Метод Кьельдаля. Содержание белка вычисляют на основа­нии определения количества азота в навеске молока. Все азот­содержащие составные части молока при нагревании с концен­трированной серной кислотой переходят в (NH₄)₂S0₄. При этом выделяются тяжелые пары S0₂, поэтому сжигание следует производить в вытяжном шкафу.

Чтобы ускорить разрушение органических соединений, до­бавляют в качестве катализаторов CuS0₄, HgO или Н₂0₂, а с целью повышения точки кипения — K2SO4 или безводный Na₂S0₄. По окончании реакции в результате взаимодействия концентрированной щелочи с сернокислым аммонием выде­ляется свободный аммиак, который отгоняется из водного рас­твора в приемную колбу и поглощается кислотой определенной концентрации, взятой в определенном количестве.

Избыток кислоты оттитровывают щелочью. Разница между количествами взятой и остаточной кислоты составляет количе­ство кислоты, нейтрализованной аммиаком. 1 мл 0,1 н. кислоты эквивалентен 0,0014 г азота.

Чтобы вычислить содержание белка во взятой навеске, ко­личество азота умножают на 6,38.

10 мл молока вносят пипеткой в колбу Кьельдаля. Вес мо­лока определяют, взвешивая отдельно молоко, вылитое из той же пипетки.

Прибавляют в колбу Кьельдаля 25 мл химически чистой кои- центрированной серной кислоты, стараясь смыть оставшееся на стенке колбы молоко, и кристаллик CuS0₄ (около 0,3 г). Пере­мешивают вращательными движениями содержимое колбы, ко­торое сильно разогревается и чернеет. Укрепляют колбу зажи­мом в наклонном положении на нагревательном приборе.

В горло колбы вкладывают небольшую стеклянную воронку или грушу для предотвращения сильного выкипания кислоты, (рис. 48). Сначала содержимое колбы нагревают слабо, следя, чтобы масса сильно не вспенивалась. Когда начнут выделяться тяжелые белые пары, вносят около 10 г K2S0₄ и усиливают нагревание. Периодически вращая колбу, смывают с ее стенок обугливающиеся частицы молока.

После того как жидкость над белым осадком станет проз­рачной, слегка зеленоватого или желтоватого оттенка, нагре­вание продолжают еще час.

После охлаждения содержимое колбы Кьельдаля разводят осторожно водой (при этом происходит сильное разогревание) и переносят количественно в дистилляционную колбу емкостью 750—1000 мл. Объем жидкости должен быть около 500 мл. Бросают в колбу лакмусовую бумажку, щепотку порошкообраз­ной пемзы или 5 г мелко гранулированного цинка (для предотвращения вспенивания) и 75—80 мл 45%-ного раствора NaOH, который приливают по стенке на дно колбы, где он образует под кислотой слой.

Дистилляционную колбу 1 (рис. 48) соединяют через капле­уловитель 3 с холодильником 4 и трубкой 5, погруженной в раствор, находящийся в приемнике 2. Приемник содержит 50 мл 0,1 н. раствора НС1 или H₂S0₄ (растворы 6 и 7) и несколько капель 0,2%-ного раствора метилрота или смешанного индика­тора (раствор 18 или 22).

Перемешивают содержимое дистилляционной колбы, кото­рое должно иметь щелочную реакцию, что определяют по ок­раске лакмусовой бумажки, и начинают перегонку, считая, что весь аммиак должен отогнаться с первыми 250 мл дистиллята.

Необходимо постоянное наблюдение за ходом перегонки, так как с уменьшением степени нагревания возможно втягивание жидкости из приемной колбы в холодильник. В случае подъема жидкости в трубке, на короткое время, не прекращая нагревания, вынимают ее из приемной колбы; поднявшаяся жидкость сте­кает обратно, после этого конец трубки вновь опускают в прием­ную колбу.

Окончание перегонки определяют лакмусовой бумажкой. Трубку 5 вынимают из жидкости приемной колбы и ополаски­вают наружные стенки ее дистиллированной водой из промы- валки. Затем одной-двумя каплями стекающей из холодильника жидкости смачивают красную лакмусовую бумажку. Если вы­деление аммиака в дистилляционной колбе прекратилось, крас­ная бумажка не синеет.

Если бумажка посинела, отгонку продолжают до получения отрицательной реакции на аммиак по лакмусу. При прекраще­нии перегонки, не отнимая нагревательного прибора, отсоеди­няют трубку 5 от холодильника и отставляют приемную колбу с трубкой в сторону. Ополаскивают трубку снаружи и внутри водой, сливая воду в ту же приемную колбу. Избыток 0,1 н. раствора H2SO4 оттитровьгвают 0,1 н. раствором NaOH (раствор 5), окраска метилрота изменяется от красного цвета до жел­того, а смешанного индикатора — от фиолетового (кислая) до зеленого (щелочная реакция). Титрование ведут осторожно; заканчивают его, прибавляя по каплям 0,1 н. раствор NaOH до ясного изменения окраски. Делают контрольный опыт, приме­няя все реактивы, взятые в том же количестве, что и в рабочем опыте.

Количество миллилитров 0,1 н. раствора H2SO4, вступивших в реакцию с аммиаком, а определяют по формуле:

а = 50 — (б+ в),

где: 50 — количество 0,1 и. раствора кислоты в приемной колбе в мл;

б — количество 0,1 н. раствора щелочи, пошедшее на об­ратное титрование H2SO4, в мл; в—количество миллилитров 0,1 н. раствора щелочи, по­шедшее на контрольный опыт, в мл.

Содержание азота N вычисляют по формуле:

Содержание белка в молоке определяют, умножая количе­ство азота в % на 6,38, т. е. % белка = 6,38И.

Разница между параллельными определениями не должна быть более 0,02 %.

В помещении, где определяют белок, не допускается рабо­тать с аммиаком или хранить его.

Сжигание с применением пергидроля (метод Верещагиной и Мещеряковой). В качестве катализатора вместо CUSO4 при­меняют 30%-ный раствор Н₂0₂ (пергидроль).

К 5 мл молока приливают 5 мл H2SO4 (плотность 1,833, 95%), молоко сильно нагревается и чернеет; добавляют 5 мл пергидроля, начинают нагревание. Сначала содержимое колбы обесцвечивается, но через 15—20 мин смесь снова чернеет. Охладив колбу, вновь добавляют 5 мл пергидроля и продол­жают нагревание.

Пергидроль добавляют до тех пор, пока жидкость не станет бесцветной и прозрачной. Появление белых паров указывает, что процесс сжигания заканчивается. Последние порции пер­гидроля прибавляют по каплям и после обесцвечивания жид­кость нагревают еще несколько минут. Сжигание закончено, когда бесцветная, прозрачная жидкость при охлаждении не темнеет. На 5 мл молока расходуется 15—20 мл пергидроля, сжигание заканчивается за полтора-два часа.

Аммиак перегоняют так, как указано выше. Полученные результаты на 0,1—0,2% выше, чем при анализе методом Кьельдаля.

Метод Кофрани. При нагревании белков в щелочной среде количественно с водяным паром отгоняют аммиак, который об­разуется главным образом в результате гидролиза двух амино­кислот: глютаминовой и аспарагиновой, и только незначитель­ная часть его — вследствие гидролиза других аминокислот.

Эти два процесса протекают с разной скоростью. В то время как гидролиз глютаминовой и аспарагиновой кислот заканчи­вается в течение 7 мин, полное расщепление белков происходит очень медленно.

Аммиак перегоняют в строго установленных условиях, со­держание белка в процентах находят, умножая количество кис­лоты, связанной аммиаком, на коэффициент, найденный экспе­риментально, путем сравнительных определений белка в молоке по Кьельдалю.

Преимущества метода — возможность проведения анализа без вытяжного шкафа, экономия реактивов, простота выполнения анализа, который длится 15—20 мин.

В дистилляционную колбу 4 емкостью 250 мл (рис. 49) вносят 10 мл молрка, 10 мл нормального раствора NaOH и 10 мл 10%-ного раствора ВаС1₂ (для предотвращения пенообра­зования) и быстро соединяют с парообразователем 1, в котором вода была уже нагрета до кипения, а приемная колба 7, содер­жащая 20 мл 0,02 н. раствора H2SO4 и 7—8 капель смешанного индикатора (раствор 22), подставлена под холодильник 6.

Дистилляцию продолжают 10 мин. Для поддержания равно­мерного давления пара служит барометрическая трубка 3. Тем­пература дистиллята не должна быть выше 20 °С. Через 10 мин отсоединяют приемную колбу, ополаскивают небольшим ко­личеством воды наружный кончик трубки, погружаемой в при­емник, и содержимое колбы титруют 0,02 н. раствором NaOH.

Содержание белка в молоке х в % находят по формуле:

х=0,154 а,

где:  а — количество 0,02 н. раствора H2SO4, связанное с ам­миаком, в мл

0,154 — коэффициент, установленный экспериментально.

Точность анализа зависит от точного соблюдения продолжи­тельности перегонки; при отклонении ± 1 мин разница в количе­стве определяемого белка достигает 0,5%. Концентрация щело­чи должна быть 10 н.±0,2 н. с повышением концентрации ще­лочи до 10,9 н., результат завышается на 0,05—0,09%. На ре­зультат анализа влияют также неравномерное давление пара и температура дистиллята.

Для поглощения аммиака вместо 0,02' н. раствора H2SO4 можно применять 20 мл 3%-ного раствора борной кислоты и 7—8 капель смешанного индикатора (раствор 22). При пере­гонке следить, чтоб дистиллят хорошо охлаждался, температура его не должна быть выше 20° С.

Аммиак поглощается борной кислотой с образованием борно­кислого аммония:

Борнокислый аммоний оттитровывают 0,02 н. раствором H2SO4:

2 (NH₄)₃B0₃ + 3H₂S0₄ = 3 (NH₄)₃S0₄ + 2Н₃ВО,.

При применении для поглощения аммиака борной кислоты требуется только один титрованный раствор — 0,02 н. раствор H2S0₄₎ вместо двух — 0,02 н. раствора щелочи и 0,02 н. раствора кислоты.

В этом случае в формуле для определения содержания белка а показывает количество миллилитров 0,02 н. H₂S0₄. израсходованное на титрование борнокислого аммония.

Перед работой прибор тщательно промывают и пропускают через него пар.

Определение общего белка и казеина методом формольного титрования (по Каруниной и Шиловичу). Метод основан на свойстве нейтрального водного раствора аминокислот в присут­ствии нейтрального формалина повышать кислотность с обра­зованием соединений, в которых оба Н+ аминогруппы замещаются метиленовой группой:

К 10 мл свежего молока (кислотность не выше 22 °Т) при­бавляют 10—12 капель 1%-ного спиртового раствора фенол­фталеина и титруют 0,1 н. раствором щелочи до слабо-розового окрашивания, не исчезающего при взбалтывании. После этого в эту пробу приливают 2 мл нейтрализованного формалина (раствор 34).

Содержимое взбалтывают или перемешивают стеклянной палочкой. Розовое окрашивание, появившееся при начальном титровании, исчезает. Продолжают титровать пробу щелочью до появления вновь неисчезающего такого же слабо-розового окра­шивания. Количество 0,1 н. раствора щелочи, пошедшее на тит­рование. 10 мл молока после добавления формалина, умножают на 1,92 и получают содержание общего белка в молоке в %.

Чтобы определить содержание казеина, количество миллилитров 0,1 н. раствора щелочи, пошедшее на титрование 10 мл молока после добавления формалина, умножают на 1,51.

Метод рекомендуется только для анализа сборного молока. Получаемые результаты отклоняются от полученных методом Кьельдаля на ±0,05%, что составляет 1,4% белка.

Основным условием более точного определения общего бел­ка и казеина методом формального титрования является одина­ковая интенсивность окраски раствора при первом и втором титровании.

По результатам начального титрования можно определить кислотность молока. Так как титрование производят без воды, но с добавлением большего количества фенолфталеина, то из полученного градуса кислотности вычитают 1. Например, на начальное титрование израсходовано 2 мл. Следовательно, кис­лотность молока составит: 20—1= 19 °Т.

Определение общего белка методом формольного титрова­ния (по Дуденкову). Чтобы повысить точность определения, при титровании применяют эталон окраски и добавляют к молоку нейтральный раствор гексаметафосфата, который, образуя с кальцием устойчивые растворимые комплексные соединения, исключает влияние кальция и образует более прозрачные рас­творы, в которых легче установить конечную точку титрования.

В химический стакан отмеривают 20 мл молока, 2 мл 20%-ного нейтрализованного раствора гексаметафосфата нат­рия (раствор 66), 0,25 мл 2%-ного раствора фенолфталеина и через 2 мин титруют 0,1 н. раствором едкого натра до появ­ления розовой окраски, соответствующей эталону: смесь 20 мл молока, 2 мл раствора гексаметафосфата натрия и 1,1 —1,2 мл 0,0005%-ного раствора основного фуксина (раствор 356). Затем вносят 4 мл нейтрализованного свежеприготовленного форма­лина (раствор 34) и вторично титруют до той же окраски. Количество миллилитров 0,1 н. раствора NaOH, израсходован­ное на второе титрование, умноженное на 0,861, дает содержание общего белка в молоке в процентах.