Общие понятия

Энзимы микрофлоры лактококковых заквасок являются главным фактором созревания сыров с низкими температурами II нагревания. Общее количество этих энзимов пропорционально биомассе лактокок­ков, накопленной в сыре. Эффективность и направленность их действия зависит от физико-химических условий сырной массы, регулируемых технологией сыра, видового и штаммового состава заквасок. Физико­химические условия сырной массы во время выработки и созревания сыра меняются, а следовательно, меняются и условия для действия эн­зимов, что создает большие трудности в управлении процессами фор­мирования органолептических показателей сыра.

В табл. 11.4 показана взаимосвязь между оценкой и изменениями содержания молочнокислых бактерий в Голландском сыре. В первую группу в этих исследованиях включены сыры высшего сорта, во вторую группу - первого сорта и в третью - несортовые. Отличительными чер­тами развития микрофлоры закваски в сырах 1 группы было сравни­тельно быстрое ее развитие в период выработки, достижение макси­мальной плотности популяции в 7-8 суточных сырах и снижение коли­чества жизнеспособных клеток, начиная с 15-20-суточного возраста. Если в сырах первой группы содержание клеток молочнокислых бакте­рий в конце прессования по отношению к их содержанию в смеси воз­росло в 86-94 раза, то в сырах второй группы - только в 35 раз, а мак­симальная плотность популяции достигалась через 8-11 сут. Еще более медленно шло нарастание биомассы в сырах третьей группы. Отношение действующих биомасс молочнокислых бактерий в сырах 1, 2 и 3 групп составили примерно 2:1,5:1,1. Замедление развития микрофлоры заква­сок в сырах второй и третьей групп уменьшило долю ее энзимов за счет увеличения доли энзимов посторонней микрофлоры. Следует сказать, что достаточно быстрое развитие микрофлоры закваски во время выра­ботки и прессования сыров - необходимое, но недостаточное условие для получения продукта высокого качества. Слишком быстрое развитие микрофлоры закваски в этот период (увеличение численности молочно­кислых бактерий в сырах после прессования более чем в 160 раз по сравнению с ее содержанием в смеси) также нежелательно, что будет показано ниже. По Перфильеву (1998), в мелких сырах после прессова­ния при использовании угличских заквасок должно содержаться (0,8-1,0) ·10⁹ КОЕ/г молочнокислых бактерий.

Протеолитические энзимы

Необходимый для биосинтеза белков материал лактобактерии по­лучают в виде свободных аминокислот (САК) или пептидов с числом аминокислотных остатков не более 7 и молекулярной массой меньше 1500, которые способны проходить через клеточную стенку и мембрану против градиента концентрации. Затраты энергии на перенос ами­нокислот в составе низкомолекулярных пептидов меньше, чем на пере­нос свободных аминокислот, поэтому размножение лактококков в сре­дах с низкомолекулярными пептидами идет более интенсивно. Однако есть штаммы сливочного лактококка, которые неспособны расти на сре­дах, единственным источником азота в которых являются низкомолеку­лярные пептиды. Пул низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот в парном молоке удовлетворяет потребности лактококков менее чем на 20%, поэтому гидролиз части казеина свежего молока до этих соединений - необходимое условие для быстрого развития в нем лактококков.

Для получения источников азота в доступной форме лактококки обла­дают набором протеолитических энзимов - от протеиназ до амино-, кар- бокси- и дипептидаз. На рис. 3.4 показана схема протеоли­тической системы и транспортировки низкомолекулярных пептидов и сво­бодных аминокислот внутрь клетки у лактобактерий. Несмотря на наличие сложной протеолитической системы, молоко, инокулированное молочнокислыми бактериями, образует сгусток, который не показывает видимых признаков протеолиза независимо от продолжительности инкуба­ции. По-видимому, образующаяся при развитии лактобактерий кислота быстро подавляет активность их протеолитических энзимов в молоке.

Начальный этап расщепления казенное лактококками происходит при участии протеиназ, локализованных в клеточной стенке (протеиназы клеточной стенки). У лактококков обнаружено не менее трех протеиназ клеточной стенки, оптимальные температуры и pH ко­торых равняются 30° С и 5,4; 30° С и 5,8; 40° С и 6,5. Особенно чувствительны протеиназы лактококков к pH.

Ни один из штаммов лактококков не содержит все протеиназы од­новременно, что обусловливает различия между штаммами по протеоли­тической активности. Учитывая чувствительность к pH и температуре, протеиназы лактококков должны проявлять достаточно высокую казео- литическую активность во время выработки, но низкую - во время со­зревания твердых сыров. Для созревания сыра наиболее пригодны штаммы с оптимальной активностью протеиназы при pH 5,4. Показа­тельно, что сыры с низким pH, в частности сыры типа Чеддер, созревают очень медленно. Наименее пригодны для сыроделия штаммы, оптималь­ные температура и pH для действия протеиназ которых равны 40° С и 6,5, поскольку высокая протеолитическая активность микрофлоры заква­сок во время выработки может вызвать горечь в сыре и снизить его выход.

Изучение протеиназ клеточной стенки молочного и сливочного лактококков показало, что они расщепляют β-казеин с образованием пептидов, включающих фрагменты с горьким вкусом; изученные про­теиназы этих подвидов лактококков мало отличались друг от друга. Протеиназы клеточных стенок лактококков, в отличие от лакто­бацилл, не действуют на а-казеин; только 20-28% штаммов Lc. cremoris, выделенных из заквасок, расщепляли β-казеин.

Исследование расщепления белков пастеризованного молока лак­тококками при 30° С в течение 10 сут показало, что они образуют срав­нительно небольшое количество водорастворимого азота (16,5-19,8% от общего азота). Количество водорастворимого азота после 7-суточного выращивания молочного и диацетильного лактококков в пастеризован­ном молоке при 26° С составило 6,4-7,7%. Молочный лактококк обладал меньшей протеолитической активностью, чем сливочный и ди- ацетильный. Следует иметь в виду, что протеолитическая активность диацетильного лактококка в большой степени зависит от штамма (табл. 3.4).

Обычно штаммы Lc. cremoris с высокой кислотообразующей ак­тивностью имели также сравнительно высокую протеолитическую ак­тивность. Однако большинство авторов отрицает наличие тесной корреляции между протеолитической и кислотообразующей активно­стями лактококков.

Микрофлора лактококковых заквасок обладает по сравнению с мо­локосвертывающими энзимами более низкой активностью по отноше­нию к казеину, поэтому основная часть водорастворимого азота в мел­ких сырах образуется в результате действия молокосвертывающих эн­зимов. В отношении образования аминокислот и пептидов с низ­кой молекулярной массой наблюдается обратная картина. Активность лактококков по образованию аминного азота была выше, чем по гидро­лизу казеина: разрушенные ультразвуком клетки молочного лактококка при pH 7,0 и 30° С через 50 ч превратили в водорастворимый белок 12% казеина молока, 65,8% которого составлял растворимый в фосфорно­вольфрамовой кислоте азот свободных аминокислот.

Протеиназы, связанные с клеточной стенкой, имеют также лакто­бациллы и лейконостоки. Лактобациллы обычно образуют нейтральные протеиназы клеточной стенки, активные по отношению к α-,β- и æ-казеинам, но специфичность их действия существенно зависит от вида и штамма продуцента. В клеточной стенке Lbc. helveticus есть одна про- теиназа с оптимальными pH 7,5-8,0 и температурой 42° С, которая не гидролизует β-казеин и только частично гидролизует а₅-казеин. Протеиназы Lbc. lactis и Lbc. bulgaricus гидролизуют оба казеина. По другим данным, штаммы Lbc. helveticus, Lbc. bulgaricus, Lbc. lactis и Lbc. casei, выделенные из сывороточных заквасок для производства сы­ра Грана, сильно отличались по протеолитической активности. Lbc. helveticus обладала максимальной протеолитической активностью по отношению к а-казеину, но при этом слабо атаковала β казеин; Lbc. lactis атаковала только β-казеин, остальные два вида и некоторые штаммы Lbc. helveticus вообще очень слабо атаковали казеин. По результатам опытов Bottazzi, 80-90% штаммов термофильных лактобацилл, выделен­ные из сывороточных заквасок для производства крупных сыров, не об­ладали активностью к казеину. Morelli et al. показали, что низкая протеолитическая и кислотообразующая активность штаммов Lbc. he­lveticus связаны с потерей ими плазмиды 3,5 МД. Лактобациллы и термофильный стрептококк проявляют протеолитическую активность при температуре от 15 до 45° С.

Протеиназная активность лейконостоков низкая, что является при­чиной их медленного развития в молоке в чистых культурах.

Протеиназная активность термофильного стрептококка зависит от штамма. В обезжиренном молоке с мелом при выращивании штаммов термофильного стрептококка при оптимальной температуре доля a_s1ка­зеина за 48 ч снизилась с 30 до 26%, содержание аминного азота за 30 сут повысилось от 0,10 до 0,16%. Однако другие штаммы термо­фильного стрептококка, выделенные из сывороточных заквасок для производства сыра Грана, обладали выраженной протеолитической ак­тивностью к казеину только в присутствии реннина и протеиназ молока. Это можно объяснить тем, что они гидролизовали не нативные казенны, а крупные пептиды, образуемые из нативных белков реннином и протеиназами молока.

У лактококков и лактобацилл имеются внутриклеточные протеи- назы, локализованные в цитоплазме, основной функцией которых являет­ся синтез бактериального белка (в зависимости от условий среды протеиназы катализируют расщепление или биосинтез белков). Внутрикле­точные протеиназы принимают участие в созревании сыров после лизиса бактериальных клеток. Внутриклеточная протеиназа Lc. cremoris наиболее активно расщепляет а₅-казеины: количество гидролизованных α- и æ-казеинов, оцениваемое по содержанию сиаловых кислот, состави­ло соответственно: для внутриклеточной протеиназы Lc. cremoris - 69 и 9%, для реннина - 13 и 45%. Активность внутриклеточной протеи­назы лактоккоков у различных штаммов может различаться в 2,5 раза. Активность протеиназ лейконостоков ниже, чем лактококков.

Лактобактерии образуют большое количество пептидаз. Отдельные пептидазы выделяются в среду для расщепления высокомолекулярных пептидов до более мелких пептидов и свободных аминокислот, которые могут быть перенесены внутрь клетки. На клеточных стенках лактококков локализованы две пептидазы, одна из них гидролизует толь­ко трилейцин, вторая - широкий спектр ди- и трипептидов. У Lc. lac- tis и Lc. cremoris обнаружены также 3 внутриклеточные пептидазы, одна из которых гидролизовала трилейцин, две имели широкий спектр дейст­вия. Образование САК лактококками было одинаковым в интервале pH от 7,0 до 5,6; при 30° С оно шло быстрее, чем при 40° С. Протео­литическая активность Lc. diacetylactis выше, чем Lc. cremoris, Lbc. helveticus - выше, чем лактококков. В сырах более полное рас­щепление казеина наблюдали при использовании в качестве лактококковой закваски диацетильного лактококка. Закваски из смеси подви­дов лактококков обладают более сильной протеолитической активностью, чем закваски на чистых культурах Lc. cremoris.

Самой высокой аминопептидазной, дипептидазной и протеиназной активностью обладают штаммы Lbc. helveticus, самой высокой β-галакгози- дазной активностью - Lbc. bulgaricus. Включение болгарской палочки в закваски для производства крупных сыров в дозах 0,5-1000 мл/200 кг молока стимулировало образование пролина; в больших количествах она угнетала рост про пионовокислых бактерий.

Протеолитическая активность Lbc. casei по отношению к а_S ка­зеину в совместных культурах с лактококками была в 5,8 раза выше, чем в чистой культуре, по отношению к β-казеину она не изменилась. У штаммов термофильного стрептококка среди внутриклеточных энзимов обнаружены лейцинаминопептидаза, пролилдипептидазы, эн­допептидаза. Внутриклеточные энзимы термофильного стрепто­кокка гидролизовали β- и æ-казеины.

Внутриклеточные пептидазы высвобождаются в результате лизиса бактериальных клеток и участвуют в созревании сыров. Хотя оптималь­ный pH для пептидаз лежит в нейтральной или слабощелочной области, они сохраняют достаточную активность при pH мелких сыров.

Исследование протеолитической активности в гидролизованном мо­локе с реннетом лактококков, Lbc. helveticus и Prb. shermanii в соотноше­нии 3:1:0,1 (экзоферменты) и экстрактов из разрушенных ультразвуком клеток (эндоферменты) в этом же отношении выявило низкую активность экзоферментов и отсутствие активности эццоферментов при 10° С, увели­чение активности экзоферментов при повышении температуры до 22° С в 3,1 раза, активность эндоферментов при 22° С была такой же, как у экзо­ферментов. Повышение pH среды с 5,0 до 5,6 повысило активность экзоферментов в 10,4 раза, эндоферментов - в 9,2 раза.

Протеолитическая активность лактококков и лактобацилл в обез­жиренном молоке сильно ингибируется добавлением 6% соли.

Штаммы Lc. cremoris гидролизуют пептиды с разной скоростью, хотя в бесклеточных экстрактах скорость гидролиза примерно одинако­ва, что объясняется неодинаковыми скоростями транспорти­ровки пептидов в клетки у разных штаммов. Активность внутриклеточ­ных протеиназ и пептидаз сохраняется после тепловой обработки при 50° С в течение 2,5 ч.

Протеолитическая активность термофильных и мезофильных мо­лочнокислых бактерий в стерилизованном обезжиренном молоке с ней­трализацией образующейся кислоты мраморной крошкой при оптималь­ных температурах показана на рисунках 11.3; 11.4 и 11.5. Из изу­ченных культур наибольшей протеолитической активностью обладали Lbc. helveticus и Lbc. casei, наименьшей - термофильный стрептококк.

Степень гидролиза казеина обезжиренного молока с мелом и сы­чужным порошком через 10 сут культивирования термофильного стреп­тококка, Lbc. lactis и Lbc. helveticus в зависимости от вида и штамма варьировала от 9 до 37%; штаммы стрептококка гидролизовали не более 20% казеина с образованием продуктов с длинной цепью, лактобациллы характеризовались более глубоким гидролизом казеина.

Представляет интерес влияние молокосвертывающих энзимов на протеолитическую активность лактококков. В табл. 11.5 представлены результаты опытов Вязниковой и др. по изучению влияния молокосвер­тывающих энзимов на протеолитическую активность Lc. lactis в обез­жиренном молоке (время инкубации 10 сут, температура 30° С). Из этих данных видно, что в культурах лактококка в присутствии пеп­синов, по сравнению с их культурами в молоке без добавления энзимов, произошло снижение количества водорастворимого азота на 50,2—45,2% и свободных кислот на 53,4-63,8%, а количество небелкового азота воз­росло на 20,2—42,4%, в то время как в присутствии реннета увеличилось содержание всех фракций: водорастворимого азота - на 21, небелкового азота - на 13,9 и аминного - на 104,8%. В варианте с реннетом увеличе­ние количества водорастворимого и небелкового азота произошло в ре­зультате энзиматической реакции, а увеличение содержания аминного азота является результатом резкого повышения протеолитической ак­тивности лактококка в присутствии реннета. Пепсины в условиях опы­та, по-видимому, не проявили или проявили незначительную казеоли- тическую активность, а снижение содержания аминного азота говорит об использовании культурой низкомолекулярных пептидов и аминокис­лот для синтеза собственных белков.

Сычужный порошок по-разному влияет на протеолитическую ак­тивность различных подвидов лактококков. Лактококки атакуют параказеин и в отсутствие молокосвертывающих энзимов, даже после гибели клеток, что свидетельствует об участии в этом процессе эндоферментов.

Таким образом, лактобактерии обладают достаточной протеолити­ческой активностью для расщепления совместно с реннином казеинов до свободных аминокислот. Специфичность действия их протеолитиче­ских систем зависит от вида и штамма и значительно варьирует.

Лактобактерии обладают фосфомоноэстеразной активностью, которая является штаммовым признаком. Этот тип энзиматической активно­сти может иметь значение при расщеплении фосфопептидов, образующих­ся в сырах в процессе протеолиза и, возможно, причастных к образованию горечи. Роль фосфомоноэстераз лактобактерий в сырах не изучена.

Липолитическая активность

Липиды не являются источниками энергии для микрофлоры заква­сок, и наличие у нее очень слабой липолитической активности обуслов­лено ее биосинтетическими нуждами. Несмотря на слабую липолитическую активность микрофлоры заквасок, липолиз в созре­вающих сырах играет важную роль и осуществляется микрофлорой за­кваски в большинстве сыров. Небольшая липолитическая активность микрофлоры закваски компенсируется высокой концентрацией их кле­ток и продолжительным созреванием сыров, а также низким вкусовым порогом продуктов липолиза (табл. 11.15).

Исследована липолитическая активность Lbc. lactis (5 штаммов), лактобацилл (3 штамма), лейконостоков (3 штамма), пропионовокислых бактерий (3 штамма). Количество свободных жирных кислот (СЖК), образуемых в 10 %-ной эмульсии триглицерида масляной ки­слоты в течение часа при 37° С (мкМ/мг клеточной ДНК), у молочно­кислых палочек было ниже 1,0, у других видов - от 2,3 до 33. Ни один штамм не образовывал внеклеточной липазы. Таким образом, виды и штаммы лактобактерий сильно различались по интенсивности гидроли­за трибутирина. Наибольшая активность оказалась у Leuc. dextranicum, минимальная - у Lbc. acidophilus.

Содержание летучих СЖК (мл 0,01 н NaOH/50 г сгустка), образо­ванных в стерильном восстановленном молоке при 22 и 30° С за 18 ч равнялось: у Lc. cremoris 6,0 и 8,4; у Lc. diacetylactis - 22,5 и 22,7; Lc. lac­tis - 6,4 и 8,2. Комбинации сливочного лактококка с диацетильным или лейконостоками образовывали больше СЖК, чем его чистая куль­тура. Содержание летучих СЖК, образуемых культурами в обез­жиренном молоке в течение 18 ч при 37 и 42° С, равнялось: для St г. thermophilus - 5,0 и 7,3; для Lbc. casei - 6,5 и 4,5; для Lbc. helveticus - 4,8 и 2,5; для Lbc. bulgaricus - 23 и 26; для Lbc. plantarum - 6,8 и 7,4.

Yu et al. и Kamaly et al. обнаружили липазы у Lbc. casei, Lbc. hel­veticus, Lbc. plantarum, Lbc. acidophilus, Lc. lactis, лейконостоков, но не нашли у термофильного стрептококка, Lc. cremoris, Lbc. bulgaricus-, pH оптимальный для липаз лактобактерий - около 7,0, оптимальная темпе­ратура - 37° С. В то же время Гриневич и Ермаков выделили штаммы термофильного стрептококка с высокой липолитической ак­тивностью, a Kamaly et al. считают, что липолитическая актив­ность Lc. cremoris выше, чем Lc. lactis. Следовательно, липолити­ческая активность является штаммовым и видовым признаком. Штам­мы, культивируемые в молоке, обычно обладают более высокой липо­литической активностью. Штаммы с высокой липолитической активностью отличались от штаммов с низкой активностью более высо­кой способностью к кислотообразованию и образованию С0₂, повы­шенными редуцирующей и протеолитической активностями.

Гобетти и др. обнаружили эстеразную и липолитическую актив­ность у лактобацилл. Эстеразная активность термофильных па­лочек была выше, чем мезофильных, липолитическая активность по отношению к молочному жиру была наибольшей у Lbc. plantarum и Lbc. casei. Эстеразы у большинства видов только внутриклеточные.

Lbc. casei в присутствии Мезентерина в смесях с казеином образо­вывали изо- и н-валериановую, н-капроновую и н-каприловую кислоты; лактококковая закваска в этих же условиях образовывала больше уксус­ной, пропионовой, изо- и н-масляной кислот.

Уманский и Боровкова изучали липолитическую активность лак­тококков, термофильного стрептококка, термофильных лактобацилл и пропионовокислых бактерий, культивируемых в обезжиренном моло­ке в течение 7 сут. Липолитическую активность оценивали по увеличению содержания СЖК как высокую (прирост содержания СЖК 4%), среднюю (2,0-3,5%) и низкую (1,5%).

Образование летучих СЖК исследованными культурами в молоке коррелировало с их обра­зованием в Советском сыре, выработанном с заквасками из этих куль­тур; качество сыра было выше при использовании заквасок с высокой липолитической активностью.

Лактобактерии обладают фосфолипазной активностью (ФЛА). Вы­сокой ФЛА обладали 47% исследованных штаммов лейконостоков, средней - 77% штаммов диацетильного лактококка и 62% штаммов мо­лочного лактококка, 58% штаммов сливочного лактококка обладали низкой активностью. Фосфолипаза, гидролизуя оболочки жиро­вых шариков, обеспечивает доступность липидов для липаз лактобакте­рий и интенсифицирует липолиз. В сырах, выработанных с закваской с высокой ФЛА, повышается содержание СЖК с С₁₈, С₁₉ и С₂о- Сыр Кост­ромской лучшего качества получен при минимальной ФЛА и макси­мальной липолитической активности микрофлоры. В сырах с высокой ФЛА появляется горький и посторонний вкус.

Сбраживание лактозы

Считается, что созревание сыра начинается после окончания сбра­живания основной массы углеводов, которое в твердых сырах при нор­мальном ходе выработки соответствует окончанию посолки. При непра­вильном подборе микрофлоры закваски для крупных сыров, когда термо­фильный стрептококк и термофильные лактобациллы не сбраживают или медленно сбраживают галактозу, она может оставаться несброженной вплоть до помещения сыра в теплую камеру и служить источником энер­гии для посторонней микрофлоры. Задержка сбраживания галактозы при­водит к тому, что pH сыра под держивается на более высоком уровне, что также способствует развитию посторонней микрофлоры. Все это приво­дит к ухудшению органолептических показателей продукта, при этом степень ухудшения зависит от того, какая микрофлора сбродит галактозу. Такая же ситуация может возникнуть в мелких сырах при включении в состав их заквасок штаммов термофильных стрептококков, например, при производстве Чеддера по ускоренной технологии. Особенно опасно снижение активности заквасок под действием бактериофага.

Трансформация продуктов гидролиза компонентов молока и цитратов

Главные продукты гликолиза (молочная и уксусная кислоты, С0₂), протеолиза (низкомолекулярные пептиды, свободные аминокислоты) и липолиза (СЖК, спирты) формируют основной вкусовой фон сыров. Кро­ме этого, они являются предшественниками образования других вкусовых и ароматических веществ сыров, например, карбонильных соединений, имеющих низкий вкусовой порог и играющих определенную роль в фор­мировании вкусового букета сыров. Так, аминокислоты могут подвергать­ся дезаминированию, заключающемуся в отщеплении а-аминогруппы, с образованием различных кето-, окси- и карбоновых (пировиноградной, пропионовой, а-кетоглутаровой, янтарной, изомасляной, изовалерьяновой, яблочной и др.) кислот. Образующиеся при этом кетокислоты могут декарбоксилироваться до соответствующих альдегидов (изовалерьянового, изомасляного, ацетальдегида, фенилуксусного и др.). Альдегиды могут восстанавливаться в соответствующие спирты. Образующийся при деза­минировании аммиак идет на синтез амидов дикарбоновых кислот - глу­тамина и аспарагина. В результате декарбоксилирования аминокислот образуются соответствующие амины и СО₂- Схема катаболизма амино­кислот, по Hemme et al., приведена на рис. 11.6.

Образование вкусовых и ароматических веществ из продуктов гид­ролиза основных компонентов молока и цитратов происходит энзиматиче­ским и чисто химическим путем. Способность различных видов и штам­мов микрофлоры заквасок образовывать необходимые для этих реакций энзимы изучена совершенно недостаточно. Однако, тот факт, что сыры с низкими температурами II нагревания с типичным вкусом и ароматом в асептических условиях можно выработать, используя из микроорганизмов только лактококки, а крупные сыры - с использованием микрофлоры за­квасок и пропионовокислых бактерий, свиде­тельствует о способности микрофлоры заквасок образовывать весь ком­плекс энзимов, необходимых для синтеза вкусовых и ароматических ве­ществ сыра. Но часто сыры, вырабатываемые в асептических ваннах толь­ко с участием микрофлоры заквасок, имеют менее выраженный вкус, чем контрольные, вырабатываемые в открытой ванне. Это может быть следст­вием недостаточной способности микрофлоры заквасок или части ее штам­мов образовывать вкусовые и ароматические вещества.

Определенное значение в формировании органолептических показа­телей сычужных сыров, особенно с низкой температурой II нагревания, а также кисломолочных сыров имеет ферментация цитратов. Основные и промежуточные продукты ферментации цитратов принимают непосредст­венное участие в этом процессе и могут стать компонентами или предше­ственниками в образовании других веществ, влияющих на качество сыров.

В мезофильных заквасках для выработки сыров с низкими темпе­ратурами II нагревания цитраты сбраживают в присутствии ферменти­руемого углевода диацетильный лактококк или лейконостоки с образо­ванием диацетила, ацетоина, ацетата, 2,3-бутиленгликоля, С0₂. Энзимы, вовлекаемые в ферментацию цитрата, у диацетильного лактококка - конституционные, у лейконостоков - индуцибельные. Возможные пути метаболизма цитратов приведены Горбатовой. Диацетильный лактококк ферментирует цитраты с образованием диацетила и ацетоина с самого начала своего роста. Большинство штаммов этого подви­да образует больше ацетоина, чем диацетила, причем отношение содер­жания ацетоина к содержанию диацетила может достигать 43:1. Макси­мальное количество образуемого диацетильным лактококком в молоке ацетоина равно, по Cogan, 3 мМ (264 мг/кг), диацетила - 0,1 мМ (8,6 мг/кг). По данным Горбатовой, большинство штаммов диацетильного лак­тококка образует в молоке до 12 мг/кг диацетила (некоторые - до 50 мг/кг) и около 500 мг/кг ацетоина, лейконостоки - соответственно 5 и 85 мг/кг. Только штаммы с достаточно высокой способностью к синтезу ацетил-КоА и пониженной активностью ацетоиндегидразы синтезируют большие количества диацетила. Из лактозы диацетильный лактококк не образует диацетила, С0₂ и ацетоина.

Лейконостоки ассимилируют цитраты без образования диацетила и ацетоина при нейтральном pH и с образованием этих соединений при pH меньше 5,5. Оптимальный pH для синтеза диацетила равен 5,4. Добавление в среду небольшого количества глюкозы (5мМ) увеличивает скорость ферментации цитрата лактококками, но полностью подавляет синтез ацетоина. В отличие от диацетильного лактококка, лейконостоки образуют С0₂ не только из цитратов, но и из лактозы. Ферментация цитратов завершается во время выработки сыра, но если они на этом этапе не будут сброжены, то это влияет на последующее созревание сыра. Закваски с диацетильным лактококком быстрее ферментируют цитраты, чем закваски с лейконостоками, но образование первыми С0₂ зависят от действия бактериофага.

Промежуточным продуктом метаболизма цитратов является аце­тальдегид, который в заметных количествах может накапливаться в культурах диацетильного лактококка. Лейконостоки сами утилизируют ацетальдегид. Высокое содержание ацетальдегида может быть причи­ной образования «зеленого» («резкого») привкуса в ферментированных молочных продуктах. В хороших заквасках отношение коли­чества диацетила к количеству ацетальдегида должно быть не меньше 4:1. Часть ацетальдегида микрофлорой закваски трансформирует­ся в этанол, который сам по себе не влияет на вкус и аромат сыра, но, вступая в реакции с СЖК, может вызвать пороки сыров. Больше всего спирта образуется в культурах лейконостоков.

Выделенные из заквасок штаммы лактококков образовывали неоди­наковое количество карбонильных соединений (мкг/кг): Lc. cremoris - 6,7-32,8; Lc. lactis - 17,0-46,7; Lc. diacetylactis 11,8-61,5; лейконостоки - 4,6.  Коллекционные штаммы cremoris образовывали 4,8-23,7, Lc. lactis - 9,5—46,7, Lc. diacetylactis 15,4—85,2 мкг/кг карбонильных соеди­нений. Чеддер, выработанный только со штаммами Lc. cremoris, получил наивысшую оценку, на втором месте стояли сыры, выработанные на за­квасках из штаммов лейконостоков, Lc. lactis и Lc. cremoris, в которых отмечен слабовыраженный «фруктовый» привкус, и минимальную оцен­ку получили сыры, выработанные на заквасках, в которых доминировали штаммы Lc. lactis и Lc. diacetylactis, из-за выраженного порока «фрукто­вый» вкус и аромат. Авторы считают, что закваски для Чеддера не долж­ны образовывать больше 20 мкг/кг карбонильных соединений.

Диацетильный лактококк образует ацетаты из аланина, глицина и се­рина, пропионаты из треонина, изобутираты из валина, изовалериаты из изолейцина и лейцина путем окислительного дезаминирования. Кар­боновые кислоты при наличии в сыре спиртов могут образовывать эфиры, придающие различные привкусы продукту. Многочисленные минорные компоненты метаболизма диацетильного лактококка и лейконостоков в низких концентрациях усиливают выраженность сырного вкуса мелких сыров, но при высоком их содержании они вызывают пороки продукта. В связи с этим их количество в заквасках и сырах должно контролироваться.

Lbc. bulgaricus, Lbc. helveticus и термофильный стрептококк не ути­лизируют цитраты; пируват - промежуточный продукт метаболизма углеводов и цитратов - используется болгарской палочкой и термо­фильным стрептококком.

Соединения, получаемые в результате биотрансформации продук­тов гликолиза, протеолиза и липолиза, могут как улучшать, так и ухуд­шать органолептические показатели сыров.