду Кесслера разливают в пробирки или колбы, в которые помещают поплавок (стеклянная трубочка

с одним запаянным концом). После стерилизации поплавок должен быть заполнен средой.

В пробирки со средой Кесслера вносят по 1 см3 соответствующего разведения продукта (10–1; 10–2; 10–3) и ставят в термостат при температуре (37±1) ºС. Через 24 ч инкубации посевы просматривают и отмечают образование газа в поплавке и изменение цвета среды из фиолетового в желто-зеленый. Записывают, в каких разведениях произошло газообразование.

III э т а п – подтверждение принадлежности микроорганизмов, выросших на среде Кесслера, к БГКП. Из забродивших пробирок со средой Кесслера делают пересев петлей на поверхность плотной среды Эндо таким образом, чтобы получить изолированные колонии. Для этого дно чашки Петри расчерчивают карандашом по стеклу на 4–8 секторов. Из каждой пробирки делают посев на отдельный сектор. Бактериологической петлей из пробирки берут минимальное количество исследуемого материала и высевают его в секторе зигзагообразным штрихом, не отрывая петлю от поверхности агара и не нарушая его целостности. Чашки Петри подписывают и помещают на 18–24 ч в термостат (крышками вверх) с температурой 37±1 ºС.

После инкубации чашки просматривают. Бактерии группы кишечной палочки образуют на среде Эндо красные или розовые блестящие колонии с металлическим блеском или без него. Такой характер роста на среде Эндо эти бактерии дают за счет сбраживания лактозы и образования кислоты, вызывающей восстановление индикатора фуксина, окрашивающего колонии в красный цвет.

Из типичных колоний на среде Эндо готовят препараты, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Если в препарате обнаруживаются мелкие грамотрицательные неспорообразующие палочки, то одновременно ставят оксидазный тест. Заключение о том, что обнаруженные в продукте микроорганизмы относятся к БГКП, делают на основании выявления в посевах грамотрицательных, не образующих спор палочек, сбраживающих лактозу с образованием кислоты и газа при температуре 37±1 ºС с отрицательным тестом на оксидазу. При этом указывают массу навески продукта (в г) или его объем (в см3). В случае отсутствия на среде Эндо типичных для БГКП колоний продукт считают не загрязненным кишечными палочками.

15.3. Определение количества дрожжей и плесеней

Для определения количества дрожжей и плесеней в пищевых продуктах делают посев соответствующих разведений в чашки Петри, которые заливают расплавленным и остуженным до температуры 45–50 ºС сусло-агаром (СА) или средой Сабуро. Содержимое чашек перемешивают вращательными движениями и оставляют для застывания на 10–15 мин, после чего ставят в термостат с температурой 30±2 ºС на 2–3 сут. После инкубации в чашках подсчитывают отдельно количество выросших колоний плесеней и дрожжей. Результат выражают числом КОЕ/ см3 (или г).

Контрольные вопросы 1. Что такое КМАФАнМ? 2. Для чего делают разведения пищевого продукта при определении количества микроорганизмов?

3. Какие питательные среды используют для определения КМАФАнМ, дрожжей и плесеней?

4. Из каких этапов состоит определение БГКП в пищевых продуктах?

5. Какие среды используют для определения БГКП в пищевых продуктах?

6. По каким признакам устанавливают рост БГКП в среде Кесслера?

7. Как выглядят колонии БГКП на среде Эндо? 8. В каком случае дают положительный ответ на присутствие в пищевом продукте БГКП?