Лактококки (по старой номенклатуре мезофильные молочнокислые стрептококки) являются основными представителями необходимой мик­рофлоры для большинства сыров за исключением твердых сыров с высо­кими и средними температурами II нагревания. Опыты по выработке сы­ров из асептически полученного молока в асептических ваннах, предо­храняющих сыр во время выработки от загрязнения посторонней микро­флорой, показали, что лактококки являются необходимой и достаточной микрофлорой для производства сыров с низкими температурами II на­гревания. Они являются единственной микрофлорой, уча­ствующей в производстве большинства кисломолочных сыров.

В 9-ом издании определителя бактерий Берджи род Lactococcus входит в группу 17 «Грамположительные кокки». Дифференциальные признаки рода: факультативные анаэробы, метаболизм бродильного ти­па, сбраживают углеводы с образованием в основном L(+)-молочной кислоты без выделения газа, растут при 10° С, не растут при 45° С и в присутствии 6,5% NaCl. Лактококки являются мезофильными гомоферментативными бактериями. Типовой вид Lactococcus lactis имеет три подвида: Lactococcus lactis subsp. lactis; Lactococcus lactis subsp. cremoris и Lactococcus lactis subsp. diacetylactis (для краткости будем их называть молочный, сливочный и диацетильный лактококки, либо Lc. lactis, Lc. cremoris и Lc. diacetylactis). В 9-ом издании определителя бак­терий Берджи приведен Lactococcus lactis subsp. hordinae, не сбражи­вающий лактозу, о роли которого в сыроделии ничего неизвестно, но исключен Lc. lactis subsp. diacetylactis, имеющий исключительно важное значение в производстве сыра. Исключение диацетильного лактококка из классификации следует рассматривать как ошибку. Кроме молочного лактококка с подвидами в группу лактококков включены четыре вида Lc. garviese, Lc. piscium, Lc. rqffinolactis и L plantarum. Значение для сыро­делия первых трех видов не выявлено, клетки L plantarum обычно имеют форму коротких палочек и этот вид рассматривается в группе лактобацилл.

Лактококки в среде с достаточной концентрацией глюкозы или лакто­зы при pH 7,0 и 30° С в анаэробных условиях образуют из сброженного сахара до 95% молочной кислоты; в средах с ограниченным содержанием сахаров они сбраживают их по гетероферментативному пути, образуя, кро­ме молочной, уксусную и муравьиную кислоты, этанол.

Лактококки - факультативные анаэробы, получают энергию только путем брожения. Большинство микроорганизмов могут получать энер­гию разными путями, что обеспечивает им возможность существования в различных условиях. Поэтому более правильно говорить не о гомо- или гетероферментативных бактериях, а о том, каким путем они полу­чают энергию. Лактококки в оптимальных условиях получают энергию из глюкозы или лактозы гомоферментативным путем, в неблагоприят­ных - гетероферметативным путем. В опытах Collins в среде, содержа­щей 0,18% глюкозы, лактококки сбраживали в уксусную кислоту до 14% сахара. При низкой степени разбавления среды в хемостате, приво­дящей к дефициту углеводов, лактококки могут трансформировать в мо­лочную кислоту только 1% сброженной глюкозы. Пути сбраживания глюкозы и лактозы лактококками зависят от температуры: при 30-37° С глюкоза сбраживается по гомоферментативному, при 15-20° С - по гете­роферментативному пути. Таким образом, во время созревания сыров лактоза сбраживается по гетероферментативному пути, что объяс­няет постоянное наличие уксусной кислоты в твердых сычужных сырах. По гетероферментативному пути большинство штаммов лактококков сбраживает галактозу, мальтозу, рибозу, глюконат.

Диагностические характеристики лактококков приведены в табл. 3.3. Филогенетически все три подвида близко родственны и образуют четко очерченный таксон. Однако между подвидами четкого разделения не существует. Из заквасок и ферментированных молочных продуктов часто выделяют штаммы лактококков с промежуточными свойствами. Это происходит потому, что такие свойства лактококков, как способность ферментировать лактозу, цитраты, сахарозу, галактозу, протеиназная активность, способность синтезировать антибиотик низин и, возможно, гидролизовать аргинин, закодированы на плазмидной ДНК, репликация которой происходит независимо от репли­кации хромосомной ДНК. При потере клеткой плазмиды дочерние клетки не получают ее копии и теряют способность выполнять ту функ­цию, которая была закодирована на данной плазмиде. Лактококки, выде­ленные из сырого молока, по способности сбраживать различные источ­ники углерода можно разделить на 15, 35 и 13 физиологических групп соответственно Lc. lactis subsp. cremoris, Lc. lactis subsp. lactis и Lc. lactis subsp. diacetylactis. Встречаются штаммы молочного лактококка, неспособные гидролизовать аргинин. Потеря этого свойства часто сопро­вождается приобретением способности утилизировать цитраты. Из заква­сок выделяли штаммы сливочного лактококка (по старой номенклатуре Str. cremoris), которые росли в бульоне с 4% NaCl, сбраживали мальтозу и декстрин, образовывали небольшие количества диацетила. Некоторые авторы считают, что лактококки образуют фенотипически и генотипиче­ски непрерывный спектр с концентрацией около трех точек, которые ус­ловно назвали подвидами lactis, diacetylactis и cremoris. Показательно, что около 30% бактериофагов, выделенных на сыродельных заводах, способ­ны лизировать штаммы всех трех подвидов лактококков.

Главным отличием Lc. lactis subsp. diacetylactis от двух других подви­дов является его способность утилизировать цитраты с образованием С0₂, диацетила и ацетоина. Это отличие имеет принципиальное значение, так как образуемый этим подвидом С0₂ обусловливает формирование рисунка в наиболее распространенных твердых сырах, а рисунок является важным и легко распознаваемым потребителем показателем качества продукта. Диацетил (но не ацетоин) принимает участие в формировании аромата сыров. Благодаря образованию диацетила диацетильный лактококк и лейконостоки часто называют ароматообразующими, а два других вида - кислотообразующими микроорганизмами. Это справедливо для кислосли­вочного масла, аромат которого зависит в первую очередь от содержания в нем диацетила, в сырах же роль диацетила значительно скромнее. В про­изводстве Чеддера, например, ароматообразующие молочнокислые бакте­рии не применяют, потому что образование ими С0₂ приводит к появле­нию «открытой» структуры (появлению трещин в сырной массе), которая считается большим пороком этого сыра. Диацетил в Чеддере часто вообще не обнаруживается после первых двух недель созревания. Не­смотря на это, Чеддер обладает хорошо выраженными ароматом и сырным вкусом. В то же время активные по кислотообразующей способности штаммы диацетильного лактококка вносят в образование кислоты при производстве сыров такой же вклад, какой вносят два других подвида лак­тококков. Диацетильный лактококк и лейконостоки лучше называть не ароматообразующей, а газообразующей микрофлорой заквасок.

В процессе культивирования, особенно на молочных средах, диаце­тильный лактококк может потерять способность синтезировать цитрат пермеазу, осуществляющую транспорт цитратов через клеточную мем­брану, и тем самым перестать утилизировать цитраты. Однако и в этом случае у него обнаруживается цитратаза, отсутствующая у мо­лочного лактококка. Нестабильность способности диацетильного лактококка утилизировать цитраты обусловлена тем, что она закодиро­вана на плазмидах.

Несмотря на способность образовывать С0₂ из цитратов, диаце­тильный лактококк является гомоферментативным микроорганизмом, так как гомоферментативность и гетероферментативность являются ха­рактеристиками основного пути получения бактерией энергии из глю­козы, а глюкозу он сбраживает подобно другим подвидам лактококков в молочную кислоту (до 95% от общего количества сброженной лактозы) без образования С0₂. Для сбраживания цитратов в молоке диацетиль­ный лактококк нуждается в Мп²⁺.

Диацетильный лактококк отличается от Lc. lactis subsp. lactis по протеолитической активности, скорости роста в молоке (табл. 3.5). По скорости роста в молоке диацетильный лактококк разделяется на две группы: свертывающие молоко при посевной дозе 3% и опти­мальной температуре за 4-9 ч («активные» штаммы), т. е. с такой же скоростью, как активные штаммы молочного лактококка, и свертываю­щие молоко в этих условиях за 14-36 ч («слабые» штаммы). При посевной дозе 1% и температуре 30° С активные штаммы повышали кислотность молока за 5 ч до 40-54° Т, слабые - до 32-34° Т. По количеству образуемого в молоке диацетила слабые штаммы можно раз­бить на две группы: представители первой группы образовывали в моло­ке 0,5-0,75 мг% диацетила, второй - 0,139-0,233 мг%. Слабые и актив­ные штаммы отличаются по протеолитической активности в молоке (табл. 3.5). Активные по росту в молоке штаммы диацетильного лакто­кокка подобно молочному и сливочному лактококкам в процессе раз­множения в молоке снижали содержание растворимых белков и увеличивали содержание пептидов и свободных аминокислот, а слабые штам­мы, наоборот, увеличивали содержание растворимых белков и снижали содержание пептидов при незначительном увеличении содержания свободных аминокислот. Эта особенность штаммов диацетильного лакто­кокка с низкой скоростью кислотообразования в молоке имеет большое значение для сыроделия, так как горечь в сырах чаще всего связана с образованием пептидов, обладающих горьким вкусом. Включение в со­став заквасок для производства твердых сыров с низкими температурами II нагревания слабых штаммов диацетильного лактококка уменьшает опасность появления в них горького вкуса.

Штаммы диацетильного стрептококка с низкой скоростью роста в молоке отличаются от активных штаммов не только протеолитической активностью, но и более высоким уровнем образования диацетила в моло­ке по отношению к образованию ацетоина, хотя среди них имеются штам­мы, также образующие только небольшие количества диацетила.

Сливочный лактококк в дополнение к диагностическим признакам, приведенным в табл. 3.3, отличается от двух других подвидов морфоло­гически: 19,7% клеток сливочного лактококка объединены в короткие цепочки (по 3-5 клеток), 51,1% - в более длинные цепочки, а у молоч­ного и диацетильного лактококков только 10,2 и 6,3% соответственно объединены в короткие цепочки (до 5 клеток), а более длинных цепочек в их культурах вообще нет.

Сливочный лактококк отличается от молочного и диацетильного меньшей метаболической активностью и более низкой устойчивостью к внешним факторам, особенно к содержанию в среде NaCl и активности воды, а также к температуре (табл. 3.4). Его можно рассматривать как вариант молочного лактококка, наиболее адаптированный к молоку. Показательно, что в сыром молоке, отобранном на фермах, чаще встре­чается молочный, на заводе - сливочный лактококки. Это доказы­вает, что сливочный лактококк нашел свое место в нише молокоперера­батывающих предприятий.

Многие штаммы сливочного лактококка имеют максимальную тем­пературу для роста в молоке ниже 40° С (35-39° С). Так, из 9 штаммов сливочного лактококка ни один не дал заметного роста при 40° С и только один размножался при 39° С . Повышение температу­ры инкубации с 28-31° С до 35,6° С увеличило продолжительность вре­мени генерации у трех штаммов сливочного лактококка в 5,1-5,3 раза, у двух - в 2,6-2,9 раза, еще у двух - в 1,7-1,9 раза, в то время как у штам­мов молочного лактококка - только в 1,2 раза. Штаммы сливочного лак­тококка более вариабельны по отношению к максимальной температуре для роста, чем штаммы молочного лактококка: некоторые из них хорошо растут при 38° С, другие растут очень медленно при температурах выше 36° С. В молоке с добавлением 0,5-1,0% дрожжевого экстракта многие штаммы сливочного лактококка росли при 37,5° С с такой же ско­ростью, как при 31,5° С, но только в течение первых двух часов, после чего их рост прекращался или шел с очень низкой скоростью. Это свидетельствует о потере сливочным лактококком при повышенных тем­пературах способности к синтезу какого-то фактора роста, содержащего­ся в небольших количествах в дрожжевом экстракте.

Максимальная температура для роста лактококков, по существу, оп­ределяет температуру II нагревания при производстве мелких сыров. За рубежом II нагревание при выработке этих сыров проводят при 35° С, т. е. температуре, достаточно благоприятной для кислотообразования и накоп­ления биомассы всех лактококков, в т. ч. Lx. cremoris. В России та­кая температура недостаточна для достижения необходимой степени синерезиса сычужного сгустка в производстве сыров в связи с невысоким содержанием казеина и высоким содержанием соматических клеток в мо­локе (гл. 2 и 7), поэтому ее повышают до 38-42° С. За рубежом такие температуры II нагревания применяют только при производстве Чеддера ускоренным способом. Они слишком высоки для Lc. cremoris и по­этому основу большинства российских заквасок для сыров с низкими тем­пературами II нагревания составляют два других подвида лактококков: Lc. lactis и Lc. diacetylactis, хотя и для многих штаммов этих подви­дов температуры 41-42° С выше максимальных для роста.

Австралийские ученые нашли, что выдержка микрофлоры мезо- фильных заквасок во время II нагревания при температурах до 43° С не отражается на ее последующей способности сбраживать углеводы в сы­ре. В другом опыте стерилизованное молоко инокулировали мезо- фильными заквасками и выдерживали 30 мин при 45, 47 и 50° С, затем выдерживали при 30° С с измерением кислотности после 2, 4, 9 и 24 ч выдержки. Кислотность в конце опыта во всех вариантах сравнялась, но скорость нарастания кислотности уменьшалась при повышении темпе­ратуры тепловой обработки. Отсутствия длительного торможения развития лактококков в сыре в результате применения повышенных температур II нагревания можно было ожидать, так как повышение тем­ператур по отношению к максимальным для роста лактококков невели­ко, а микроорганизмы обладают способностью репарировать сублеталь­ные повреждения. Однако для репарации повреждений требуется время, пропорциональное их тяжести, поэтому замедление развития лактокок­ков при высоких температурах II нагревания на какое-то время вполне естественно, а любое замедление роста лактококков во время выработки сыра оказывает крайне негативное влияние на показатели качества и безопасности сыров. Рамазанов с соавт. получили такую зависимость содержания молочнокислых бактерий (в основном молочного и диаце- тильного лактококков) в Голландском круглом сыре после прессования от температуры II нагревания:

В опытах Раманаускаса с соавт. свертывание молока при производ­стве твердых сыров с низкими температурами II нагревания проводили при 30, 32, 36, 40, 42 и 44° С с использованием мезофильных заквасок, в состав которых входили все три подвида Lc. lactis. Скорость накопления общего количества и количества ароматообразующих молочнокислых бактерий с увеличением температуры снижалась, а при 42-44° С отмеча­лось резкое торможение их развития. При температуре свертыва­ния 42° С количество ароматообразующих бактерий в зерне в конце об­работки было в 9, при 44° С - в 25 раз меньше, чем при 32° С.

Следует сказать, что только по скорости кислотообразования нельзя судить о влиянии субоптимальных факторов на развитие лактококков. При 32° С рост биомассы сливочного лактококка соответствует количе­ству образуемого им лактата. Повышение температуры, высокие концен­трации соли и Н⁺ разобщают эти процессы и могут полностью подавить размножение, не оказывая столь сильного влияния на кислотообразование. Полное прекращение размножения сливочного лакто­кокка при довольно высокой скорости кислотообразования наблюдается при концентрации соли больше 3%, температуре 38-40° С. Явление ра­зобщенности процессов размножения и кислотообразования при субмак­симальных температурах наблюдается и в культурах Lc. lactis (А. Гуд­ков, Г. Д. Перфильев, неопубликованные материалы). Некоторые считают, что при супероптимальных для лактококков температурах II нагревания часть клеток отдельных штаммов сливочного лактококка погибает. По-видимому, при повышенных температурах происходят про­грессирующие повреждения клеток, приводящие к расстройству их катаболитических и анаболитических функций, относительно независимых друг от друга, причем скорость нарушения анаболизма значительно вы­ше. Возможно, при повышенных температурах у чувствительных штам­мов инактивируются пермеазы, контролирующие транспорт аминокис­лот через клеточную мембрану.

Таким образом, анализ влияния близких к максимальным или не­много превышающих максимальные температур на рост и кислотообра­зующую активность лактококков показывает, что лучше всего темпера­туру во время выработки сыров с низкими температурами II нагревания поддерживать на уровне, не превышающем 36° С. При необходимости интенсифицировать синерезис температуру II нагревания можно повы­сить до 40° С, применив при этом закваску, в которой доминирующую роль играют штаммы молочного и диацетильного лактококков, макси­мальная температура для роста которых выше, чем для сливочного лаклактококка.

Методами экспериментальной селекции, например, часовой обработкой этилметансульфонатом при 25° С, из штаммов лактокок­ков, неспособных расти при 38^Ю° С, удается получить мутанты лактококков, способные образовывать кислоту при этих температурах. Особый интерес вызывают мутанты, быстро лизирующиеся при температуре 40° С, и таким образом высвобождающие внутрикле­точные энзимы в самом начале созревания, когда условия для биохимических процессов в сыре наиболее благоприятны.

В твердых сырах с высокими и средними температурами II нагревания (48-57° С) боль­шинство клеток мезофильных лактококков погибает во время II нагревания. В опытах Каган и Чистя­ковой при производстве сыра Советский во время II нагревания (52-55° С, 20-30 мин) количество лактококков снизилось с 3-10⁷до 3,7-10³/г, или в 811 раз. Однако, гибель большей части клеток лактококков во время II нагревания при производстве крупных сычужных сыров - еще недостаточный повод для их исключения из состава заквасок для произ­водства сыров этой группы, так как они производят значительное количество L(+)-молочной кислоты до своей гибели. Исключение их из состава заквасок может изменить соотношение между L(+)- и DL-mo- лочной кислотой, образуемой некоторыми термофильными лактобацил­лами, что, в свою очередь, может отразиться на развитии пропионово- кислых бактерий, которые утилизируют L(+)лактат быстрее, чем Б(-)-лактат. Термофильный стрептококк, который образует правовра­щающую молочную кислоту, не может служить равноценной заменой лактококкам, так как обладает высокой чувствительностью к наличию в молоке ингибирующих веществ и к бактериофагам, а также несколько медленнее растет при температурах свертывания молока сычужным энзимом. Замена лактококков закваски для крупных сыров тер­мофильным стрептококком приводит к увеличению содержания галак­тозы в сыре (лактококки сбраживают лактозу без накопления в среде галактозы, а термофильный стрептококк ферментацию лактозы начинает с ее гидролиза в среде на глюкозу и галактозу, утилизация галактозы идет после сбраживания глюкозы). Большое количество галакто­зы, остающейся в сыре, может изменить соотношение между мезофильными и термофильными молочнокислыми бактериями в сыре и повлиять на его качество. В то же время слишком интенсивное развитие лакто­кокков может привести к появлению горечи в крупных сырах, которая не встречается при правильном соотношении между лактококками и термофильным стрептококком.

На супероптимальные для лактококков температуры по-разному реагируют штаммы, образующие и не образующие горечь в сырах: «горькие» штаммы сливочного лактококка хорошо росли и быстро обра­зовывали кислоту при 31,5 и 37,5° С, а «негорькие» штаммы при 37,5° С прекращали рост через 2 ч, продолжая образовывать молочную кислоту. Добавление в молоко 1% дрожжевого экстракта не сти­мулировало размножения негорьких штаммов при повышенных темпе­ратурах. Явление разобщенности процессов роста и кислотообразования следует использовать для отбора в состав мезофильных заквасок для производства сыров штаммов лактококков, образующих кислоту, но прекращающих размножение при повышенных температурах II нагрева­ния, что может уменьшить вероятность появления горечи в сырах и по­высит устойчивость закваски к бактериофагу (репродукция бактериофа­гов происходит только в размножающихся культурах).

Изучено развитие лактококков и лейконостоков в пастеризованном (74-75° С) молоке с сычужным порошком при температурном режиме, имитирующем температурный режим выработки твердых сыров с низкой температурой II нагревания. Молоко после инокуляции 0,5% ис­следуемой культуры выдерживали 2 ч при 30-32° С, нагревали 10-15 мин до 40-41° С, выдерживали при этой температуре 2 ч, после чего оставля­ли на 5 ч при комнатной температуре, а затем инкубировали при 8-10° С в течении 7 сут. Кислотообразование культурами при этом режиме пока­зано в табл. 3.6. Приведенные данные свидетельствуют о более высокой кислотобразующей активности молочного и активного диацетильного лактококков по сравнению со сливочным в первые 9 ч инкубации при комбинированном режиме: через 4 ч инкубации (после выдержки при температурах II нагревания) кислотность молока на 3-4° Т повысили 39,6 и 48,4% штаммов первых двух подвидов соответственно и только 14,1% сливочного лактококка; после 9 ч инкубации кислотность повысилась более чем на 31° Т в 47,2% культур молочного, 35,4% активного диаце­тильного и 7,1% сливочного лактококков. Положение изменилось после 7-суточной выдержки при 8-10° С: в конце этого периода только в 5,7% культур молочного лактококка кислотность повысилась на 61-80° Т по сравнению с 41,2% культур сливочного лактококка. Авторы работы не объясняют этот феномен. Возможно, при этих температурах степень ге­теротрофное процесса сбраживания лактозы у сливочного лактококка ниже, а выход кислоты выше, чем у молочного и, особенно, диацетильно­го лактококка. Если это так, то свидетельствует о преимуществах сливоч­ного лактококка, так как продукты гетероферментативного брожения участвуют в синтезе соединений, вызывающих пороки в сырах (гл. 12).

Определенный интерес для сыроделия представляет минимальная температура для роста лактококков, равная для всех видов 7-10° С. При 8° С размножались 50% штаммов молочного лактококка, выделенных из Голландского сыра, при этом 20% повышали кислот­ность молока при этой температуре за 7 сут на 30-60° Т, 20% - на 61-80° Т, 10% - более чем на 80 °Т; 67,7% штаммов сливочного лакто­кокка росли при 8° С. Оптимальные температуры для созревания большинства твердых сыров выше 10° С, следовательно, температуры созревания сыра не препятствуют росту лактококков.

Из пастеризованного молока были выделены штаммы молочного лактококка, способные расти на агаре из гидролизованного молока при 5° С. Интересно, что в сыром молоке такие штаммы не были об­наружены. Вероятно, они попали в пастеризованное молоко после пасте­ризации, а следовательно, местом обитания таких штаммов является сам завод. Позднее о выделении из пастеризованного молока психротрофных вариантов всех трех подвидов лактококков сообщили и другие авторы. Интересно, что эти штаммы проявляли более высокую протео­литическую активность при 5° С, чем при 20° С. Их кислотообразующая активность при 5° С была очень низкой. Появились предложения вклю­чить такие штаммы в состав мезофильных заквасок для сыра и снизить температуру созревания мелких сычужных сыров, что могло бы ограни­чить возможности роста технически вредной поверхностной микрофло­ры. Однако снижение температуры резко замедляет созревание сыра, а также гибель патогенной и условно патогенной микрофлоры, полной гарантии отсутствия которой в сыре на начальных этапах созревания при современном способе производства дать нельзя. Во время созрева­ния большинство этой микрофлоры погибает, поэтому в США разрешает­ся вырабатывать сыры из непастеризованного молока с низкой бактериаль­ной обсемененностью, если они созревают при определенных темпера­турах не менее 60 сут. При низких температурах созревания скорость отмирания патогенной микрофлоры резко снижается.

Психротрофные лактококки могут найти применение при созрева­нии при низких температурах пастеризованного молока, предотвра­щающем репарацию сублетальных повреждений клеток посторонней микрофлоры, полученных в результате пастеризации, а следовательно, их реактивацию и размножение во время созревания.

Для молочного лактококка обычно характерна меньшая продолжи­тельность фазы задержки роста и более высокая скорость кислотообразования в молоке, чем у сливочного лактококка. Так, в мо­локе с сычужным порошком при посевной дозе 0,5% при 30-32° С не дали прироста кислотности за 2 ч 30% штаммов молочного и 54% сли­вочного лактококков. Количество же штаммов, повысивших за это время кислотность молока на 2° Т и более, у первого подвида равнялось 23, у второго - 14%. При 3 %-ной посевной дозе прирост кислотности за пер­вые 6 ч инкубации при 30-32° С у штаммов молочного лактококка со­ставил 14—21° Т, сливочного - 14-16° Т, диацетильного - 10-20° Т. От стартовой скорости развития лактококков при производстве сыра во многом зависит качество продукта, так как во время выработки сыра в сырной ванне условия для их размножения оптимальны и, если они не будут использованы лактококками в максимальной степени, то значительно больше лактозы будет сброжено посторонней микрофлорой или лактококками во время созревания сыра, когда лактоза сбраживается ими по гетероферментативному пути из-за низкой температуры. Образо­вание в сырах больших количеств продуктов гегероферментативного брожения усиливает опасность появления многих пороков сыра.

Скорость кислотообразования (моль молочной кислоты/ч) в молоке в условиях, моделирующих временные и температурные режимы выра­ботки и прессования российских сыров с низкими температурами II на­гревания, у штаммов молочного и диацетильного (активного) лактокок­ков (90,6% изученных штаммов) находилась в интервале 5,5-11,5, у штаммов сливочного лактококка - 1,0-5,5, у слабых штаммов диаце­тильного лактококка 1,05-3,50. Эти различия для сливочного лак­тококка обусловлены прежде всего его отрицательной реакцией на тем­пературы нагревания (39-41° С), а у слабых штаммов диацетильного лактококка, вероятно, недостаточной протеолитической активностью и низким содержанием в молоке низкомолекулярных азотистых соедине­ний, необходимых для роста лактококков. Внесение в восстановленное молоко для выработки сыра 0,1% дрожжевого автолизата сделало воз­можным выработать сыр на «медленных» штаммах лактококков, при этом выход сыра увеличился. Объяснить увеличение выхода можно тем, что «медленные» штаммы лактококков обладают низкой протеоли­тической активностью в молоке, и поэтому при их использовании в каче­стве закваски потери белка с сывороткой ниже, чем при использовании быстрорастущих в молоке штаммов лактобактерий, которые обладают высокой протеолитической активностью в молоке. Обогащение молока дрожжевым экстрактом увеличило скорости размножения и кислотооб- разования «медленными» штаммами лактококков. Как указывалось вы­ше, лактококки на начальных этапах роста в молоке, по крайней мере в течение первых 2-3 генераций, не могут расщеплять казеин и поэтому нуждаются в низкомолекулярных пептидах или/и свободных аминокис­лотах, содержание которых в молоке может быть недостаточным для полного удовлетворения потребностей, особенно сливочного и слабого диацетильного лактококков (разд. 3.2.3). Поэтому добавле­ние в молоко низкомолекулярных азотистых соединений стимулирует развитие и «быстрых» лактококков. При совместном развитии в молоке большинство штаммов сливочного и молочного лактококков, исключая низинобразующие, стимулируют рост друг друга и других видов лакто- кобактерий с низкой скоростью роста в молоке.

Сливочный лакто кокк менее устойчив к соли. Отсут­ствие роста его в бульоне с 4% NaCl является диагностическим призна­ком (табл. 3.4), так как два других подвида лактококков растут в среде с 5,0-5,5% соли. Имеются данные о способности сливочного лактококка образовывать кислоту, но не размножаться при содержании в среде бо­лее 4% соли.

Более точным показателем устойчивости микроорганизмов к соли является минимальная активность воды для роста. Этот показатель за­висит от концентрации и химического состава всех растворенных в вод­ной фазе веществ. Минимальная активность воды для роста молочного лактококка равна 0,955, а для сливочного лактококка - 0,975, что соот­ветствует активности воды в сыре Российский после прессования с со­держанием 42-44% влаги и соответственно 3,5 и 2,0% соли. В табл. 3.4. приведены значения минимальной активности воды для роста лактокок­ков, полученные в питательных средах с NaCl. В средах с использова­нием в качестве водосвязывающего вещества глицерина они значитель­но ниже (0,924 для молочного лактококка). Следовательно, соль инги­бирует рост лактококков не только за счет связывания воды в среде. Особого значения устойчивость к соли лактококков в производстве отечесгвенных твердых сыров не имеет, так как рост их в сыре заканчивает­ся намного раньше, чем соль распределится по всей массе головки сыра. Исключением является сыр Российский с полной посолкой в зерне, производство которого в настоящее время запрещено именно в связи с ингибированием солью роста лактококков. Есть данные, что 1-2% NaCI в среде стимулируют кислотообразование диацетильного лактококка.

Чрезвычайно важна устойчивость лактококков к соли в производ­стве Чеддера, который равномерно просаливается в конце выработки перед прессованием. Сливочный стрептококк сбраживал лактозу в этом сыре, если концентрация соли в водной фазе сыра не превышала 4% (около 1,6% в сыре). В сырах с 6% соли в водной фазе лактоза очень долго оставалась несброженной при использовании для выработки за­кваски из сливочного лактококка, и сбраживали ее не микроорганизмы закваски, а педиококки.

Молочный лактококк медленнее вымирает в сухих и заморожен­ных заквасках во время хранения, менее чувствителен к перекиси водорода, хотя этот показатель в большой степени зависит от штамма. Некоторые виды и штаммы молочнокислых палочек могут образовы­вать в среде такое количество перекиси водорода, которое существенно снижает активность сливочного лактококка при совместном его росте с лактобациллами. Устойчивость сливочного и молочного лактококков к Н₂0₂ можно повысить их выдержкой в присутствии сублетальных кон­центраций перекиси или часовой экспозицией в аэробных условиях. Это очень важно с точки зрения разработки биологических ме­тодов борьбы с посторонней микрофлорой (разд. 3.2.3).

Лактококки отличаются довольно высокой устойчивостью к кислот­ности среды. Минимальный pH для них равен 4,2-Л,~4, предельная титруе­мая кислотность в молоке 100-120° Т. Однако эти преде­лы установлены по прекращению образования кислоты лактококками, а размножение их прекращается раньше, при pH ~4,5. Выдержка лакто­кокков в среде с pH меньше 5 вызывает существенные изменения в клет­ках и увеличивает продолжительность фазы задержки роста при после­дующих пересадках [628]. Максимальную активность при пересадках по­казывают культуры при pH 5,0, когда количество жизнеспособных клеток достигает достаточно высокого уровня, а их активность еще не начала снижаться. Оптимальный pH для роста лактококков в молоке и бульоне 6,3-6,5, скорость размножения существенно снижается при pH ниже 6 или выше 7. Предельная кислотность в молоке зависит от подвида и штамма: для 16 штаммов лактококков, исследованных по этому показателю в отде­ле микробиологии ВНИИМС, она составила от 93 (штаммы диацетильного лактококка с низкой скоростью кислотообразования) до 115° Т, мини­мальный pH изменялся от 4,46 до 4,22. У большинства штаммов диацетильного лактококка с низкой скоростью кислотообразования в мо­локе предельная кислотность в молоке была меньше 80° Т.

В оптимальных по составу питательных средах главным фактором, лимитирующим рост сливочного лактококка, является активная кислот­ность. Так, урожай клеток лактококков в оптимальной среде с контроли­руемым pH достигает (З-б)ТО¹⁰ /мл (7-8 мг сухого веса/мл), а в этой же среде с неконтролируемым pH он равен 1,5 107мл или ~ 0,5 мг сухого ве­са/мл. Сухой вес сливочного лактококка в pH-стате при pH 6,3 и прочих оптимальных условиях достигает 10 мг/мл. Оптимальный для скорости роста в полноценной среде pH 6,3-6,9, при концентрации лактозы 37 г/л. Выходы кислоты и биомассы не зависят от pH в интервале 5,6-7,5 и концентрации лактозы 48,5-38 г/л. Сыры отличаются довольно высо­кой буферностью, поэтому представляет интерес действие недиссоцииро- ванной молочной кислоты на развитие лактококков. Предельная концен­трация лактатов, при которой возможен их рост при прочих оптимальных условиях, в зависимости от штамма равна 5,0-7,0%. Сливоч­ный лактококк не всегда рос в бульоне с содержанием лактатов больше 4%, другие подвиды росли при более высокой концентрации лактатов. Торможение развития лактококков и лейконостоков в питательной среде при прочих оптимальных условиях, по наблюдениям Перфильева и Рогова (1989), происходит при содержании больше 2% лактатов.

В сырах с 40% влаги содержание молочной кислоты в водной фазе, равное 5%, соответствует 2,1% кислоты в сыре. В зарубежных сырах гол­ландской группы, Чеддере содержание лактатов примерно равно 1,5-1,8%, в отечественных - 1,5-2,1%, в сырах с колющейся консистенцией со­держание кислоты может достигать 2,4-2,7%, или примерно 5,6-6,3% в водной фазе, в Швейцарском сыре - 1,35%. Более высокое содержание кислоты в отечественных сырах обусловлено меньшим количеством воды, добавляемой в сыворотку во время их вы­работки. Таким образом, содержание молочной кислоты в сырах с низ­кой температурой II нагревания, особенно отечественного производст­ва, находится на уровне, при котором рост лактококков невозможен. При этом нужно учесть, что температура созревания сыров также не­благоприятна для их роста. Показано, что рост и кислотообразование микрофлоры мезофильных заквасок в значительной степени тормозится уже при pH меньше 5,7 и содержании лактатов больше 1%.

Таким образом, напрашивается вывод, что рост лактококков в сы­рах прекращается не после того, как в них перестанет обнаруживаться лактоза, как обычно считается, а раньше. Другими словами, лактококки не всегда могут сбродить всю лактозу, остающуюся в сырной массе. В экстракте трехмесячного сыра Манчего лактококки не росли даже после обогащения его дрожжевым экстрактом и лактозой и внесении в экс­тракт каталазы для дезактивации токсичных радикалов 0₂, которые мог­ли образоваться во время созревания сыра. Скорее всего рост лактококков в экстрактах был ингибирован или подавлен комбинацией низкого pH, высокой концентрации недиссоциированной кислоты, а в сырах также низкими температурами созревания. Каждый этот фактор в сыре недостаточен для подавления развития лактококков, а при совме­стном действии они усиливают действие друг друга.

Увеличение биомассы лактобацилл прекращается позднее, чем у лактококков, из-за более высокой их устойчивости к кислоте. Добавление в экстракт сыра лактозы возобновляет накопление биомассы Lbc. casei, следовательно, рост ее в сыре прекратился в связи с исчерпанием источ­ников энергии.

Количество остающейся в сырной массе лактозы и молочной ки­слоты зависит от технологии сыра, в частности от степени разбавления сыворотки водой, скорости молочнокислого процесса в сырной ванне. Регулируя содержание этих компонентов в сырах после прессования, мы будем в определенной степени регулировать и уровень развития в сырах молочнокислых бактерий незаквасочного происхождения, в част­ности лактобацилл, педиококков, энтерококков.

После достижения максимума содержание жизнеспособных клеток лактококков в сырах начинает снижаться. Однако это снижение нельзя считать достаточным доказательством прекращения размножения лак­тококков, поскольку процесс размножения может идти параллельно с процессом отмирания клеток.

Лактококки не используют кислород в энергетическом обмене, но связывают большую часть растворенного в среде кислорода и тем са­мым снижают окислительно-восстановительный потенциал и создают условия, необходимые для своего размножения, поскольку несвязанный кислород ингибирует их развитие, особенно на лактозе. Справедливости ради нужно отметить, что небольшие концен­трации кислорода в среде могут стимулировать рост лактококков: рост сливочного и молочного лактококков при 20° С и pH 5,05-5,45 в атмо­сфере азота в присутствии 0,5% 0₂ был на 17,5% выше, чем в отсутст­вие 0₂. Лактококки в молоке и синтетических средах обладают абсолютной потребностью в С0₂.

При посевной дозе 1% и температуре 30° С лактококки за 8-10 ч инкубации поглощали от 30,6% (активный диацетильный лактококк) до 77,2% (сливочный лактококк) растворенного в молоке кислорода, его концентрация снижалась до 2,5-5,9 мкг/мл. Поглощение кислорода со­провождается накоплением в молоке 0,03-0,19 ммоль Н₂0₂, которая затем расщепляется без образования кислорода с помощью NADH-перок- сидазы. За короткий срок окислительно-восстановительный потенциал в культурах лактококков снижался до -(250-410) мВ. Поглощение кислорода и снижение Eh лактококками играет большую роль в сыроделии, так как это создает необходимые условия для биохи­мических процессов, лежащих в основе созревания сыра, и делает не­возможным размножение строгих аэробов в сырной массе.

Молочный лактококк широко распространен в природе благодаря высокой метаболитической активности и устойчивости к внешним фак­торам, что облегчает пополнение коллекции производственных штам­мов лактококков.

Сгусток молока, образованный молочным лактококком, обладает более высокой синеретической способностью, чем образованный сли­вочным лактококком. В опытах Сухоцкене сгустки с очень хорошей, хорошей и удовлетворительной синеретической способностью давали соответственно 44, 50 и 6% штаммов молочного и 8, 58 и 34% штаммов сливочного лактококка.

Сгусток, образованный сычужным энзимом в кооперации со сливоч­ным лактококком, медленнее отделяет сыворотку, что замедляет обсушку зерна и увеличивает влажность и выход сыра, ускоряет его созревание и улучшает консистенцию, но также может быть причиной более интенсив­ного роста посторонней микрофлоры и излишне кислого вкуса сыра.

Одной из причин появления горечи в сырах могут быть специфиче­ские особенности расщепления казеина входящими в закваску штаммами молочнокислых бактерий. В табл. 3.7. показана частота обнаружения штаммов лакококков и лейконостоков, образующих горечь в молоке. По частоте обнаружения штаммов, способных накапливать горькие продукты в молоке с сычужным энзимом и мелом, лактококки располагались в сле­дующем порядке: молочный > диацетильный активный > сливочный > диаце- тильный слабый. Штаммы, не дающие горечь в молоке, среди штаммов сливочного лактококка встречались в 7,8 раза чаще, чем среди штаммов молочного лактококка. Как правило, штаммы молочного лактококка, обла­дающие достаточно высокими скоростями роста и кислотообразования при повышенных температурах, образовывали среднюю и сильную горечь в молоке после 7 сут инкубации при 30° С (образование горечи в молоке коррелирует с ее образованием в сыре). Штаммы с низкой скоростью ки­слотообразования в молоке чаще всего не дают горечи, в закваски для про­изводства сыров целесообразно вносить комбинации «горьких» и «негорь­ких» штаммов, которые обеспечивают достаточную скорость кислотообра­зования и не дают в сырах горечи. Таким образом, в отношении образова­ния горьких продуктов сливочный лактококк имеет несомненное преиму­щество перед молочным, что подтверждается многими авторами.

Имеются сообщения о более высокой специфичности сливочного лактококка к бактериофагам. Однако исследования видовой и штаммовой специфичности бактериофагов к микрофлоре мезофильных заквасок, выделенных на 13 сыродельных заводах бывшего СССР, рас­положенных в различных географических зонах, это не подтвердили (табл. 3.8). Были обнаружены бактериофаги к большинству штаммов лактококков, использованных в качестве тест-культур в этих исследованиях; частота обнаруживаемости бактериофагов по отноше­нию к различным подвидам лактококков была почти одинаковой. Бак­териофаги к двум штаммам молочного (5%) и двум штаммам сливочно­го (8%) лактококков не были найдены.

Некоторые штаммы молочного лактококка синтезируют антибиотик низин, обладающий достаточно широким спектром антибактериального действия по отношению к посторонней микрофлоре сыров. К сожалению, эти штаммы пока не нашли широкого применения в сыроде­лии, поскольку они обладают низкой кислотообразующей активностью и высокой чувствительностью к бактериофагам, а сам низин ингибирует рост активных кислотообразователей закваски и пропионовокислых бактерий.

Штаммы сливочного и молочного лактококков, образующие дру­гой антибиотик - диплококкцин (типа бактериоцинов), также не нашли достаточно широкого применения из-за узкого спектра действия этого антибиотика, направленного в основном на другие виды и штаммы мо­лочнокислых бактерий. Некоторые штаммы лактококков образуют бактериоцины с широким спектром действия против грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Некоторые штаммы Lc. lactis образуют в сырах фруктовый и со­лодовый привкус, сливочный лактококк такой способностью не обла­дает.

Из анализа недостатков и достоинств молочного и сливочного лак­тококков нельзя сделать однозначный вывод о том, какой подвид следует включать в закваски для сыров с низкими температурами II нагревания.

Выработки сыров, проведенные в экспериментальном цехе ВНИИМС, показали, что сыры высокого качества можно вырабатывать на угличской закваске, в которой доминируют молочный и диацетильный лактококки, и зарубежных заквасках, в которых лактококки представлены сливочным и диацетильным лактококками с низкой кислотообразующей активно­стью, хотя в некоторых случаях сыры с зарубежными заквасками оцени­вались немного выше. В производственных условиях, наоборот, сыры с заквасками, в которых преобладали штаммы молочного лактококка, как правило, оценивались выше. Закваски, в которых кислотообразующие микроорганизмы представлены сливочным лактококком, требуют более высокого качества молока и санитарно-гигиенического уровня производ­ства и соответствующей корректировки технологии. Некоторые авторы считают, что лучшие результаты дает закваска, в состав которой входят сливочный и молочный лактококки. Этот принцип соблюдается в подборе микрофлоры угличских заквасок, но из-за различных скоростей роста сливочного, молочного и диацетильного лактококков, особенно во время II нагревания и какое-то время после него, в сырах, выработанных на этих заквасках, доминируют последние два подвида. Litnsowtin считает целесообразным использовать в составе закваски для производства сыра Чеддер сливочный и молочный лактококки в отношении 2:1 [648]. Про­должительность выработки сыра Чеддер с комбинированными культура­ми этих подвидов сокращалась на 7,5-12,5%.