Качество готовых пищевых продуктов, в том числе и их безопасность, зави-

сит прежде всего от качества сырья. Наблюдение за здоровьем животных (проду-

центов молока и мяса), поддержание высокого уровня санитарного режима получе-

ния скоропортящегося сырья, внедрение системы НАССР – обязательные условия

для повышения качества пищевых продуктов. Большую роль играет использование

более совершенного технологического оборудования и гигиенического режима при

обработке продуктов (закрытые линии на пищевых предприятиях, применение ав-

томатики при контроле режимов тепловой обработки, ультравысокая пастеризация

молока, резервуарный метод производства кисломолочных напитков, поточный

метод производства сливочного масла и т.д.). Решающую роль играет обеспечение

низкотемпературного режима при хранении сырья и готовых продуктов на произ-

водстве, в торговле и домашних условиях.

Большое значение в повышении качества продуктов имеет санитарный и са-

нитарно-бактериологический контроль за процессом производства, качеством го-

товых пищевых продуктов, выпускаемых предприятиями и в процессе хранения.

Санитарно-микробиологическое исследование является ценным объектив-

ным методом как при санитарном и техническом контроле пищевых предприятий,

так и при контроле качества продуктов.

Основные цели санитарно-микробиологического контроля:

• предупредить заражение и накопление нежелательной микрофлоры в про-

дукте;

• предупредить возникновение заболеваний через пищевые продукты.

Контроль процесса производства дает большие возможности для вскрытия и

устранения дефектов в ходе технологического процесса, чем контроль готовых

продуктов.

МЕТОДЫ САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Санитарно-микробиологические исследования пищевых продуктов могут

проводиться в плановом порядке или по эпидемическим показаниям. Плановые ис-

следования осуществляются обычно в общем комплексе обследования гигиениче-

ских условий работы и санитарного режима предприятий торговли, пищевой про-

мышленности и общественного питания. В этом случае пищевые продукты иссле-

дуются на общее микробное обсеменение, содержание санитарно-показательных

микроорганизмов (бактерии группы кишечных палочек и энтерококки), а в ряде

случаев и на патогенную микрофлору. Исследования по эпидемическим показани-

ям преследуют цель установления возможных возбудителей пищевых токсикоин-

фекций и факторов, способствующих их возникновению.

Порядок взятия проб и методы их исследования регламентируются ГОСТ,

ТУ и другой нормативной документацией.

САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБСЛЕДОВАНИЕ

ПРЕДПРИЯТИЙ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Санитарно-микробиологический контроль предприятий общественного пи-

тания и пищевой промышленности методом смывов входит в состав комплексных

исследований, проводимых на этих предприятиях:

a. при текущем санитарном надзоре;

b. при выявлении наиболее опасных в эпидемическом отношении участков

технологического процесса изготовления и реализации скоропортящихся

пищевых продуктов;

c. при предупредительном санитарном надзоре для разработки отдельных во-

просов технологического процесса, оценки нового оборудования и его влия-

ния на обсемененность пищевых продуктов;

d. по эпидемическим показаниям.

Объектами исследования являются оборудование, инвентарь, посуда, санитар-

ная одежда и руки персонала.

Из оборудования и аппаратуры особое внимание следует обратить на разделоч-

ные доски, производственные столы, особенно в цехах приготовления холодных

закусок, кондитерских изделий, пива, безалкогольных и фирменных напитков.

Смывы с рук, санитарной одежды, полотенец берут до работы или после пере-

рыва в ней. Особое внимание обращается на работников, имеющих дело с продук-

цией, не подвергающейся в дальнейшем тепловой обработке (персонал кухни, хо-

лодного и кондитерского цехов, отделочного отделения, раздатчицы, буфетчицы,

официанты, продавцы). У работников, занятых обработкой сырой продукции, про-

бы отбирают до начала работы. Не следует брать смывы с загрязненной санитарной

одежды и полотенец.

При проведении санитарно-микробиологического обследования предприя-

тий общественного питания целесообразно соблюдать очередность обследования

производственных цехов. Начинать его нужно с холодного цеха, а затем уже брать

смывы в других цехах.

Холодный цех подлежит наиболее тщательному обследованию. Смывы

необходимо брать с оборудования, инвентаря, посуды, санитарной одежды, рук.

В горячем цехе исследуется поверхность разделочных столов, площадки ве-

сов, внутренние части универсального привода, ножи, руки, санитарная одежда ра-

ботающих – до начала работы, в перерывах и после нее. На перечисленных объек-

тах определяется наличие бактерий группы кишечной палочки.

В моечных цехах столовой и кухонной посуды объектами исследования яв-

ляется чистая кухонная столовая посуда, мелкий кухонный инвентарь, чистые

внутренние стенки моечных ванн, полки, поверхности столов. Смывы исследуют

на выявление бактерий группы кишечной палочки. Поверхность чистой посуды ис-

следуют также на общую микробную обсемененность.

В мясном цехе отбирают смывы с оборудования, инвентаря, рук персонала,

мясных туш и тушек домашней птицы. Исследование проводят на бактерии рода

сальмонелл.

Смывы, отобранные в кондитерских и молочных цехах (молочные кухни),

исследуют на наличие бактерий рода кишечной палочки и на патогенные стафило-

кокки.

Необходимость в санитарно-микробиологическом исследовании яиц и яич-

ных продуктов может возникать при контроле состояния птицефабрик, пищевых

производств, оценке качества этих продуктов, правильности их хранения, а также

при наличии эпидемических показаний.

Методика взятия смывов

Смывы производят с помощью стерильных увлажненных тампонов или сал-

феток. Стерильные ватные тампоны на стеклянных или металлических палочках,

вмонтированные в пробирки с ватными пробками, заготавливают заранее в лабора-

тории. В день взятия смывов в каждую пробирку с тампоном наливают по 2 мл

стерильной воды так, чтобы ватный тампон не касался ее поверхности. При прове-

дении последующих микробиологических посевов на жидких средах вместо воды в

пробирки можно заливать соответствующую питательную среду.

Непосредственно перед взятием смыва тампон увлажняют наклоном пробир-

ки или опусканием его вниз. Смывы с крупного оборудования и инвентаря берут с

поверхности 100см2. Для ограничения поверхности используется шаблон (трафарет

из проволоки или металлической пластинки), стерилизуемый перед каждым новым

смывом путем обжига на пламени горелки. Трафарет имеет площадь 25 см2 и для

получения площади в 100 см2 его накладывают на 4 разных участка исследуемого

предмета. Ограниченные трафаретом поверхности тщательно протирают увлаж-

ненным тампоном во взаимно перекрещивающихся направлениях.

При взятии смывов с мелких предметов (ложки, тарелки) одним тампоном

протирают всю поверхность 2-3 одноименных предметов. У столовых приборов

протирают рабочую часть ручки (примерно наполовину), у стаканов исследуют

внутреннюю поверхность и 2 см наружного края по всей окружности.

При исследовании рук смывы делают с ладонных поверхностей (проводя по

каждой ладони не менее 5 раз), пальцев, ногтей, межпальцевых и подногтевых про-

странств.

Смывы с санитарной одежды производят с площади 100 см2, включая преж-

де всего нижние части каждого рукава и верхние части переда спецодежды. С ана-

логичной площади в разных частях предмета берут смывы с полотенец.

При обследовании качества обработки столовой посуды необходимо брать

смывы с тарелок (не менее 5) после последней ванны в моечной или после выхода

из моечной машины, а также на раздаче. В случае неоднократного получения пло-

хих результатов смывов необходимо проверить весь процесс мойки поэтапно, про-

вести контроль мытья ванн путем исследования стенок после спуска воды, смывов

щеток и мочалок, употребляющихся при мытье посуды. Из кухонной посуды ис-

следуются кастрюли, противни, предназначенные для полуфабрикатов и готовых

изделий.

При исследовании яиц производят смывы с их поверхности, затем обеззара-

живают скорлупу и вскрывают ее с соблюдением правил асептики, после чего засе-

вают содержимое на питательные среды.

При исследовании смывов используются те же методы и питательные среды,

что и при изучении пищевых продуктов.

ГИГИЕНИЧЕСКОЕ НОРМИРОВАНИЕ

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ

1. Гигиенические нормативы по микробиологическим показателям включают

контроль за 4 группами микроорганизмов:

a. санитарно-показательные, к которым относится количество мезо-

фильных аэробных, факультативно-анаэробных микроорганизмов –

КМАФАнМ и бактерий группы кишечной палочки – БГПК (коли-

формы);

b. условно-патогенные микроорганизмы, к которым относится Е. coli,

S.aureus, бактерии рода Proteus, B.сereus и сульфитредуцирующии

клостридии;

c. патогенные микроорганизмы, в т.ч. сальмонеллы;

d. микроорганизмы порчи – в основном это дрожжи и плесневые грибы.

2. Регламентирование по показателям микробиологического качества и без-

опасности пищи осуществляется для большинства групп микроорганизмов

по альтернативному принципу, т.е. нормируется масса продукта, в которой

не допускаются бактерии группы кишечных палочек, большинство условно-

патогенных микроорганизмов, а также патогенные микроорганизмы, в т.ч.

сальмонеллы. В других случаях норматив отражает количество колониеоб-

разующих единиц в 1 г (мг) продукта (КОЕ/г,мл).

3. В продуктах массового потребления, для которых в таблицах отсутствуют

микробиологические нормативы, патогенные микроорганизмы, в т.ч. саль-

монеллы, не допускаются в 25 г продукта.

4. Во всех видах доброкачественной рыбной продукции Vibrio parahaemolyticus

не допускается в количестве более 10 КОЕ/г; контроль производится при

эпидемическом неблагополучии в регионе.

5. В салатах и смесях из сырых овощей, готовых к употреблению, бактерии ро-

да Yersinia не допускаются в 25 г продукта; контроль проводится при эпид-

неблагополучии.

6. При получении неудовлетворительных результатов анализа хотя бы по од-

ному из микробиологических показателей по нему проводят повторный ана-

лиз удвоенного объема выборки, взятого из той же партии. Результаты по-

вторного анализа распространяются на всю партию.

Приложение 1

Гигиенические нормативы

качества продовольственного сырья и пищевых продуктов

по микробиологическим показателям (СанПиН 1163 РБ 98)

Числовая апертура А (от лат. aperture – отверстие) объектива характеризует его светособирательную способность и определяется по формуле

А = n sin ½ α, где n – показатель преломления светового луча, проходящего через предметное стекло в среду между фронтальной линзой объектива и предметным стеклом; α – угол, одна сторона которого совпадает с оптической осью, а другая образована линией, соединяющей точку выхода эффективных лучей из объектива с границей действующего отверстия объектива; ½ α – половинный угол входного отверстия объектива.

Важно, чтобы значение величины n было максимальным. Повысить его можно введением в пространство между фронтальной линзой объектива и предметным стеклом вещества с показателем преломления, близким к показателю преломления стекла, как это сказано выше. Не менее важно также, чтобы значение величины sin ½ α было максимальным. Предел повышения этого значения зависит от степени кривизны фронтальной линзы иммерсионного объектива и числовой апертуры конденсора. Следует помнить, что повысить ве-

личину sin ½ α при использовании иммерсионных объективов можно максимальным поднятием конденсора, что определяется его светособирательной функцией. Если конденсор опущен, то функция, по существу, нарушена.

Числовая апертура и увеличение объектива обозначены на его оправе: 8х0,2; 40х0,65; 90 х1,25.

Увеличительная способность микроскопа (D) определяется произведением увеличения окуляра (K) на увеличение объектива (V):

D = KV. Теоретически микроскоп может дать увеличение х2000 раз и более. Однако следует различать полезное и бесполезное увеличение микроскопа. Увеличение, которое дает возможность рассматривать объект под предельным углом зрения, и есть полезное увеличение. Пределы полезного увеличения в обычных световых микроскопах достигают 1400. При превышении границ полезного увеличения возникают дифракция и другие явления, обусловленные волновой природой света. В частности, у объектива с увеличением 40х и числовой апертурой 0,65 полезное увеличение составляет 325–650. Такое увеличение позволяет различить все структуры, разрешаемые данным объективом. Поэтому для получения разрешения в пределах полезного при работе с объективом 40х следует брать окуляр 15х. Применение более сильных окуляров не даст возможности выявить более тонкие детали.

Если объектив имеет увеличение 90х (числовая апертура А = 1,25), то полезное увеличение для него равно 1250. Следовательно, и в данном случае не следует брать окуляры с увеличением более 15х, чтобы не выходить за пределы полезного увеличения.

Разрешающая способность микроскопа. Если увеличительная способность микроскопа зависит от объектива и окуляра, то разрешающая способность определяется, в основном, объективом и конденсором. Разрешающую способность рассчитывают по формуле

d = λ / 2А, где λ – длина волны света, воспринимаемая человеческим глазом (0,4–0,7 мкм, средняя – 0,55 мкм); А – числовая апертура объектива.

Максимальная разрешающая способность светового микроскопа составляет 0,2 мкм. Разрешающая способность микроскопа тем лучше, чем меньше абсолютная величина d.

1.3. Правила работы с микроскопом 1. Микроскоп берут одной рукой за колонку штатива, а другой поддерживают за основание. Брать и поднимать микроскоп за другие детали категорически запрещается.

2. На рабочем столе микроскоп помещают колонкой к себе. Перед началом работы следует осторожно удалить пыль с оптических частей микроскопа мягкой сухой тканью, не касаясь пальцами линз.

3. С помощью револьверной насадки устанавливают нужный объектив. Характерный щелчок фиксатора внутри револьвера свидетельствует о центрированном положении объектива. Необходимо помнить, что, чем меньше увеличение объектива, тем больше фокусное расстояние. При работе с объективом 8х расстояние между препаратом и объективом около 9 мм, с объективом 40х оно составляет 0,6 мм, и с объективом 90х – около 0, 15 мм.

4. На предметный столик помещают предметное стекло и закрепляют его клеммами.

5. Тубус микроскопа опускают вниз с помощью макрометрического винта осторожно, наблюдая за объективом сбоку, и приближают к препарату (не касаясь его) на расстояние, меньшее рабочего. Затем, глядя в окуляр, медленным вращением макровинта поднимают тубус до тех пор, пока в поле зрения не появится изображение изучаемого предмета.

6. Вращением микрометрического винта объектив фокусируют таким образом, чтобы изображение предмета было четким.

7. При работе с иммерсионным объективом на предметное стекло наносят каплю кедрового масла и, глядя сбоку на объектив, макрометрическим винтом осторожно опускают тубус так, чтобы фронтальная линза объектива погрузилась в масло. Затем, глядя в окуляр, медленным движением макровинта поднимают тубус до тех пор, пока не появится изображение. Для точной фокусировки пользуются микрометрическим винтом, который вращают в пределах одного оборота.

В н и м а н и е ! Запрещается искать изображение препарата с помощью микрометрического винта.

8. Препарат рассматривают в нескольких полях зрения, передвигая предметный столик при помощи боковых винтов, или перемещают его рукой на предметном столике. Находят наиболее подхо-

дящее поле зрения на участке препарата, на котором микроорганизмы видны отчетливо, в достаточном для просмотра количестве, и зарисовывают микроскопическую картину.

9. При смене объективов следует регулировать интенсивность освещения рассматриваемого объекта. Желаемую степень освещения получают, опуская или поднимая конденсор.

10. По окончании работы поднимают тубус, снимают препарат с предметного столика, удаляют масло с фронтальной линзы иммерсионного объектива фильтровальной бумагой, смоченной бензином, устанавливают при помощи револьверной насадки объектив с увеличением 8х, кладут на предметный столик кусочек чистой марли и опускают тубус.

1.4. Микроскопия в темном поле Микроскопия в темном поле позволяет увеличить разрешающую способность объектива примерно в 10 раз и рассмотреть объекты, размеры которых находятся за пределами обычного микроскопа. Темнопольная микроскопия основана на освещении объекта косыми лучами света, которые не попадают в объектив и остаются невидимыми для глаза (явление Тиндаля). Поэтому поле зрения выглядит совершенно черным. Если препарат содержит какие-либо частицы, например микроорганизмы, то косые лучи, направленные под определенным углом, вследствие дифракции отражаются от их поверхности и настолько отклоняются от своего начального направления, что попадают в объектив. Поскольку лучи света идут именно от объекта, то наблюдатель видит на черном фоне характерное светящееся изображение контуров микробных клеток или других частиц. Темное поле зрения достигается применением специального конденсора, которым заменяют обычный конденсор светового микроскопа. Однако эффект темного поля может быть достигнут лишь в том случае, если апертура конденсора превышает апертуру объектива на 0,2–0,4 единицы.

Темнопольную микроскопию используют для изучения живых клеток микроорганизмов. Она применяется для наблюдения за подвижностью микробов, обнаружения возбудителей некоторых болезней (лептоспироза). Однако к темном поле зрения нельзя хорошо изучить форму и внутреннее строение микробной клетки.

При рассмотрении дрожжевых клеток цитоплазма опалесцирует слабо и равномерно, на ее фоне отчетливо выделяются черные вакуоли, сильно блестящие гранулы липосом. Протопласт отмирающих клеток имеет молочно-белую окраску.

1.5. Фазово-контрастная микроскопия Фазово-контрастная микроскопия дает возможность рассматривать живые объекты без окрашивания и фиксирования. Глаз человека реагирует на изменения длины световой волны (цвет) и ее амплитуды (интенсивность, контрастность), но не воспринимает различий по фазе. Метод фазово-контрастной микроскопии разработан для наблюдения за прозрачными объектами, которые пропускают лучи одинаковой длины и аплитуды, но смещают их фазу. Величина смещения зависит от толщины и показателя преломления структур. С помощью фазово-контрастного устройства фазовые изменения световых волн, проходящих через прозрачные объекты, превращаются в амплитудные, благодаря чему детали рассматриваемых объектов становятся хорошо видимыми глазом и контрастными.

Для проведения исследований в дополнение к световому микроскопу следует иметь фазово-контрастное устройство. Наиболее широко применяется модель КФ-4, состоящая из вспомогательного микроскопа, специальных фазовых объективов и конденсора с набором кольцевых диафрагм, каждая из которых соответствует фазовой пластинке определенного объектива.

Вспомогательный микроскоп устанавливают, заменяя окуляр обычного микроскопа. Для получения фазового контраста в объектив вводится сециальная фазовая пластинка, которая представляет собой тонкий диск с напылением из солей редких металлов на одну из внутренних линз объектива. Она изменяет фазу проходящей световой волны на ¼ λ, что приводит к превращению фазовых различий в амплитудные. На оправе фазовых объективов обозначены индексы: Ф10, Ф20, Ф40 и Ф90. Кольцевые диафрагмы установлены в револьверном диске под конденсором и поворотом диска могут быстро меняться. Кольцевая диафрагма пропускает через конденсор в плоскость препарата лишь кольцо света. Эффект фазового контраста получают путем точного совмещения кольца фазовой пластинки с проекцией кольцевой диафрагмы.

1.6. Люминесцентная микроскопия Применение люминесцентной микроскопии основано на свойстве некоторых биологических объектов светиться при их облучении невидимыми для человеческого глаза коротковолновыми лучами (сине-фиолетовыми с длиной волны около 460 нм или ультрафиолетовыми с длиной волны 300–400 нм). Такое явление объясняется тем, что часть энергии падающего света поглощается и освещаемый объект испускает лучи, имеющие большую длину волны, чем лучи возбуждающего света. При этом клетки светятся желто-зеленым или оранжевым светом (флуоресцируют). Это собственная или первичная люминесценция.

Первичным свечением обладают клетки растений и водорослей благодаря наличию хлорофилла, а также некоторые бактерии, вырабатывающие пигмент. Большинство клеток микроорганизмов обладает слабой первичной люминесценцией.

Вторичная (или наведенная) люминесценция объектов, не обладающих собственной люминесценцией, достигается их обработкой специальными красителями – флуорохромами. Наиболее широко используются флуорохромы акридиновой и тиазоловой групп (акридин оранжевый и желтый, аурамин, уранин, родамин, тиофлавин, примулин, флуоресцин и др.). В частности, акридин оранжевый окрашивает цитоплазму в зелено-желтый, метахроматин – в ярко-красный, вакуоли – в розовый, ядро – в светло-зеленый цвет.

Люминесцентная микроскопия осуществляется в затемненной комнате с помощью специального люминесцентного микроскопа, например, МЛ-2.

В качестве источника ультрафиолетового излучения в люминесцентных микроскопах используются специальные кварцевые лампы. Прежде чем попасть на объект, лучи лампы проходят через ряд светофильтров, пропускающих только определенную часть ультрафиолетового спектра с λ = 360–380 нм.

Более доступным способом возбудителя люминесценции является использование коротковолновой части видимого света – синефиолетовых лучей с λ = 460 нм. В этом случае наблюдения можно проводить не только в специальном люминесцентном микроскопе, но и с помощью обычного микроскопа, установив на пути лучей синий стеклянный или жидкий светофильтр. Излишние синие лучи убирают

желтым светофильтром, который помещают на окуляр микроскопа. В результате в препарате на черном фоне видны люминесцирующие объекты.

Люминесцентная микроскопия позволяет наблюдать морфологические особенности объектов, которые при обычной микроскопии лежат за пределами видимости. Кроме того, она дает возможность дифференциации вида микробов по характеру свечения, изучения изменения структур при различных физиологических состояниях клетки. Этот метод позволяет изучать антигенную структуру бактерий и обнаруживать возбудителей инфекционных заболеваний путем применения меченных люминесцентными красками иммунных сывороток.

1.7. Электронная микроскопия В электронном микроскопе вместо световых лучей используется поток движущихся электронов, что позволяет увеличить разрешающую способность прибора в 100 раз и более. Высокая разрешающая способность современных электронных микроскопов дает возможность наблюдать и изучать объекты, которые невидимы в световом микроскопе: вирусы, бактериофаги, микоплазмы, тонкое строение клеток прокариот и эукариот, их макро- и микроструктурные элементы.

Электронный микроскоп состоит из нескольких сложных узлов: 1. Колонна, в которой смонтированы электронная пушка, устройства, фокусирующие пучок электронов, конденсорная линза, камера объекта (предметный столик, объективная, промежуточная и проекционная линзы); флюоресцирующий экран, фотокамера.

2. Вакуумная установка, позволяющая создавать в колонне высокий вакуум.

3. Пульт управления. 4. Установка для электропитания, размещенная в металлическом шкафу за колонной.

5. Вспомогательные устройства. Осветительная система электронного микроскопа состоит из электронной пушки и конденсорной линзы. В качестве линз, фокусирующих пучок электронов, используется электромагнитное поле

(стеклянные линзы употреблять нельзя, так как стекло непроницаемо для электронов). Воздух препятствует движению электронов, поэтому внутри микроскопа необходимо поддерживать вакуум.

Техника подготовки препаратов для электронной микроскопии существенно отличается от той, которая используется для рассмотрения в световом микроскопе. Препараты для просматривания в электронном микроскопе готовят на очень тонкой, проницаемой для электронов подложке. В качестве подложки применяют пленки из коллодия, кварца или других материалов толщиной около 1 мкм. В связи с тем, что пленки очень тонкие и непрочные, их помещают на специальные металлические сетки с мелкими ячейками. Общая толщина препарата и подложки должна быть не более 0,25 мкм. С целью повышения контрастности изучаемых препаратов их подвергают дополнительной обработке в условиях глубокого вакуума путем напыления на них чрезвычайно тонкого слоя хрома, золота, платины или палладия или используют различные контрастирующие вещества (уранилацетат, уранилнитрат, фосфорновольфрамовую кислоту). Рассматриваемый объект помещают на предметный столик, находящийся между конденсором и объективной линзой. Проходя через исследуемый объект, пучок электронов рассеивается и фокусируется в электромагнитном преломляющем поле объективной линзы. Получается первое увеличенное действительное изображение объекта (в 40–50 тыс. раз), наблюдаемое через смотровое стекло. Затем поток электронов попадает в электромагнитное поле проекционной линзы, которая конденсирует пучок проходящих электронов и фокусирует их на флюоресцирующем экране, давая окончательное увеличенное изображение объекта в 200–300 тыс. раз.

Под флюоресцирующим экраном находится фотокамера. Приподнимая специальной рукояткой экран, пропускают пучок электронов на фотопластинку и фотографируют изображение объекта.

Контрольные вопросы 1. Каковы основные правила работы в микробиологической лаборатории?

2. Назовите основные элементы механической части микроскопа.

3. Назовите основные элементы оптической части микроскопа.

4. Что такое числовая апертура микроскопа? 5. Чем отличаются сухие объективы от иммерсионных? 6. Каково назначение макро- и микрометрического винтов? 7. Для чего нужна револьверная насадка? 8. Как определить увеличительную способность микроскопа? 9. Как регулировать степень освещенности препарата? 10. Назовите основные характеристики светового микросокпа. 11. В чем заключается сущность микроскопии в темном поле? 12. Поясните принцип работы фазово-контрастного микроскопа. 13. Объясните принцип работы люминесцентного микроскопа. 14. Каковы особенности работы с электронным микроскопом?

Общая и пищевая микробиология. Часть I

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

УНИВЕРСИТЕТ ИТМО

Л.В. Красникова, П.И. Гунькова

ОБЩАЯ И ПИЩЕВАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ

Часть I

Учебное пособие

Санкт-Петербург

2016

Красникова Л.В., Гунькова П.И. Общая и пищевая микробиология: Учеб. пособие. Часть I. – СПб.: Университет ИТМО, 2016.

134 с.

Рассматриваются вопросы общей микробиологии, дается понятие об организации микробиологической лаборатории, методах стерилизации микробиологических объектов, а также санитарно-гигиенического контроля воздуха производственных помещений, питьевой воды и пищевых продуктов.

Предназначено для студентов бакалавриата очной и заочной форм обучения направлений 19.04.01 Биотехнология, 19.04.02 Продукты питания из растительного сырья и 19.04.03 Продукты питания животного происхождения по дисциплинам «Общая и пищевая микробиология» и «Общая биология и микробиология».

Рецензенты: кафедра химии и биотехнологии ФПБОУ СанктПетербургского торгово-экономического университета (зав. кафедрой доктор техн. наук, доц. Ю.Г. Базарнова); кандидат техн. наук, М.М. Шамцян (кафедра технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета))

Рекомендовано к печати Советом факультета пищевых биотехнологий и инженерии, протокол № 2 от 28.10.2015 г.

Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики, 2016

Красникова Л.В., Гунькова П.И., 2016

ВВЕДЕНИЕ Учебное пособие содержит информацию, необходимую для подготовки студентов к практической работе в микробиологической лаборатории. Основной целью пособия является ознакомление студентов с наиболее важными приемами и методами микробиологических исследований, которые необходимы при изучении дисциплины «Общая и пищевая микробиология».

Каждый раздел пособия содержит основные теоретические пояснения по изучаемой теме, цель исследования, описание методики постановки опыта, перечень контрольных вопросов для самопроверки.

Пособие предусматривает приобретение студентами нижеперечисленных теоретических знаний и навыков:

изучение устройства биологического микроскопа и техники приготовления микроскопических препаратов;

ознакомление со специальными методами микроскопических исследований (темнопольная, фазово-контрастная и электронная микроскопия);

ознакомление с оборудованием микробиологической лаборатории и способами стерилизации питательных сред, посудой, инвентарем;

изучение морфологии важнейших групп микроорганизмов, влияющих на качество пищевых продуктов;

освоение методов количественного учета микроорганизмов в объектах внешней среды и продуктах питания. При проведении микробиологических работ очень важным является соблюдение условий стерильности, поэтому в первых разделах пособия дано описание физических и механических методов стерилизации и химических средств дезинфекции.

В учебном пособии большое внимание уделено морфологии бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов. Дана характеристика основных видов бактерий – возбудителей порчи пищевых продуктов. Детально рассмотрено строение основных видов дрожжей и плесневых грибов, развивающихся в продуктах питания. Материал нескольких тем лабораторного практикума посвящен микробиологическому исследованию воздуха помещений, питьевой воды и пищевых продуктов. Освещены также вопросы микрофлоры воды, санитарных

требований к качеству питьевой воды. Дано понятие о санитарнопоказательных микроорганизмах и методах их определения.

В приложении приведены рецептуры основных питательных сред, используемых в микробиологической практике.

Правила работы в микробиологической лаборатории

Специфика работы в микробиологической лаборатории требует строгого соблюдения порядка и чистоты. В связи с этим при работе в лаборатории студенты должны соблюдать следующие правила:

1) запрещается входить в лабораторию в верхней одежде, головном уборе, вносить посторонние вещи;

2) запрещается находиться в лаборатории в период обработки воздуха помещения ультрафиолетовыми лампами;

3) перед занятиями необходимо надеть хлопчатобумажный халат;

4) не разрешается выходить в халате за пределы лаборатории и надевать на халат верхнюю одежду;

5) нельзя класть на лабораторный стол личные вещи (сумки, папки и др.), их следует держать в специально отведенных местах;

6) в лаборатории запрещается принимать пищу, пить воду, не допускаются излишние разговоры и хождения;

7) на лабораторном столе не должно быть никаких лишних предметов, не имеющих отношения к работе;

8) соблюдать осторожность при работе с открытым огнем спиртовки или газовой горелки;

9) во избежание распыления спор микроорганизмов не допускается оставлять открытыми чашки Петри, пробирки, колбы с культурами плесневых грибов, часто являющихся аллергенами;

10) использованные пипетки, предметные и покровные стекла следует опускать в раствор с дезинфицирующей жидкостью;

11) в конце занятий следует привести в порядок рабочее место: поставить на место микроскоп, вымыть посуду, протереть рабочий стол и поставить под него табуретку;

12) дежурному по группе проверить рабочие места студентов.

1. МИКРОСКОПИЯ Изучение клеток микроорганизмов, не видимых невооруженным глазом, возможно только при помощи микроскопов (от греч. micros – малый, skopeo – смотрю). Эти приборы позволяют получать изображение исследуемых объектов, увеличенное в сотни раз (световые микроскопы) и в десятки – сотни тысяч раз (электронные микроскопы).

1.1. Устройство светового микроскопа Цель работы: ознакомить студентов с устройством светового микроскопа, его характеристиками и правилами работы с ним.

Микроскоп называется световым, так как он обеспечивает возможность изучать объект в проходящем свете. Основными элементами современных световых микроскопов являются механическая и оптическая части (рис. 1.1).

К механической части относятся штатив, тубус, револьверная насадка, коробка микромеханизма, предметный столик, макрометрический и микрометрический винты.

Штатив состоит из двух частей – основания и тубусодержателя (колонки). Основание микроскопа прямоугольной формы, имеет снизу четыре опорные площадки, что обеспечивает устойчивое положение микроскопа на поверхности рабочего стола.

Тубусодержатель соединяется с основанием и может перемещаться в вертикальной плоскости при помощи макро- и микрометрического винтов. При вращении винтов по часовой стрелке тубусодержатель опускается, при вращении против часовой стрелки – поднимается от препарата. В верхней части тубусодержателя укреплена головка с гнездом для монокулярной (или бинокулярной) насадки и направляющей для револьверной насадки. Головка крепится винтом.

Тубус – это труба микроскопа, позволяющая поддерживать определенное расстояние между основными оптическими деталями – окуляром и объективом. Вверху в тубус вставляется окуляр. Современные модели микроскопов имеют наклонный тубус.

8 – клеммы, прижимающие препарат; 9 – конденсор; 10 – кронштейн конденсора; 11 – рукоятка перемещения конденсора;

12 – откидная линза; 13 – зеркало; 14 – макровинт; 15 – микровинт;

16 – коробка с механизмом микрометрической фокусировки;

17 – головка для крепления тубуса и револьверной насадки;

18 – винт для крепления головки Револьверная насадка представляет собой вогнутый диск с несколькими гнездами, в которые ввинчиваются 3–4 объектива. Вращая револьверную насадку, можно под отверстие тубуса быстро установить любой объектив в рабочее положение.

Коробка микромеханизма несет с одной стороны направляющую для кронштейна конденсора, а с другой – направляющую для тубусодержателя. Внутри коробки находится механизм фокусировки микроскопа, представляющий собой систему зубчатых колес.

Предметный столик служит для размещения на нем препарата или другого объекта исследования. Столик может быть квадратным или круглым, подвижным или неподвижным. Подвижный столик перемещается в горизонтальной плоскости при помощи двух боковых винтов, что позволяет рассматривать препарат в разных полях зрения. На неподвижном столике для обследования объекта в разных полях зрения препарат перемещают рукой. Снизу в центре предмет-

ного столика имеется отверстие для освещения лучами света, направляемыми от осветителя. На столике имеются две пружинные клеммы, предназначенные для закрепления препарата. Некоторые системы микроскопов снабжены препаратоводителем, необходимым при исследовании поверхности препарата или при подсчете клеток. Препаратоводитель позволяет производить передвижение препарата в двух взаимноперпендикулярных направлениях. На препаратоводителе имеется система линеек – нониусов, с помощью которых можно сообщить координаты любой точке исследуемого объекта.

Макрометрический винт (макровинт) служит для предварительной ориентировочной установки изображения рассматриваемого объекта. При вращении макровинта по часовой стрелке тубус микроскопа опускается, при вращении против часовой стрелки – поднимается.

Микрометрический винт (микровинт) используют для точной установки изображения объекта. Микрометрический винт является одной из наиболее легко повреждаемых частей микроскопа, поэтому с ним надо обращаться осторожно: во избежание самопроизвольного опускания тубуса не вращать винт с целью грубой установки изображения. При полном повороте микровинта тубус передвигается на 0,1 мм.

Оптическая часть микроскопа состоит из основных оптических деталей (объектива и окуляра) и вспомогательной осветительной системы (зеркала и конденсора).

Объективы (от лат. objektum – предмет) – наиболее важная, ценная и хрупкая часть микроскопа. Они представляют собой систему линз, заключенных в металлическую оправу, на которой указаны степень увеличения и числовая апертура. Наружная линза, обращенная плоской стороной к препарату, называется фронтальной. Именно она обеспечивает увеличение. Остальные линзы называются коррекционными и служат для устранения недостатков оптического изображения, возникающих при рассмотрении исследуемого объекта.

Объективы бывают сухие и иммерсионные, или погружные. Сухим называется объектив, у которого между фронтальной линзой и рассматриваемым объектом находится воздух. Сухие объективы обычно имеют большое фокусное расстояние и увеличение 8х или 40х. Иммерсионным (погружным) называют объектив, у которого между фронтальной линзой и препаратом находится специальная жидкая среда. Вследствие разницы между показателями преломления стекла (1,52) и воздуха (1,0) часть световых лучей преломляется и не

попадает в глаз наблюдателя. В результате этого изображение получается нечетким, более мелкие структуры остаются невидимыми. Избежать рассеивания светового потока можно путем заполнения пространства между препаратом и фронтальной линзой объектива веществом, показатель преломления которого близок к коэффициенту преломления стекла. К таким веществам относятся глицерин (1,47), кедровое масло (1,51), касторовое (1,49), льняное (1,49), гвоздичное (1,53), анисовое (1,55) и др. Иммерсионные объективы имеют на оправе обозначения: I – immersion (иммерсия), НI – Homogen immersion (однородная иммерсия), OI – oil immersion и МИ – масляная иммерсия. В настоящее время в качестве иммерсионной жидкости чаще используют синтетические продукты, соответствующие по оптическим свойствам кедровому маслу.

Объективы различают по их увеличению. Величина увеличения объективов обозначена на их оправе (8х, 40х, 60х, 90х). Кроме того, каждый объектив характеризуется определенной величиной рабочего расстояния. Для иммерсионного объектива это расстояние соответственно составляет 0,12 мм, для сухих объективов с увеличением 8х и 40х – 13,8 и 0,6 мм.

Окуляр (от лат. okularis – глазной) состоит из двух линз – глазной (верхней) и полевой (нижней), заключенных в металлическую оправу. Окуляр служит для увеличения изображения, которое дает объектив. Увеличение окуляра обозначено на его оправе. Существуют окуляры с рабочим увеличением от 4х до 15х.

При длительной работе с микроскопом следует пользоваться бинокулярной насадкой. Корпуса насадки могут раздвигаться в пределах 55–75 мм в зависимости от расстояния между глазами наблюдателя. Бинокулярные насадки часто имеют собственное увеличение (около 1,5х) и коррекционные линзы.

Конденсор (от лат. condenso – уплотняю, сгущаю) состоит из 2–3 короткофокусных линз. Он собирает лучи, идущие от зеркала, и направляет их на объект. При помощи рукоятки, расположенной под предметным столиком, конденсор может перемещаться в вертикальной плоскости, что приводит к увеличению освещенности поля зрения при поднятом конденсоре и уменьшению его при опущенном конденсоре. Для регулировки интенсивности освещения в конденсоре имеется ирисовая (лепестковая) диафрагма, состоящая из стальных серповидных пластинок. При полностью открытой диафрагме реко-

мендуется рассматривать окрашенные препараты, при уменьшенном отверстии диафрагмы – неокрашенные. Под конденсором расположена откидная линза в оправе, используемая при работе с объективами малого увеличения, например, 8х или 9х.

Зеркало имеет две отражающие поверхности – плоскую и вогнутую. Оно закреплено на шарнирах в основании штатива, и его можно легко поворачивать. При искусственном освещении рекомендуется пользоваться вогнутой стороной зеркала, при естественном – плоской.

Осветитель выполняет функцию искусственного источника света. Он состоит из низковольтной лампы накаливания, закрепляющейся на штативе, и понижающего трансформатора. На корпусе трансформатора имеется рукоятка реостата, регулирующего накал лампы, и тумблер для включения осветителя.

Во многих современных микроскопах осветитель вмонтирован в основание.

Микробиологическая лаборатория должна включать следующие помещения:

лабораторные комнаты для проведения исследований;

застекленный бокс для выполнения работ, требующих соблюдения повышенной стерильности;

моечную, оборудованную для мытья посуды;

препараторскую, приспособленную для приготовления питательных сред, подготовки посуды для стерилизации, приготовления реактивов;

отделение для стерилизации, в котором установлены автоклавы.

Все помещения лаборатории должны иметь хорошее естественное и искусственное освещение. Поверхность столов и полы покрывают легко моющимся материалом (пластик, линолеум); в боксе, автоклавной и моечной стены и полы покрывают плиткой. Для стерилизации воздуха в помещениях лаборатории устанавливают бактерицидные лампы (БУВ-15, БУВ-30 и др.).

Оборудование: автоклавы, термостаты, шкафы сухожаровые, микроскопы, холодильники, весы технические, аппарат для микробиологического анализа воздуха помещений, прибор для подсчета колоний микроорганизмов, анаэростат для культивирования анэробных бактерий, рН-метр.

Посуда и инвентарь: петли и иглы бактериологические, шпатели Дригальского, ножницы, пинцеты, штативы, посуда лабораторная (чашки Петри, пробирки, пипетки – чаще всего на 1,0 и 0,1 см3, предметные и покровные стекла, флаконы для красок и растворов), вата, марля, фильтровальная бумага.

2.1. Методы и средства стерилизации, применяемые в микробиологической практике Стерилизация (от лат. sterilis – бесплодный) в микробиологической практике и пищевой промышленности означает уничтожение

в материалах всех вегетативных клеток микроорганизмов и их спор. Стерилизация является одним из важнейших и необходимых приемов в микробиологической практике.

Существуют следующие способы стерилизации: Термическая стерилизация

прокаливание в пламени (фламбирование);

кипячение;

сухой жар;

насыщенный пар под давлением; Холодная стерилизация

фильтрование;

облучение; Дезинфекция.

Термическая стерилизация Фламбирование – стерилизация путем прокаливания мелких предметов в пламени спиртовки или горелки (предметные стекла, бактериологические петли, иглы, пинцеты, ланцеты и т.п.). В пламени обжигают также горлышки колб, пробирок при пересевах культур и розливе питательных сред.

Кипячение применяют для стерилизации металлических инструментов, игл, резиновых трубок. Инструменты кипятят в специальных металлических стерилизаторах с крышками в течение 30–40 мин. Однако даже весьма продолжительное кипячение не обеспечивает полной стерильности объекта, так как споры ряда анаэробных клостридий могут выдерживать кипячение в течение 3 ч.

Стерилизация сухим жаром. Стеклянную посуду (пипетки, пробирки, колбы, чашки Петри и др.) выдерживают в сухожаровом шкафу при температуре от 160 до 180 ºС в течение 1,0–1,5 ч. При такой обработке погибают вегетативные клетки и споры микроорганизмов.

Перед стерилизацией посуду моют и высушивают. Пробирки и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Пробирки заворачивают в бумагу по 10–20 штук. На колбы надевают бумажные колпачки, предохраняющие горлышко от пыли. В концы пипеток, которые берут в рот, вставляют ватные тампоны. Пипетки помещают в специальные стеклянные или металлические пеналы или заворачивают в бумагу. При работе пипетки вынимают из пенала только за верхний конец, в который вставлен тампон. Чашки Петри заворачивают в бу-

магу (каждую отдельно или по 2–3 шт.). Посуду, подготовленную для стерилизации, загружают в сушильный шкаф не слишком плотно, чтобы обеспечить равномерный ее нагрев. По окончании стерилизации шкаф отключают, но не открывают до тех пор, пока температура в нем не снизится до 100–70 ºС, чтобы предохранить посуду от растрескивания. Для сохранения стерильности посуду разворачивают непосредственно перед работой.

Стерилизация насыщенным паром под давлением – один из наиболее распространенных и эффективных методов, основанный на том, что пар, образующийся при кипячении воды, скапливается в замкнутом пространстве и повышает давление. При увеличении давления повышается температура пара (табл. 2.1).

Таблица 2.1 Соотношение показаний манометра и температуры насыщенного пара

В автоклавах стерилизуют питательные среды, физиологические растворы, резиновые предметы, стеклянную посуду с резиновыми пробками. Режим стерилизации (температура и продолжительность обработки) определяется составом питательной среды, значе-

нием рН. Среды, содержащие сахара, молоко, витамины, стерилизуют при давлении 0,05 МПа в течение 15–20 мин, мясопептонные среды – при давлении 0,10 МПа в течение 20–30 мин. Время стерилизации отсчитывают от момента установления необходимого давления.

При низком значении рН некоторые вещества, входящие в состав питательной среды, в процессе стерилизации подвергаются гидролизу. Во избежание этого растворы некоторых компонентов (аминокислоты, витамины) стерилизуют отдельно и добавляют в среду после стерилизации.

Стерилизация текучим паром (дробная стерилизация) – метод, применяемый для обеспложивания питательных сред, изменяющих свой состав при воздействии температур выше 100 ºС. Сущность дробной стерилизации состоит в том, что нагревание среды проводят по 15–30 мин при температуре 100 ºС в течение трех дней подряд. После первого прогревания погибают вегетативные клетки, некоторые споры при этом сохраняются и затем прорастают. Образовавшиеся из термоустойчивых спор вегетативные формы погибают при повторном нагревании. Дробную стерилизацию проводят в аппарате Коха или в автоклаве при открытом спускном кране.

Тиндализация – дробная стерилизация материалов, легко разрушающихся при высокой температуре (сыворотки, витамины, некоторые антибиотики). Стерилизацию проводят прогреванием объекта при температуре от 60 до 65 ºС в течение 60 мин 5–6 дней подряд или при температуре 70–80 ºС в течение 3 дней.

Холодная стерилизация Фильтрование через бактериальные фильтры. Фильтрование через мелкопористые фильтры применяют в тех случаях, когда повышенная температура может резко изменить качество стерилизуемых материалов. Кроме того, стерилизация фильтрованием используется для очистки бактериальных токсинов и других продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.

Существуют два основных типа фильтров – глубинные и мембранные.

Глубинные фильтры состоят из волокнистых материалов. Частицы задерживаются в них в результате адсорбции и механического захвата в материале фильтра. Бактериальные фильтры изготавливаются из разного материала и с разным диаметром пор, что указывает-

ся на упаковке. Для стерилизации фильтрованием используют пластинчатые асбестовые фильтры Зейтца, свечи Шамберлана, изготовленные из каолина с примесью кварцевого песка, свечи Беркефельда из инфузорной земли и асбеста.

Мембранные фильтры имеют непрерывную структуру, они состоят из нитроклетчатки, и захват ими частиц определяется размером пор. Мембранные фильтры обозначают номерами от 1 до 5 в зависимости от диаметра пор (350–1200 нм).

Стерилизацию фильтрованием осуществляют под вакуумом с использованием вакуумного или водоструйного насоса. Перед началом работы фильтры закрепляют в специальном держателе, который соединяют с колбой Бунзена. Установку для фильтрования стерилизуют в автоклаве в течение 30–40 мин при 0,15 МПа. Мембранные и асбестовые фильтры используют однократно. Свечи Шамберлана и Беркефельда после окончания фильтрования промывают дистиллированной водой, просасывая ее в обратном направлении, и обрабатывают для повторного использования.

Стерилизация облучением. Стерилизация ультрафиолетовыми лучами применяется для уничтожения микроорганизмов в воздухе помещений, на поверхности пищевых продуктов перед их упаковкой. Ее проводят с помощью бактерицидных ламп различной мощности (длина волны 253–265 нм). Ионизирующее излучение применяют для стерилизации некоторых упаковочных материалов, используемых в пищевой промышленности.

Дезинфекция Уничтожение микроорганизмов при помощи химических веществ называется дезинфекцией (от лат. infektia – инфекция и французской отрицательной приставки des). Химические вещества применяются для уничтожения патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды – на рабочем месте, в помещениях, на рабочей одежде, руках, технологическом оборудовании и инвентаре.

К веществам, используемым с целью дезинфекции, предъявляется целый ряд требований:

они должны хорошо растворяться в воде;

в короткие сроки проявлять бактерицидное действие;

не оказывать токсического действия на человека и животных;

не вызывать порчу обеззараживаемых предметов.

Дезинфицирующие вещества подразделяют на несколько групп:

1) хлорсодержащие соединения (хлорная известь, натрия гипохлорит, хлорамин, пантоцид, хлордезинсульфохлорантин и др.);

2) соединения на основе йода и брома (йодопирин, дибромантин); 3) окислители (пероксид водорода, перманганат калия и др.); 4) фенолы и их производные (фенол, лизол, креолин, гексахлорофен);

5) соли тяжелых металлов (мертиолят натрия, сулема). Антимикробным действием обладают также кислоты и их соли (борная, салициловая), щелочи, спирты (70 %-й раствор этанола), альдегиды (формальдегид).

Выпускаются также бактерицидные мыла: феноловое, дегтярное, «Гигиена», содержащие 3–5 % гексахлорофена.

Контрольные вопросы 1. Какие методы стерилизации Вы знаете? 2. Какие методы стерилизации относятся к термическим? 3. Как подготовить лабораторную посуду для стерилизации? 4. Какие факторы определяют режим стерилизации? 5. В каких случаях используют «холодные» методы стерилизации?

6. Какие требования предъявляют к дезинфицирующим веществам?

7. Какие вещества используют для дезинфекции?

3. МЕТОДЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ Цель работы: получить представление о работе с чистыми культурами микроорганизмов; научиться готовить фиксированные окрашенные и прижизненные препараты микроорганизмов и препараты-отпечатки.

В практике микробиологии морфологию, биохимию и физиологию микроорганизмов изучают, используя чистые культуры микроорганизмов. Чистой культурой называют популяцию микроорганизмов, являющихся потомством одной клетки.

При работе с чистыми культурами следует соблюдать определенные условия, которые позволили бы предохранить их от загрязнения другими микроорганизмами. Все операции проводят в зоне горящей спиртовки. Мелкие предметы (предметные стекла, пинцеты, ножницы, бактериологические петли и иглы) стерилизуют – фламбируют (от нем. flamme – пламя) в пламени спиртовки. Микроорганизмы, выращенные на плотной среде, извлекают из пробирки с помощью бактериологической петли или иглы. Для взятия бульонной культуры используют стерильную пипетку или петлю.

3.1. Приготовление фиксированных окрашенных препаратов микроорганизмов Цель фиксации: убить клетки микроорганизмов и зафиксировать их на поверхности предметного стекла, чтобы они не были смыты при окрашивании и промывке водой; улучшить окраску клеток, поскольку мертвые клетки становятся более проницаемыми для красителей.

Порядок приготовления фиксированного окрашенного препарата при взятии культуры микроорганизмов, выращенных в пробирке на скошенном питательном агаре, следующий:

1. Зажечь спиртовку. 2. Взять чистое предметное стекло и профламбировать его, пронеся несколько раз сквозь пламя спиртовки.

3. Охладить стекло на столе и нанести на него каплю воды из флакона.

4. Взять пробирку с культурой в левую руку между большим и указательным пальцами и держать в наклонном положении так, чтобы было видно содержимое пробирки.

5. Взять в правую руку бактериологическую петлю, накалить докрасна проволоку в пламени спиртовки и обжечь примыкающую к проволоке часть держателя.

6. Мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижать к ладони ватную пробку, вынуть ее из пробирки и держать в таком положении, не касаясь окружающих предметов.

В н и м а н и е ! Класть пробку на стол или другие поверхности нельзя во избежание ее контаминации микроорганизмами (от лат. contaminatio – приведение в соприкосновение).

7. Края открытой пробирки обжечь в пламени спиртовки. 8. Ввести петлю в пробирку и, охладив ее о стенки пробирки, взять небольшое количество культуры с поверхности питательной среды.

В н и м а н и е ! Питательный агар нельзя нарушать петлей. 9. Снова обжечь края пробирки в пламени горелки и закрыть ее, пронося пробирку сквозь пламя и надевая ее на пробку. Пробирку с культурой поставить в штатив.

10. Извлеченный из пробирки петлей материал внести в каплю воды на предметном стекле и после аккуратного перемешивания тонким слоем равномерно распределить по поверхности стекла.

11. Оставшиеся на петле клетки микроорганизмов тщательно сжечь в пламени горелки, после чего петлю поставить на место.

12. Суспензию микроорганизмов высушить в потоке горячего воздуха над пламенем спиртовки и зафиксировать, пронося 3–4 раза над пламенем (нельзя фиксировать невысушенные мазки).

13. После охлаждения стекло положить на мостик и окрасить метиленовым синим в течение 2 мин, следя по песочным часам.

14. Краску смыть водой, препарат осушить фильтровальной бумагой, осторожно прикладывая ее к предметному стеклу.

15. На окрашенный препарат нанести каплю кедрового масла. Предметное стекло положить на предметный столик, при помощи макровинта погрузить иммерсионный объектив (90х) в масло и найти микроскопическую картину, используя для установления четкости изображения микровинт.

В н и м а н и е! Нельзя использовать микровинт для поиска изображения микробов в препарате.

3.2. Приготовление прижизненных препаратов микроорганизмов Прижизненные препараты используют для исследования микробов в живом виде с целью наблюдения их подвижности, прорастания спор, способа деления и т.д. Существуют два основных способа приготовления прижизненных препаратов микроорганизмов – «раздавленная капля» и «висячая капля».

Препарат «раздавленная капля». На чистое предметное стекло наносят из флакона каплю воды. В нее из пробирки вносят петлей небольшое количество исследуемой культуры и осторожно перемешивают, не размазывая по стеклу. Культуру, выращенную в жидкой среде (суспензию микроорганизмов), наносят на предметное стекло пипеткой.

Суспензию микроорганизмов накрывают сверху покровным стеклом так, чтобы под ним не было пузырьков воздуха, мешающих исследованию. Избыток выступившей жидкости удаляют фильтровальной бумагой, прикладывая ее к краям покровного стекла.

На покровное стекло наносят каплю кедрового масла и рассматривают препарат с иммерсионным объективом при опущенном конденсоре. Активно движущиеся бактерии проплывают через все поле зрения, меняют направления, совершают вращательные и круговые движения.

Препарат «висячая капля». Для приготовления такого препарата требуются специальное предметное стекло с лункой посередине и обычное покровное стекло. Края лунки предметного стекла смазывают вазелином. Небольшую каплю бульонной культуры микроорганизмов (суспензию) наносят на середину покровного стекла. Предметное стекло переворачивают лункой вниз и опускают ее на покровное стекло таким образом, чтобы находящаяся на нем капля суспензии приходилась на центр лунки.

Предметное стекло слегка прижимают к покровному, и стекла склеиваются. Препарат приподнимают и быстро переворачивают покровным стеклом кверху. Получается герметическая камера, в которой капля долго не высыхает. В правильно подготовленном препарате капля должна свободно свисать с покровного стекла и не соприкасаться с дном или краями лунки. На покровное стекло наносят каплю иммерсионного масла и рассматривают с объективом 90х в затемненном поле зрения (при суженной диафрагме и опущенном конденсоре).

3.3. Приготовление препарата-отпечатка Препарат-отпечаток используют для изучения естественного расположения клеток микроорганизмов на поверхности субстрата или пищевого продукта. Чистое предметное стекло фламбируют и прикладывают к поверхности исследуемого продукта (мяса, рыбы, сыра и т. п.). Препарат-отпечаток фиксируют над пламенем спиртовки и окрашивают метиленовым синим или по Граму. На препарат наносят каплю кедрового масла и микроскопируют с иммерсионным объективом.

3.4. Красители и индикаторы рН, используемые в микробиологической практике Без окрашивания микроорганизмы (кроме грибов) не видны в световой микроскоп из-за их малой контрастности. В микробиологической практике окрашивание широко используют для определения формы, размеров, структуры, взаимного расположения микробов. Способы окрашивания фиксированных препаратов разделяются на простые и сложные. Для простых способов окрашивания микроорганизмов применяют основные и кислые анилиновые красители. У основных красителей хромофором (ионом, придающим окраску) является катион, у кислых – анион. Основные красители более интенсивно связываются с ядерными компонентами клетки. Кислые красители хорошо окрашивают цитоплазматические компоненты клеток.

К основным красителям относятся:

красные – нейтральный красный, фуксин основной, сафранин, тионин, пиронин, гематоксилин;

синие – метиловый синий, «Виктория»;

фиолетовые – кристаллический фиолетовый, генциан фиолетовый;

зеленые – янус зеленый, малахитовый зеленый, метиловый зеленый;

черные – индулин. К кислым красителям относятся:

красные и розовые – фуксин кислый, эозин, эритрозин;

желтые – конго, пикриновая кислота, флуоресцин;

черные – нигрозин.

При простых способах окрашивания нельзя установить структуру микробов, а также зачастую их дифференцированное отношение к красителям. Для достижения этих целей применяют сложные способы окрашивания. К сложным способам относятся метод Грама (см. раздел 7.2), выявление кислотоустойчивости по Цилю–Нельсену, определение зерен полифосфатов по Леффлеру (см. раздел 6.3), выявление спор бактерий по Цилю–Нельсену или по Пешкову (см. раздел 7.4), выявление капсул по Гинсу–Бурри (см. раздел 7.5) и др.

Индикаторы рН – органические вещества, которые реагируют на изменение активной кислотности среды изменением ее цвета. В процессе жизнедеятельности микроорганизмы изменяют кислотнощелочное соотношение среды, в которой они развиваются, поэтому индикаторы используют для регистрации этих изменений. Индикаторы, окрашенные в одной среде и бесцветные в другой, называют одноцветными, а индикаторы, имеющие разную окраску по ту и другую стороны интервала, называют двуцветными.

В микробиологии наиболее часто употребляются двуцветные индикаторы, приведенные в табл. 3.1.

Таблица 3.1 Двуцветные индикаторы

синим. Засеянные пробирки со средой Гисса инкубируют при оптимальной температуре в течение 24 ч. Микроорганизмы расщепляют углеводы с образованием кислоты, за счет чего изменяется цвет среды: розово-красной становится среда с индикатором Андреде, желтой – среда с бромтимоловым синим.

Контрольные вопросы 1. Какие условия необходимо соблюдать при взятии чистой культуры микроорганизмов для приготовления препарата?

2. Каковы цели фиксации препарата? 3. Каковы способы приготовления прижизненных препаратов микроорганизмов?

4. Какие простые и сложные способы окрашивания препаратов микроорганизмов Вы знаете?

5. Какие красители используют для окрашивания микроорганизмов?

6. Какие индикаторы рН используют в микробиологической практике?