Общая характеристика

Все разнообразные и многочисленные биохимические реакции, протекающие в живом организме в связи с обменом веществ, совершаются при участии ферментов – биологических катализаторов, вырабатываемых клетками организма.

Ферменты «есть в полном смысле возбудители жизни», – писал русский физиолог академик И.П. Павлов (1849-1936 гг.).

Структура и свойства ферментов. Ферменты представляют собой простые белки (протеины) или сложные (протеиды), состоящие из белка и небелкового компонента – активной группы. Таким образом, существуют ферменты однокомпонентные и двухкомпонентные.

В состав активной группы двухкомпонентных ферментов входят витамины или их производные, различные металлы (Fe, Co, Сu), азотистые основания и др.

Активная группа ферментов обусловливает их каталитическую способность, а белковая часть – специфические свойства, избирательную способность действовать на определенный субстрат.

Прочность связи активной группы с белком у разных ферментов неодинакова. У некоторых она легко может отделяться от белковой части фермента и вступать во временную связь с другими белками. Такие активные группы называют коферментами.

Активные группы, прочно связанные с белковой частью фермента, называются простетическими группами этих ферментов.

В однокомпонентных ферментах роль активной группы выполняют определенные химические группировки в молекуле белка, составляя активный (каталитический) центр фермента.

Ферменты обладают очень высокой активностью. Ничтожно малого количества фермента достаточно, чтобы вовлечь в реакцию значительную массу реагирующего вещества (субстрата). Например, 1 г амилазы при благоприятных условиях может превратить в сахар 1 т крахмала.

Ферменты действуют чрезвычайно быстро, резко ускоряя реакцию. Молекула фермента за 1 мин может вызвать превращение десятков и сотен тысяч молекул соответствующего субстрата.

Особенностями ферментов являются их субстратная специфичность и специфичность действия – каждый фермент взаимодействует лишь с одним определенным веществом и катализирует лишь одно из тех превращений, которым может подвергаться данное вещество.

Специфичность ферментов обусловлена структурными особенностями их молекул и субстрата. Субстрат и фермент подходят друг к другу, как ключ к замку.

Реакция, катализируемая однокомпонентным ферментом, начинается со связывания субстрата с ферментом в определенном участке его – активном центре. Образуется комплекс фермент – субстрат. По окончании реакции образовавшийся комплекс фермента с продуктами реакции распадается, и при этом освобождаются исходный фермент и конечные продукты ферментативного процесса (рис. 26).

Рис. 26. Схема взаимодействия фермента с субстратом

У двухкомпонентных ферментов в связывании и переносе отдельных фрагментов субстрата участвуют коферменты и простетические группы.

Ферменты отличаются неустойчивостью (лабильностью) к воздействию ряда факторов внешней среды. Эта неустойчивость во многом объясняется белковой природой ферментов и выражается в том, что они теряют свою активность (инактивируются).

Условия действия ферментов. Важнейшим фактором, определяющим активность ферментов, является температура. По мере повышения температуры возрастает начальная скорость ферментативной реакции. Однако по достижении известного предела дальнейшее повышение температуры вызывает денатурацию ферментного белка.

Уровень температуры, вызывающий денатурацию различных ферментов, неодинаков. Для одних ферментов это 40-50 °С, для других (термоустойчивых) – только 70 °С, но при температуре около 100 °С почти все ферменты инактивируются.

Некоторые ферменты после тепловой инактивации способны восстанавливать каталитическую активность – в случае обратимого процесса денатурации белка.

Оптимальная температура, при которой данный фермент наиболее активен, для разных ферментов различна и в известной мере характеризует каждый фермент. У холодолюбивых микроорганизмов температурный оптимум ферментов значительно ниже, чем у теплолюбивых.

При температуре ниже оптимальных пределов скорость ферментативных процессов уменьшается. В условиях температур, близких к нулю и особенно ниже нуля, эти реакции значительно замедляются, а некоторые приостанавливаются, хотя при таких температурах сами ферменты заметно не разрушаются.

Большое влияние на ход ферментативных процессов оказывает рН среды. Для действия каждого фермента имеется свое оптимальное значение рН среды. При значении рН выше или ниже оптимальной величины активность ферментов снижается.

На активность ферментов влияет и присутствие в среде некоторых химических веществ. Одни из них ускоряют ферментативную реакцию (активаторы), другие – снижают ее или полностью приостанавливают (ингибиторы). Действие многих активаторов и ингибиторов специфично.

Активаторами ферментов являются, например, металлы (Сu, Mn, Mg, Co), витамины.

Ингибиторами ферментов служат соли тяжелых металлов, антибиотики, сероводород и др. Они соединяются с активными группами или активными центрами ферментов, парализуя тем самым связывание с ними субстрата.

Лучистая энергия (ультрафиолетовые лучи, радиоактивные излучения) инактивирует ферменты.

Концентрация субстрата, т.е. вещества, на которое действует фермент, и концентрация фермента также влияют в известной мере на скорость процессов.

Биохимические процессы, протекающие в микробных клетках, регулируются ферментами, поэтому любой фактор, действующий на активность фермента, действует и на микроорганизм.

Каждый микроорганизм обладает комплексом разнообразных ферментов, своеобразием и активностью которых определяются их биохимическая деятельность, избирательность в отношении питательных веществ, роль микроорганизмов в круговороте веществ в природе, в процессах порчи пищевых продуктов.

Ферменты, присущие данному микроорганизму, входящие в число компонентов его клетки, называют конститутивными. Существуют ферменты индуцируемые (адаптивные), которые вырабатываются клеткой только при наличии в среде вещества (индуктора), стимулирующего синтез данного фермента. Например, микроорганизм, не ассимилирующий мальтозу, можно приучить к использованию ее, культивируя в среде с этим сахаром как единственным источником углерода. В этих условиях микроорганизм синтезирует фермент, которым ранее он не обладал.

В живой клетке действие ферментов происходит упорядоченно, строго согласованно. Ферменты локализованы в различных клеточных структурах (в мезосомах, митохондриях, цитоплазматической мембране и др.).

Некоторые ферменты выделяются микроорганизмами наружу (в среду), их принято называть экзоферментами.

Они играют большую роль в подготовке пищи к ее поступлению в клетку. Происходит внеклеточное «переваривание» пищи – расщепление сложных веществ субстрата (крахмала, белков и др.) на более простые, способные проникать в клетку.

Ферменты, прочно связанные с цитоплазмой, не выделяющиеся при жизни клетки в окружающую среду, называют эндоферментами (внутриклеточными). Они участвуют во внутриклеточных процессах обмена веществ.

Хотя ферменты и вырабатываются клеткой, они после ее гибели временно остаются в активном состоянии, и может произойти автолиз (от греч. autos – сам, lysis – растворение) – саморастворение, или самопереваривание, клетки под влиянием ее внутриклеточных ферментов. При разрушении клеток ферменты поступают в среду – субстрат, в котором развивались микроорганизмы. При хранении пищевых продуктов, значительно обсемененных микроорганизмами, даже в условиях, исключающих их развитие, возможно снижение качества продуктов за счет ферментов автолизированных микробных клеток.

Классификация ферментов

Номенклатура ферментов складывалась постепенно, по мере их открытия и изучения. Названия ферментов вначале носили случайный характер. Например, фермент, расщепляющий крахмал, был назван диастазом, а фермент желудочного сока, расщепляющий белки, – пепсином. Позднее название фермента стали составлять из корня слова, обозначающего вещество, на которое действует фермент, добавляя к нему окончание «аза». Так, фермент, расщепляющий крахмал (амилум), стали называть амилазой, фермент, разлагающий мальтозу, – мальтазой и т.п. Наряду с этим ферменты называют и по химической реакции, которую они катализируют. Например, ферменты, катализирующие отщепление водорода от субстрата (дегидрогенирование), называют дегидрогеназами, а расщепляющие сложные органические соединения путем гидролиза – гидролазами.

В настоящее время широкое распространение в мире получила номенклатура ферментов, рекомендованная Международным союзом биохимии и молекулярной биологии (International Union of Biochemistry and Molecular Biology). Эта номенклатура ежегодно пересматривается и дополняется, и сейчас она включает характеристику более 3000 ферментов.

Согласно номенклатуре все ферменты делятся на шесть классов:

• 1-й – оксидоредуктазы;
• 2-й – трансферазы;
• 3-й – гидролазы;
• 4-й – лиазы;
• 5-й – изомеразы;
• 6-й – лигазы (синтетазы).

Классы ферментов подразделяют на подклассы, которые делят на подподклассы. Каждый фермент имеет название и шифр из четырех цифр. Первая цифра обозначает класс, вторая – подкласс, третья – подподкласс, четвертая – порядковый номер данного фермента.

Ниже рассматриваются только некоторые наиболее распространенные ферменты микроорганизмов.

Оксидоредуктазы – окислительно-восстановительные ферменты. В этот класс входят многочисленные ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции процессов энергетического обмена (дыхания, брожения) микроорганизмов. К оксидоредуктазам относят ферменты приведенные ниже.

Дегидрогеназы – ферменты, катализирующие реакцию дегидрогенирования органических соединений: отщепление водорода. Отнятый водород передается дегидрогеназой какому-либо другому веществу (промежуточному – временному или конечному акцептору водорода). Одновременно одно вещество окисляется, а другое восстанавливается.

Дегидрогеназы специфичны по отношению к донору водорода и к его акцептору. Их делят на анаэробные и аэробные.

Анаэробные (первичные) дегидрогеназы передают отнятый от окисляемого субстрата водород другим дегидрогеназам или молекулам каких-либо органических веществ, но не кислороду воздуха. Эти дегидрогеназы являются двухкомпонентными ферментами. Кофермент многих анаэробных дегидрогеназ – никотинамидадениндинуклеотид (сокращенно НАД).

Коферментом других анаэробных дегидрогеназ является никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ).

Анаэробные дегидрогеназы имеются как у анаэробов, так и у аэробов.

Аэробные (вторичные) дегидрогеназы передают активированный водород, отнятый у окисляемого вещества или от восстановленной анаэробной дегидрогеназы, кислороду воздуха непосредственно либо через промежуточных переносчиков.

Аэробные дегидрогеназы, передающие водород субстрата непосредственно кислороду, называют оксидазами. К оксидазам относится, например, полифенолоксидаза, катализирующая реакцию окисления полифенолов с образованием темноокрашенных соединений – меланинов. Этот фермент имеется у многих плесневых грибов. Действие полифенолоксидазы проявляется в потемнении тканей плодов и овощей, пораженных этими плесенями.

К аэробным дегидрогеназам относятся флавиновые ферменты, коферментом которых является флавинадениндинуклеотид (ФАД). В состав кофермента входит рибофлавин (витамин В2). Одни флавиновые ферменты могут переносить водород непосредственно на кислород, т.е. являются оксидазами; другие передают водород от окисляющихся веществ кислороду через ряд промежуточных переносчиков. В таких случаях участвуют системы ферментов, а водород многократно переносится от одного вещества к другому, пока не достигнет своего конечного акцептора – кислорода. Последний подвергается восстановлению с образованием воды или пероксида водорода.

Особо важное значение в процессах аэробного дыхания имеет цитохромная ферментная система, состоящая из цитохромов и фермента цитохромоксидазы.

Цитохромы представляют собой гемопротеиды. В состав простетической группы (гема), функционирующей как переносчик электронов, входит двухвалентное железо. Роль цитохромов в процессе дыхания заключается в последовательном переносе электронов от водородного атома восстановленной дегидрогеназы на цитохромоксидазу.

Цитохромоксидаза – двухкомпонентный гемосодержащий фермент, катализирует окислительно-восстановительную реакцию между восстановленным цитохромом (последним в цепи цитохромов) и кислородом.

Цитохромная система содержится в клетках всех микроорганизмов за исключением облигатно-анаэробных бактерий.

Каталаза – двухкомпонентный фермент, расщепляет перекись водорода на воду и молекулярный кислород.

Трансферазы – ферменты переноса. Ферменты этой группы катализируют перенос частей молекул или атомных группировок от одних соединений к другим. Известно много таких ферментов; их различают по тем группам, перенос которых они катализируют.

Наиболее важное значение в обмене веществ имеют фосфотрансферазы и аминотрансферазы.

Фосфотрансферазы (киназы) катализируют перенос остатков фосфорной кислоты с одного вещества к другому.

Большинство реакций переноса фосфатных групп протекает с участием аденозинтрифосфата (АТФ) и аденозиндифосфата (АДФ). Эти реакции имеют большое значение, благодаря им осуществляется перенос энергии с одного вещества на другое.

Из приведенной ниже формулы видно, что АТФ – высокоэнергетическое соединение; оно имеет одну простую связь ( – ) и две макроэргические («богатые энергией»), обозначаемые значком (~). При гидролизе обычной фосфатной связи освобождается 8,4·103 -12,6·103 Дж на грамм-молекулу отщепленного фосфата, а при гидролизе макроэргической связи – около 4,2·104 Дж.

Фосфотрансферазы участвуют в процессах дыхания и брожения.

Аминотрансферазы – ферменты, осуществляющие реакции переаминирования, т.е. межмолекулярный перенос аминогруппы ( – NH2) с аминокислот на кетокислоты. Эти ферменты обладают специфичностью. Аминотрансферазы – двухкомпонентные ферменты, в состав кофермента входит витамин B6. В обмене веществ они играют большую роль, участвуют в образовании новых аминокислот в клетке.

Гидролазы. К гидролазам относятся ферменты, катализирующие процессы расщепления и синтеза сложных органических веществ по типу гидролитических реакций с участием воды. Большинство гидролаз являются однокомпонентными ферментами.

Гидролазы подразделяют на подгруппы в зависимости от вещества, на которое они действуют.

Карбогидразы – катализируют гидролиз и синтез глюкозидов, ди-, три-и полисахаридов.

Примерами карбогидраз, расщепляющих дисахариды, широко распространенных у микроорганизмов, служат:

- мальтаза (α-глюкозидаза) – расщепляет мальтозу (солодовый, сахар) на две молекулы глюкозы;

- сахараза (инвертаза, β-фруктофуранозидаза) – расщепляет сахарозу на глюкозу и фруктозу;

- лактаза (β-галактозидаза) – расщепляет молочный сахар (лактозу) на галактозу и глюкозу.

Из гидролаз, действующих на полисахариды, наибольшее значение имеют следующие:

- амилазы – ферменты, катализирующие гидролиз крахмала. Известно три типа амилаз: α-амилаза, β-амилаза и глюкоамилаза. Они различаются свойствами и способом действия на крахмал. Амилазы находятся в мицелиальных грибах и многих бактериях; дрожжи не содержат амилаз;

- целлюлаза – фермент, гидролизующий целлюлозу (клетчатку).

Пектолитические ферменты – это комплекс ферментов (протопектиназа, пектинэстераза, полигалактуроназа), гидролизующих протопектин и растворимый пектин с образованием метилового спирта, галактуроновых кислот, пентоз, гексоз; имеются у многих плесеней и некоторых бактерий.

Пептидазы (протеолитические ферменты) катализируют гидролиз белков, пептидов, расщепляя пептидные связи, обладают специфичностью, каждая пептидаза разрывает пептидные связи между определенными аминокислотами.

Дезаминазы и амидазы – ферменты, катализирующие гидролитическое расщепление аминокислот и амидов с отщеплением азота в виде аммиака.

Эстеразы – ферменты катализирующие реакции расщепления и синтеза сложных эфиров (эстеров). Они широко распространены у микроорганизмов. Важную роль в обмене веществ микроорганизмов играют липазы. Липазы – это ферменты, вызывающие гидролиз жиров на глицерин и высокомолекулярные жирные кислоты.

Лиазы. К классу лиаз относятся ферменты, которые катализируют реакции негидролитического расщепления органических веществ, сопровождаемые отщеплением от субстрата тех или иных химических групп: СО2, Н2О, NН3.

Альдолаза – фермент, обратимо расщепляющий шестиуглеродную молекулу фруктозодифосфат на два трехуглеродных соединения: фосфодиоксиацетон и фосфоглицериновый альдегид. Этот фермент участвует в начальной стадии превращения сахара в процессе дыхания и брожения.

Декарбоксилазы – ферменты, катализирующие декарбоксилирование (отщепление СО2) органических кислот. Микроорганизмы, особенно гнилостные бактерии, богаты декарбоксилазами аминокислот.

Во многих микроорганизмах содержится, например, пируватдекарбоксилаза, катализирующая отщепление СО2 от пировиноградной кислоты с образованием уксусного альдегида. В состав кофермента этой декарбоксилазы входит витамин В1.

Декарбоксилазы аминокислот участвуют в отщеплении СО2 от аминокислот с выделением аминов.

Изомеразы. Ферменты этого класса осуществляют превращение органических соединений в их изомеры – внутримолекулярное перемещение радикалов, атомов, атомных группировок.

К этому классу относятся следующие:

триозофосфатизомераза – катализирует взаимное превращение фосфотриоз: фосфодиоксиацетона и фосфоглицеринового альдегида;

глюкозофосфатизомераза – катализирует обратимое превращение глюкозо-6фосфат во фруктозо-6-фосфат.

Оба эти фермента участвуют на первых стадиях превращения сахара в процессах дыхания и брожения.

Лигазы (синтетазы). В этот класс входят ферменты, катализирующие реакции синтеза сложных органических соединений из более простых. Эти реакции требуют затраты энергии и обычно протекают одновременно с расщеплением пирофосфатной (макроэргической) связи в АТФ.

Примерами таких ферментов могут служить:

карбоксилазы – катализируют при участии АТФ присоединение углекислого газа к органическим кислотам;

глутаминсинтетаза и аспарагинсинтетаза – ферменты синтеза глутамина и аспарагина из NH3 и соответствующих аминокислот с участием АТФ.

Лигазы играют большую роль в углеводном и азотном обмене микроорганизмов.

Использование микробных ферментов

Человек издавна использовал ферментативную активность микроорганизмов. Широкое применение микроорганизмов в пищевых производствах основано на использовании их ферментативной деятельности в перерабатываемом пищевом сырье. Культуры микроорганизмов можно заменять их ферментами, выделив их в виде препаратов из клеток или культуральной среды.

Использование микроорганизмов для получения ферментов имеет ряд преимуществ по сравнению с растительным и животным сырьем:

микроорганизмы обладают богатым «ассортиментом» ферментов, среди них есть такие, которые отсутствуют у животных и в растениях;

микроорганизмы быстро размножаются и в течение короткого времени дают огромную массу клеток, из которых (или из культуральной среды) можно выделить большое количество фермента;

микроорганизмы растут на относительно дешевых субстратах, например, на отходах различных промышленных производств;

благодаря современной аппаратуре управлять развитием микроорганизмов значительно легче и проще, чем выращивать растения и животных.

В настоящее время во многих отраслях народного хозяйства ферменты микробного происхождения вытесняют ферменты растительного и животного происхождения.

Отечественное производство микробных ферментных препаратов в последние годы интенсивно развивается. В настоящее время десятки различных ферментов в виде индивидуальных ферментных белков и технических препаратов разной степени очистки производятся в промышленном масштабе с использованием культур плесневых грибов, бактерий и дрожжей.

Ферментный препарат отличается от фермента тем, что содержит помимо белка различные балластные вещества. В настоящее время ферментные препараты довольно широко применяют в пищевой промышленности. Так, препараты грибных амилолитических ферментов используют при производстве этилового спирта из крахмалосодержащего сырья вместо зернового солода; в пивоварении – в целях частичной замены солода несоложенным (не подвергавшимся прорастанию) ячменем; в хлебопекарной промышленности – взамен солода при изготовлении заварного ржаного хлеба; добавляют грибные амилазы и в пшеничное тесто. Поскольку в этом препарате помимо амилазы имеются, хотя и в небольшом количестве, другие ферменты (мальтаза, пептидазы), процесс изготовления теста ускоряется: увеличиваются объем и пористость хлеба, улучшаются его внешний вид, аромат, вкус, С помощью грибной глюкоамилазы получают глюкозную патоку и кристаллическую глюкозу из крахмала.

Пектолитические грибные ферментные препараты используют в производстве соков и виноделии. В результате разрушения пектина этими ферментами ускоряется процесс выделения сока, увеличивается его выход, улучшаются фильтрация и осветление соков.

Ферментные препараты, содержащие микробные пептидазы, применяют для повышения стойкости (предохранения от белкового помутнения) вина и пива; в сыроделии – взамен (частично) сычужного фермента. Целесообразно использовать микробные пептидазы для размягчения мяса, ускорения созревания мяса и сельди, получения из отходов рыбной и мясной промышленности пищевых гидролизатов и в других технологических процессах переработки животного и растительного сырья.

На базе белково-витаминных гидролизатов из остаточных пивных и пекарских дрожжей получают биовкусовые добавки и ароматические вещества со вкусом мяса и сыра, выпускают дрожжевой гидролизат для варенных колбас.

Ведутся разработки современных эффективных биотехнологий производства органических кислот (уксусной, молочной, пропионовой, и др.) с использованием отходов переработки сельскохозяйственного сырья и создание на их основе комплексных пищевых и кормовых добавок функционального действия. Продолжаются исследования по подбору ферментных препаратов с широким спектром действия, осуществляющих глубокий гидролиз высокомолекулярных полимеров клетки. Применение таких препаратов позволит расширить ассортимент легкоусвояемых продуктов детского питания путем включения в их рецептуру богатых белком, полисахаридами и витаминами природных субстратов (д.т.н., профессор Л.В. Римарева).

В легкой промышленности их применяют при обработке кож, тканей, мехов, льна; в сельском хозяйстве – при приготовлении различных видов кормов для животных. В медицине и медицинской промышленности ферменты используют в виде лечебных препаратов, при обработке сырья, предназначенного для лекарственных веществ и других целей.

Так в Японском море обнаружены морские бактерии – продуценты необычных ферментов и низкомолекулярных вторичных метаболитов, особенно антиопухолевых веществ (В.В. Михайлов).

Все разнообразные и многочисленные биохимические реакции, протекающие в живом организме в связи с обменом веществ, совершаются при участии ферментов – биологических катализаторов, вырабатываемых клетками организма.

Ферменты «есть в полном смысле возбудители жизни», – писал русский физиолог академик И.П. Павлов (1849-1936 гг.).

Структура и свойства ферментов. Ферменты представляют собой простые белки (протеины) или сложные (протеиды), состоящие из белка и небелкового компонента – активной группы. Таким образом, существуют ферменты однокомпонентные и двухкомпонентные.

В состав активной группы двухкомпонентных ферментов входят витамины или их производные, различные металлы (Fe, Co, Сu), азотистые основания и др.

Активная группа ферментов обусловливает их каталитическую способность, а белковая часть – специфические свойства, избирательную способность действовать на определенный субстрат.

Прочность связи активной группы с белком у разных ферментов неодинакова. У некоторых она легко может отделяться от белковой части фермента и вступать во временную связь с другими белками. Такие активные группы называют коферментами.

Активные группы, прочно связанные с белковой частью фермента, называются простетическими группами этих ферментов.

В однокомпонентных ферментах роль активной группы выполняют определенные химические группировки в молекуле белка, составляя активный (каталитический) центр фермента.

Ферменты обладают очень высокой активностью. Ничтожно малого количества фермента достаточно, чтобы вовлечь в реакцию значительную массу реагирующего вещества (субстрата). Например, 1 г амилазы при благоприятных условиях может превратить в сахар 1 т крахмала.

Ферменты действуют чрезвычайно быстро, резко ускоряя реакцию. Молекула фермента за 1 мин может вызвать превращение десятков и сотен тысяч молекул соответствующего субстрата.

Особенностями ферментов являются их субстратная специфичность и специфичность действия – каждый фермент взаимодействует лишь с одним определенным веществом и катализирует лишь одно из тех превращений, которым может подвергаться данное вещество.

Специфичность ферментов обусловлена структурными особенностями их молекул и субстрата. Субстрат и фермент подходят друг к другу, как ключ к замку.

Реакция, катализируемая однокомпонентным ферментом, начинается со связывания субстрата с ферментом в определенном участке его – активном центре. Образуется комплекс фермент – субстрат. По окончании реакции образовавшийся комплекс фермента с продуктами реакции распадается, и при этом освобождаются исходный фермент и конечные продукты ферментативного процесса (рис. 26).

Рис. 26. Схема взаимодействия фермента с субстратом

У двухкомпонентных ферментов в связывании и переносе отдельных фрагментов субстрата участвуют коферменты и простетические группы.

Ферменты отличаются неустойчивостью (лабильностью) к воздействию ряда факторов внешней среды. Эта неустойчивость во многом объясняется белковой природой ферментов и выражается в том, что они теряют свою активность (инактивируются).

Условия действия ферментов. Важнейшим фактором, определяющим активность ферментов, является температура. По мере повышения температуры возрастает начальная скорость ферментативной реакции. Однако по достижении известного предела дальнейшее повышение температуры вызывает денатурацию ферментного белка.

Уровень температуры, вызывающий денатурацию различных ферментов, неодинаков. Для одних ферментов это 40-50 °С, для других (термоустойчивых) – только 70 °С, но при температуре около 100 °С почти все ферменты инактивируются.

Некоторые ферменты после тепловой инактивации способны восстанавливать каталитическую активность – в случае обратимого процесса денатурации белка.

Оптимальная температура, при которой данный фермент наиболее активен, для разных ферментов различна и в известной мере характеризует каждый фермент. У холодолюбивых микроорганизмов температурный оптимум ферментов значительно ниже, чем у теплолюбивых.

При температуре ниже оптимальных пределов скорость ферментативных процессов уменьшается. В условиях температур, близких к нулю и особенно ниже нуля, эти реакции значительно замедляются, а некоторые приостанавливаются, хотя при таких температурах сами ферменты заметно не разрушаются.

Большое влияние на ход ферментативных процессов оказывает рН среды. Для действия каждого фермента имеется свое оптимальное значение рН среды. При значении рН выше или ниже оптимальной величины активность ферментов снижается.

На активность ферментов влияет и присутствие в среде некоторых химических веществ. Одни из них ускоряют ферментативную реакцию (активаторы), другие – снижают ее или полностью приостанавливают (ингибиторы). Действие многих активаторов и ингибиторов специфично.

Активаторами ферментов являются, например, металлы (Сu, Mn, Mg, Co), витамины.

Ингибиторами ферментов служат соли тяжелых металлов, антибиотики, сероводород и др. Они соединяются с активными группами или активными центрами ферментов, парализуя тем самым связывание с ними субстрата.

Лучистая энергия (ультрафиолетовые лучи, радиоактивные излучения) инактивирует ферменты.

Концентрация субстрата, т.е. вещества, на которое действует фермент, и концентрация фермента также влияют в известной мере на скорость процессов.

Биохимические процессы, протекающие в микробных клетках, регулируются ферментами, поэтому любой фактор, действующий на активность фермента, действует и на микроорганизм.

Каждый микроорганизм обладает комплексом разнообразных ферментов, своеобразием и активностью которых определяются их биохимическая деятельность, избирательность в отношении питательных веществ, роль микроорганизмов в круговороте веществ в природе, в процессах порчи пищевых продуктов.

Ферменты, присущие данному микроорганизму, входящие в число компонентов его клетки, называют конститутивными. Существуют ферменты индуцируемые (адаптивные), которые вырабатываются клеткой только при наличии в среде вещества (индуктора), стимулирующего синтез данного фермента. Например, микроорганизм, не ассимилирующий мальтозу, можно приучить к использованию ее, культивируя в среде с этим сахаром как единственным источником углерода. В этих условиях микроорганизм синтезирует фермент, которым ранее он не обладал.

В живой клетке действие ферментов происходит упорядоченно, строго согласованно. Ферменты локализованы в различных клеточных структурах (в мезосомах, митохондриях, цитоплазматической мембране и др.).

Некоторые ферменты выделяются микроорганизмами наружу (в среду), их принято называть экзоферментами.

Они играют большую роль в подготовке пищи к ее поступлению в клетку. Происходит внеклеточное «переваривание» пищи – расщепление сложных веществ субстрата (крахмала, белков и др.) на более простые, способные проникать в клетку.

Ферменты, прочно связанные с цитоплазмой, не выделяющиеся при жизни клетки в окружающую среду, называют эндоферментами (внутриклеточными). Они участвуют во внутриклеточных процессах обмена веществ.

Хотя ферменты и вырабатываются клеткой, они после ее гибели временно остаются в активном состоянии, и может произойти автолиз (от греч. autos – сам, lysis – растворение) – саморастворение, или самопереваривание, клетки под влиянием ее внутриклеточных ферментов. При разрушении клеток ферменты поступают в среду – субстрат, в котором развивались микроорганизмы. При хранении пищевых продуктов, значительно обсемененных микроорганизмами, даже в условиях, исключающих их развитие, возможно снижение качества продуктов за счет ферментов автолизированных микробных клеток.

Классификация ферментов

Номенклатура ферментов складывалась постепенно, по мере их открытия и изучения. Названия ферментов вначале носили случайный характер. Например, фермент, расщепляющий крахмал, был назван диастазом, а фермент желудочного сока, расщепляющий белки, – пепсином. Позднее название фермента стали составлять из корня слова, обозначающего вещество, на которое действует фермент, добавляя к нему окончание «аза». Так, фермент, расщепляющий крахмал (амилум), стали называть амилазой, фермент, разлагающий мальтозу, – мальтазой и т.п. Наряду с этим ферменты называют и по химической реакции, которую они катализируют. Например, ферменты, катализирующие отщепление водорода от субстрата (дегидрогенирование), называют дегидрогеназами, а расщепляющие сложные органические соединения путем гидролиза – гидролазами.

В настоящее время широкое распространение в мире получила номенклатура ферментов, рекомендованная Международным союзом биохимии и молекулярной биологии (International Union of Biochemistry and Molecular Biology). Эта номенклатура ежегодно пересматривается и дополняется, и сейчас она включает характеристику более 3000 ферментов.

Согласно номенклатуре все ферменты делятся на шесть классов:

• 1-й – оксидоредуктазы;
• 2-й – трансферазы;
• 3-й – гидролазы;
• 4-й – лиазы;
• 5-й – изомеразы;
• 6-й – лигазы (синтетазы).

Классы ферментов подразделяют на подклассы, которые делят на подподклассы. Каждый фермент имеет название и шифр из четырех цифр. Первая цифра обозначает класс, вторая – подкласс, третья – подподкласс, четвертая – порядковый номер данного фермента.

Ниже рассматриваются только некоторые наиболее распространенные ферменты микроорганизмов.

Оксидоредуктазы – окислительно-восстановительные ферменты. В этот класс входят многочисленные ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции процессов энергетического обмена (дыхания, брожения) микроорганизмов. К оксидоредуктазам относят ферменты приведенные ниже.

Дегидрогеназы – ферменты, катализирующие реакцию дегидрогенирования органических соединений: отщепление водорода. Отнятый водород передается дегидрогеназой какому-либо другому веществу (промежуточному – временному или конечному акцептору водорода). Одновременно одно вещество окисляется, а другое восстанавливается.

Дегидрогеназы специфичны по отношению к донору водорода и к его акцептору. Их делят на анаэробные и аэробные.

Анаэробные (первичные) дегидрогеназы передают отнятый от окисляемого субстрата водород другим дегидрогеназам или молекулам каких-либо органических веществ, но не кислороду воздуха. Эти дегидрогеназы являются двухкомпонентными ферментами. Кофермент многих анаэробных дегидрогеназ – никотинамидадениндинуклеотид (сокращенно НАД).

Коферментом других анаэробных дегидрогеназ является никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ).

Анаэробные дегидрогеназы имеются как у анаэробов, так и у аэробов.

Аэробные (вторичные) дегидрогеназы передают активированный водород, отнятый у окисляемого вещества или от восстановленной анаэробной дегидрогеназы, кислороду воздуха непосредственно либо через промежуточных переносчиков.

Аэробные дегидрогеназы, передающие водород субстрата непосредственно кислороду, называют оксидазами. К оксидазам относится, например, полифенолоксидаза, катализирующая реакцию окисления полифенолов с образованием темноокрашенных соединений – меланинов. Этот фермент имеется у многих плесневых грибов. Действие полифенолоксидазы проявляется в потемнении тканей плодов и овощей, пораженных этими плесенями.

К аэробным дегидрогеназам относятся флавиновые ферменты, коферментом которых является флавинадениндинуклеотид (ФАД). В состав кофермента входит рибофлавин (витамин В2). Одни флавиновые ферменты могут переносить водород непосредственно на кислород, т.е. являются оксидазами; другие передают водород от окисляющихся веществ кислороду через ряд промежуточных переносчиков. В таких случаях участвуют системы ферментов, а водород многократно переносится от одного вещества к другому, пока не достигнет своего конечного акцептора – кислорода. Последний подвергается восстановлению с образованием воды или пероксида водорода.

Особо важное значение в процессах аэробного дыхания имеет цитохромная ферментная система, состоящая из цитохромов и фермента цитохромоксидазы.

Цитохромы представляют собой гемопротеиды. В состав простетической группы (гема), функционирующей как переносчик электронов, входит двухвалентное железо. Роль цитохромов в процессе дыхания заключается в последовательном переносе электронов от водородного атома восстановленной дегидрогеназы на цитохромоксидазу.

Цитохромоксидаза – двухкомпонентный гемосодержащий фермент, катализирует окислительно-восстановительную реакцию между восстановленным цитохромом (последним в цепи цитохромов) и кислородом.

Цитохромная система содержится в клетках всех микроорганизмов за исключением облигатно-анаэробных бактерий.

Каталаза – двухкомпонентный фермент, расщепляет перекись водорода на воду и молекулярный кислород.

Трансферазы – ферменты переноса. Ферменты этой группы катализируют перенос частей молекул или атомных группировок от одних соединений к другим. Известно много таких ферментов; их различают по тем группам, перенос которых они катализируют.

Наиболее важное значение в обмене веществ имеют фосфотрансферазы и аминотрансферазы.

Фосфотрансферазы (киназы) катализируют перенос остатков фосфорной кислоты с одного вещества к другому.

Большинство реакций переноса фосфатных групп протекает с участием аденозинтрифосфата (АТФ) и аденозиндифосфата (АДФ). Эти реакции имеют большое значение, благодаря им осуществляется перенос энергии с одного вещества на другое.

Из приведенной ниже формулы видно, что АТФ – высокоэнергетическое соединение; оно имеет одну простую связь ( – ) и две макроэргические («богатые энергией»), обозначаемые значком (~). При гидролизе обычной фосфатной связи освобождается 8,4·103 -12,6·103 Дж на грамм-молекулу отщепленного фосфата, а при гидролизе макроэргической связи – около 4,2·104 Дж.

Фосфотрансферазы участвуют в процессах дыхания и брожения.

Аминотрансферазы – ферменты, осуществляющие реакции переаминирования, т.е. межмолекулярный перенос аминогруппы ( – NH2) с аминокислот на кетокислоты. Эти ферменты обладают специфичностью. Аминотрансферазы – двухкомпонентные ферменты, в состав кофермента входит витамин B6. В обмене веществ они играют большую роль, участвуют в образовании новых аминокислот в клетке.

Гидролазы. К гидролазам относятся ферменты, катализирующие процессы расщепления и синтеза сложных органических веществ по типу гидролитических реакций с участием воды. Большинство гидролаз являются однокомпонентными ферментами.

Гидролазы подразделяют на подгруппы в зависимости от вещества, на которое они действуют.

Карбогидразы – катализируют гидролиз и синтез глюкозидов, ди-, три-и полисахаридов.

Примерами карбогидраз, расщепляющих дисахариды, широко распространенных у микроорганизмов, служат:

- мальтаза (α-глюкозидаза) – расщепляет мальтозу (солодовый, сахар) на две молекулы глюкозы;

- сахараза (инвертаза, β-фруктофуранозидаза) – расщепляет сахарозу на глюкозу и фруктозу;

- лактаза (β-галактозидаза) – расщепляет молочный сахар (лактозу) на галактозу и глюкозу.

Из гидролаз, действующих на полисахариды, наибольшее значение имеют следующие:

- амилазы – ферменты, катализирующие гидролиз крахмала. Известно три типа амилаз: α-амилаза, β-амилаза и глюкоамилаза. Они различаются свойствами и способом действия на крахмал. Амилазы находятся в мицелиальных грибах и многих бактериях; дрожжи не содержат амилаз;

- целлюлаза – фермент, гидролизующий целлюлозу (клетчатку).

Пектолитические ферменты – это комплекс ферментов (протопектиназа, пектинэстераза, полигалактуроназа), гидролизующих протопектин и растворимый пектин с образованием метилового спирта, галактуроновых кислот, пентоз, гексоз; имеются у многих плесеней и некоторых бактерий.

Пептидазы (протеолитические ферменты) катализируют гидролиз белков, пептидов, расщепляя пептидные связи, обладают специфичностью, каждая пептидаза разрывает пептидные связи между определенными аминокислотами.

Дезаминазы и амидазы – ферменты, катализирующие гидролитическое расщепление аминокислот и амидов с отщеплением азота в виде аммиака.

Эстеразы – ферменты катализирующие реакции расщепления и синтеза сложных эфиров (эстеров). Они широко распространены у микроорганизмов. Важную роль в обмене веществ микроорганизмов играют липазы. Липазы – это ферменты, вызывающие гидролиз жиров на глицерин и высокомолекулярные жирные кислоты.

Лиазы. К классу лиаз относятся ферменты, которые катализируют реакции негидролитического расщепления органических веществ, сопровождаемые отщеплением от субстрата тех или иных химических групп: СО2, Н2О, NН3.

Альдолаза – фермент, обратимо расщепляющий шестиуглеродную молекулу фруктозодифосфат на два трехуглеродных соединения: фосфодиоксиацетон и фосфоглицериновый альдегид. Этот фермент участвует в начальной стадии превращения сахара в процессе дыхания и брожения.

Декарбоксилазы – ферменты, катализирующие декарбоксилирование (отщепление СО2) органических кислот. Микроорганизмы, особенно гнилостные бактерии, богаты декарбоксилазами аминокислот.

Во многих микроорганизмах содержится, например, пируватдекарбоксилаза, катализирующая отщепление СО2 от пировиноградной кислоты с образованием уксусного альдегида. В состав кофермента этой декарбоксилазы входит витамин В1.

Декарбоксилазы аминокислот участвуют в отщеплении СО2 от аминокислот с выделением аминов.

Изомеразы. Ферменты этого класса осуществляют превращение органических соединений в их изомеры – внутримолекулярное перемещение радикалов, атомов, атомных группировок.

К этому классу относятся следующие:

триозофосфатизомераза – катализирует взаимное превращение фосфотриоз: фосфодиоксиацетона и фосфоглицеринового альдегида;

глюкозофосфатизомераза – катализирует обратимое превращение глюкозо-6фосфат во фруктозо-6-фосфат.

Оба эти фермента участвуют на первых стадиях превращения сахара в процессах дыхания и брожения.

Лигазы (синтетазы). В этот класс входят ферменты, катализирующие реакции синтеза сложных органических соединений из более простых. Эти реакции требуют затраты энергии и обычно протекают одновременно с расщеплением пирофосфатной (макроэргической) связи в АТФ.

Примерами таких ферментов могут служить:

карбоксилазы – катализируют при участии АТФ присоединение углекислого газа к органическим кислотам;

глутаминсинтетаза и аспарагинсинтетаза – ферменты синтеза глутамина и аспарагина из NH3 и соответствующих аминокислот с участием АТФ.

Лигазы играют большую роль в углеводном и азотном обмене микроорганизмов.

Использование микробных ферментов

Человек издавна использовал ферментативную активность микроорганизмов. Широкое применение микроорганизмов в пищевых производствах основано на использовании их ферментативной деятельности в перерабатываемом пищевом сырье. Культуры микроорганизмов можно заменять их ферментами, выделив их в виде препаратов из клеток или культуральной среды.

Использование микроорганизмов для получения ферментов имеет ряд преимуществ по сравнению с растительным и животным сырьем:

микроорганизмы обладают богатым «ассортиментом» ферментов, среди них есть такие, которые отсутствуют у животных и в растениях;

микроорганизмы быстро размножаются и в течение короткого времени дают огромную массу клеток, из которых (или из культуральной среды) можно выделить большое количество фермента;

микроорганизмы растут на относительно дешевых субстратах, например, на отходах различных промышленных производств;

благодаря современной аппаратуре управлять развитием микроорганизмов значительно легче и проще, чем выращивать растения и животных.

В настоящее время во многих отраслях народного хозяйства ферменты микробного происхождения вытесняют ферменты растительного и животного происхождения.

Отечественное производство микробных ферментных препаратов в последние годы интенсивно развивается. В настоящее время десятки различных ферментов в виде индивидуальных ферментных белков и технических препаратов разной степени очистки производятся в промышленном масштабе с использованием культур плесневых грибов, бактерий и дрожжей.

Ферментный препарат отличается от фермента тем, что содержит помимо белка различные балластные вещества. В настоящее время ферментные препараты довольно широко применяют в пищевой промышленности. Так, препараты грибных амилолитических ферментов используют при производстве этилового спирта из крахмалосодержащего сырья вместо зернового солода; в пивоварении – в целях частичной замены солода несоложенным (не подвергавшимся прорастанию) ячменем; в хлебопекарной промышленности – взамен солода при изготовлении заварного ржаного хлеба; добавляют грибные амилазы и в пшеничное тесто. Поскольку в этом препарате помимо амилазы имеются, хотя и в небольшом количестве, другие ферменты (мальтаза, пептидазы), процесс изготовления теста ускоряется: увеличиваются объем и пористость хлеба, улучшаются его внешний вид, аромат, вкус, С помощью грибной глюкоамилазы получают глюкозную патоку и кристаллическую глюкозу из крахмала.

Пектолитические грибные ферментные препараты используют в производстве соков и виноделии. В результате разрушения пектина этими ферментами ускоряется процесс выделения сока, увеличивается его выход, улучшаются фильтрация и осветление соков.

Ферментные препараты, содержащие микробные пептидазы, применяют для повышения стойкости (предохранения от белкового помутнения) вина и пива; в сыроделии – взамен (частично) сычужного фермента. Целесообразно использовать микробные пептидазы для размягчения мяса, ускорения созревания мяса и сельди, получения из отходов рыбной и мясной промышленности пищевых гидролизатов и в других технологических процессах переработки животного и растительного сырья.

На базе белково-витаминных гидролизатов из остаточных пивных и пекарских дрожжей получают биовкусовые добавки и ароматические вещества со вкусом мяса и сыра, выпускают дрожжевой гидролизат для варенных колбас.

Ведутся разработки современных эффективных биотехнологий производства органических кислот (уксусной, молочной, пропионовой, и др.) с использованием отходов переработки сельскохозяйственного сырья и создание на их основе комплексных пищевых и кормовых добавок функционального действия. Продолжаются исследования по подбору ферментных препаратов с широким спектром действия, осуществляющих глубокий гидролиз высокомолекулярных полимеров клетки. Применение таких препаратов позволит расширить ассортимент легкоусвояемых продуктов детского питания путем включения в их рецептуру богатых белком, полисахаридами и витаминами природных субстратов (д.т.н., профессор Л.В. Римарева).

В легкой промышленности их применяют при обработке кож, тканей, мехов, льна; в сельском хозяйстве – при приготовлении различных видов кормов для животных. В медицине и медицинской промышленности ферменты используют в виде лечебных препаратов, при обработке сырья, предназначенного для лекарственных веществ и других целей.

Так в Японском море обнаружены морские бактерии – продуценты необычных ферментов и низкомолекулярных вторичных метаболитов, особенно антиопухолевых веществ (В.В. Михайлов).