В будущем влияние биотехнологии на развитие химической про­мышленности будет определяться возможностью объединения принципов микробиологии, биохимии и химической технологии. Основной предпосылкой использования биологического катализа в химии является способность ферментов катализировать энан­тиомерно однозначные, стереохимически определенные реакции синтеза. Сегодня многие биологические процессы имеют такие характеристики, что с экономической точки зрения они не могут конкурировать с альтернативными химическими процессами. Принято считать, что для успешного осуществления крупно­масштабного биологического процесса, направленного на полу­чение некоего химического соединения, необходимо, чтобы при­бавочная стоимость продукта составляла 500—1000 долл, за тонну сверх стоимости сырья. Впрочем, все же существуют об­ласти, в которых применение биотехнологии обещает быть пер­спективным.

1. Тип реакции: прямые реакции окисления — восстановле­ния; использование обычных ферментов для проведения нетри­виальных реакций; белковая инженерия, нацеленная на изме­нение свойств катализатора; использование биокатализа в не­водных средах.
2. Конфигурация реактора: оптимизация биокатализаторов методами генной инженерии; выбор термостабильных систем или использование иммобилизованных конфигураций; разработ­ка дешевых, эффективных и общеудобных методов повторного использования кофактора; химическая инженерия в связи с про­блемами крупномасштабных биокаталитических систем (см. гл. 10).

• 4.4.1. Тип реакции

Реакции прямого окисления и оксигенации

Для преобразования сложных молекул в ходе органического синтеза используются оксидоредуктазы со строгой структурной, сайт- и стереоспецифичностью. В случае более широкой суб­стратной специфичности эти ферменты могут использоваться как катализаторы типовых реакций. В реакциях превращения спиртов в карбонилы находят применение нуклеотид-зависимые дегидрогеназы. Так, хорошо изучена алкогольдегидрогеназа из печени лошади: известны ее субстратная специфичность и сте­реохимия катализируемых реакций. Она атакует моно-, ди- и тетрациклические структуры. Построена модель ее активного центра, что позволяет прогнозировать активность этого фермен­та в отношении новых субстратов (см. разд. 4.1.1). Отметим, что ациклические вторичные спирты — плохой субстрат для это­го фермента, и если ставится задача осуществления синтеза на их основе, то целесообразно попытаться использовать другие дегидрогеназы (возможно, термофильные). Особенность окси­геназ состоит в их способности с высокой эффективностью и специфичностью включать кислород прямо в органические суб­страты; проведение такого прямого окисления неактивирован­ных органических субстратов — вечный камень преткновения в работе химика-синтетика. Реакции этого типа весьма разнооб­разны: они лежат в основе превращения алканов в спирты,, олефинов — в эпоксиды, сульфидов — в сульфоксиды; это реак­ции гидроксилирования ароматического кольца и его раскры­тия, а также окислительного деметилирования. Вполне возмож­но, что результаты глубокого изучения механизма активации а присоединение кислорода ферментами найдут применение для создания новых химических каталитических систем. В последнее время большое внимание уделялось использованию различных микробных оксигеназных систем в стереоспецифическом эпокси­окислении олефинов, в результате которого образуются «строи­тельные блоки» для синтеза полимеров. В микроорганизмах, окисляющих алканы и алкены, функционируют соответствую­щие монооксигеназы, но если исходить из нынешнего уровня технологии, то вряд ли хоть один процесс такого типа целесо­образен с экономической точки зрения. Поскольку оксигеназы нестабильны, принято считать, что эти процессы основаны на. биокаталитической активности целостных организмов. Предло­жен интересный альтернативный путь таких превращений: трех­ступенчатый ферментативный процесс с участием оксидаз (рис. 4.14). На первом этапе пиранозо-2-оксидаза из гриба-ба- зидиомицета катализирует образование перекиси водорода, ис­пользуя в качестве субстрата и источника энергии глюкозу. Далее галопероксидаза осуществляет реакцию перекиси водо­рода с алкеном и ионом какого-либо галогена с образованием алкенгалогидрина, от которого затем отщепляются атомы во­дорода и галогена и образуется соответствующий алкеноксид. Побочными продуктами процесса являются фруктоза и глюко­новая кислота. Стереоспецифичность окислительного катализа может использоваться в процессе синтеза диэпоксимономеров Для производства стереорегулярных полимеров. Мономерные единицы могут быть получены и путем превращений бензола под действием оксигеназ (гл. 5) или в результате двойного мо­ноокисления дифенила с образованием 4,4-дигидроксидифенила.

Использование обычных ферментов в нетривиальных
химических реакциях

В органическом синтезе ферменты применяются пока не очень широко в основном потому, что большинство интересующих ис­следователей веществ не являются их природными субстратами. Приходится специально изучать субстратную специфичность ферментов и условия протекания реакций, катализируемых наи­более освоенными промышленностью ферментами, с тем чтобы выяснить возможность вовлечения этих ферментов в каталитические процессы, интересующие химика-синтетика.

Рис. 4.14. Осуществляемое при участии микроорганизмов образование мономе­ров эпоксидов. А — прямое окисление с помощью монооксигеназ с широким спектром действия; Б — многоступенчатый процесс.

Так, промыш­ленностью производится фермент глюкозооксидаза, проявляю­щий высокую специфичность к донору электронов D-глюкозе. C другой стороны, специфичность его к акцепторам электронов гораздо шире, и природный акцептор, кислород, может быть заменен некоторыми синтетическими красителями. Это послу­жило основой для использования фермента в реакции восста­новления бензохинона в гидрохинон (рис. 4.15), причем реакция шла в три раза быстрее, чем в присутствии кислорода. Фермент может восстанавливать и другие хиноны (некоторые из них применяются в биологии и медицине), а также ряд ароматиче­ских нитросоединений. Было показано, что галактозооксидаза катализирует реакцию стереоспецифического превращения али­фатических спиртов (не сахаров) в альдегиды; так, глицерол превращается в S-(—)-глицеральдегид. Для разделения З-арил-акролеинов может быть использована ксантиноксидаза, так как она окисляет транс-изомер в сто раз быстрее, чем цис.

Рис. 4.15. Использование глюкозооксидазы и неприродных акцепторов электро­нов при химическом синтезе органических веществ. А — обычная реакция; Б — реакция с неприродным акцептором электронов.

Изменяя условия, в которых действует фермент, мы также можем существенно повлиять на химические особенности ката­лизируемой реакции. Так, пероксидаза из хрена гидроксилирует ароматические соединения с небольшой специфичностью и ма­лым выходом. Понижение температуры с 25 до O^oC подавляет побочные реакции, в результате чего в основном гидроксилиру­ются пара-замещенные ароматические соединения по мета-поло- жению и vice versa. Карбоксиэстераза из печени свиньи способ­на осуществлять как реакцию трансэтерификации, так и гидро­лиз эфиров, причем последняя реакция доминирует, поскольку плохо растворимые спирты не могут эффективно конкурировать с молекулами воды. Фермент можно заставить работать по пер­вому механизму, применив двухфазные системы, в которых фер­мент растворен в минимальном объеме воды, а основная орга­ническая среда образована спиртом и эфиром.

Инженерия белка

Белковая инженерия может быть основана на химической мо­дификации готового белка или на методах генетической инже­нерии, позволяющих получать модифицированные варианты природных белков.

Конструирование определенного биологического катализато­ра ведется с учетом как специфичности белка, так и каталити­ческой активности металлоорганического комплекса. Вот при­меры такой модификации, проведенной для получения «полусинтетических биоорганических комплексов». Миоглобин каша­лота способен связывать кислород, но не обладает биокаталитической активностью. В результате объединения этой биомо­лекулы с тремя электрон-переносящими комплексами, содержа­щими рутений, которые связываются с остатками гистидина на поверхности молекул белка, образуется комплекс, способный восстанавливать кислород при одновременном окислении ряда органических субстратов, например аскорбата, со скоростью почти такой же, как для природной аскорбатоксидазы. В прин­ципе белки можно модифицировать и другими способами. Рас­смотрим, например, папаин. Он относится к числу хорошо изу­ченных протеолитических ферментов, для которого определена трехмерная структура. Поблизости от остатка цистеина-25 на поверхности белковой молекулы располагается протяженный желобок, в котором протекает реакция протеолиза. Этот уча­сток может быть алкилирован производным флавина без изме­нения доступности участка связывания потенциальных субстра­тов. Такие модифицированные флавопапаины использовались для окисления Ы-алкил-1,4-дигидроникотинамидов, и каталити­ческая активность некоторых из этих модифицированных белков была существенно выше, чем у природных флавопротеин-NADH- дегидрогеназ. Таким образом удалось создать очень эффектив­ный полусинтетический фермент. Использование флавинов с вы­сокоактивными, находящимися в определенном положении элек- трон-оттягивающими заместителями, возможно, позволит разра­ботать эффективные катализаторы для восстановления никотин­амида.

Крупные успехи, достигнутые за последнее время в химиче­ском синтезе ДНК, открыли перед белковой инженерией прин­ципиально новые возможности: конструирование уникальных, не встречающихся в природе белков. Для этого необходимо и дальнейшее развитие технологии, так чтобы изменение генов методами генетической инженерии приводило к предсказуемым изменениям белков, к улучшению вполне определенных функ­циональных их характеристик: числа оборотов, K_m для конкрет­ного субстрата, термостабильности, температурного оптимума» стабильности и активности в неводных растворителях, субстрат­ной и реакционной специфичности, потребности в кофакторах, оптимуме pH, устойчивости к протеазам, аллостерической ре­гуляции, молекулярной массы и субъединичного строения. Обыч­но такого улучшения достигали с помощью мутагенеза и отбора, а в последнее время — путем химической модификации и иммо­билизации. Для успешного конструирования конкретного типа молекул белка необходимо выявить ряд основополагающих за­кономерностей, связывающих структурные особенности белков и их желаемые свойства. Так, зная точную кристаллическую структуру молекулы изучаемого белка, мы можем идентифици­ровать те ее участки, которые следует направленно модифици­ровать для увеличения его каталитической активности. Такая модификация может состоять в изменении аминокислотной по­следовательности белка.

Первая контролируемая модификация белка была проведена в середине 60-х годов Кошландом и Бендером. Для замены гид­роксильной группы на сульфгидрильную в активном центре протеазы — субтилизина они применили метод химической мо­дификации. Однако, как выяснилось, такой тиолсубтилизин не сохраняет протеазную активность. Вообще говоря, методы хи­мической модификации не только жестки и неспецифичны; они плохи еще и тем, что с их помощью невозможно вызвать мно­жественные желаемые изменения, особенно если модифицируе­мые аминокислотные остатки погружены в глубь третичной структуры белка. Для этого нужна белковая инженерия, осно­ванная на генетической инженерии. Сегодня она осуществля­ется при помощи двух хорошо освоенных методов (гл. 7). Так, сайт-специфический мутагенез осуществляется следующим об­разом. Клонируют ген того белка, который интересует исследо­вателя, и встраивают его в подходящий генетический носитель. Затем синтезируют олигонуклеотидную затравку с желаемой мутацией, последовательность которой из десяти — пятнадцати нуклеотидов в достаточной степени гомологична определенному участку природного гена и поэтому способна образовывать с ним гибридную структуру. Эта синтетическая затравка исполь­зуется полимеразами для начала синтеза комплементарной ко­пии вектора, которую затем отделяют от оригинала и исполь­зуют для контролируемого синтеза мутантного белка. Альтер­нативный подход основан на расщеплении цепи, удалении под­лежащего изменению сайта и замещении его синтетическим аналогом с желаемой последовательностью нуклеотидов.

Тирозил-тРНК—синтетаза катализирует реакцию аминоаци­лирования тирозиновой тРНК, которая включает активирование тирозина с помощью ATP с образованием тирозиладенилата. Ген этого фермента, выделенный из Bacillus Stearothermophilus, был встроен в бактериофаг Ml3. Затем каталитические свойст­ва фермента, особенно его способность связывать субстрат, бы­ли изменены путем сайт-специфической модификации. Так, трео­нин-51 был заменен на аланин. Это привело к двукратному увеличению связывания субстрата, видимо, из-за невозможности¹ образования водородной связи между этим остатком и тирозил- аденилатом. При замене аланина пролином нарушается конфи­гурация молекулы фермента, но способность к связыванию суб­страта увеличивается в сто раз, так как облегчается его взаимо­действие с гистидином-48. Сходные сайт-специфичные изменения были получены в З-лактамазе, и обычно они сопровождались инактивацией фермента. Замена серина-70 на цистеин приводи! к образованию р-тиоллактамазы, константа связывания у кото­рой не отличается от таковой для природного фермента, но ак­тивность по отношению к пенициллину составляет всего 1-—2%. Тем не менее активность этого мутантного фермента в отноше­нии некоторых активированных цефалоспоринов не меньше ис­ходной активности или даже превышает ее; эти белки также более устойчивы к действию протеаз.

Мутации, вызываемые путем сайт-специфичного воздействия, используют сегодня для проверки адекватности результатов структурных исследований. В некоторых случаях с их помощью удалось показать, что структурная стабильность белка и его каталитическая активность могут быть разобщены. Накопив достаточное количество информации о взаимосвязи между ста­бильностью структуры белка и его функцией, мы, возможно, сумеем осуществлять тонкую регуляцию активности биологиче­ских катализаторов и создавать полностью синтетические их, аналоги. Недавно появилась работа, в которой сообщалось о клонировании первого синтетического гена фермента, кодирую­щего активный фрагмент молекулы рибонуклеазы.

Биологический катализ в неводных средах

Известно, что биологический катализ осуществляется в природе в водной среде, но сфера применения ферментов в биотехнологии не может ограничиваться только этими условиями. Нередко нужно подвергнуть изменению структуры липофильных или во­донерастворимых веществ, например стероидов или углеводоро­дов. Применение органических растворителей может не только увеличить каталитическую активность определенного фермента путем повышения доступности субстрата, но и сместить равно­весие соответствующей химической реакции.

Главным фактором здесь является стабильность биокатали­затора в органическом растворителе. Активность ферментов во многих не смешивающихся с водой органических растворителях нередко сильно падает. Так, в качестве катализаторов реакции дегидрирования стероидов в среде бензола и гептана использо­вали разные виды Nocardia. Для увеличения их стабильности применяли иммобилизацию; при этом нужно было учитывать гидрофобность носителя. Бактерии, заключенные в гидрофобные гели, обладали большей каталитической активностью, чем на­ходящиеся в гидрофильном окружении, что определялось ха­рактером распределения субстрата между гелем и окружающим его растворителем. Сегодня мы умеем конструировать носители с нужной степенью гидрофобности: для этого используются фо- тосшиваемые преполимеры смол и уретановые преполимеры. Иммобилизация фермента на поверхности или внутри твердого носителя повышает его устойчивость к действию органических растворителей, препятствуя разрушению третичной структуры белка в таких средах. Многие ферменты, катализирующие ре­акции превращения липофильных субстратов in vivo, локализу­ются в мембранах, и иммобилизация как бы имитирует их ста­билизированное связанное состояние в мембранах. Так, для син­теза этилового эфира N-ацетил-Б-триптофана из этанола и N-ацетил-Б-триптофана использовали химотрипсин в хлороформе. Липаза, иммобилизованная на гидрофобном полимере, ка­тализирует в н-гексане реакцию переэтерификации. Таким путем из оливкового масла и насыщенных высших жирных кислот получают заменитель кокосового масла.

Комбинируя разные описанные в этой главе способы, мы сможем существенно расширить границы применения биологи­ческих катализаторов в производстве и анализе химических ве­ществ, применяемых в промышленности.

• 4.4.2. Конфигурация реактора

Оптимизация биокатализатора

Особенности конфигурации биореактора, используемого в био­технологическом процессе, определяются биохимическими и био­физическими свойствами избранного биокатализатора. От его природы зависит также и способ дальнейшей переработки по­лученного продукта. В этой связи при разработке процесса особое значение приобретает улучшение свойств катализатора методами генетической инженерии, например изменения тех фи­зических параметров, которые определяют его способность ра­ботать в определенной среде, специфичность и производитель­ность, а также локализацию синтезируемого продукта (вспом­ним о внеклеточном образовании некоторых веществ клетками растений). Более подробно роль генетических методов в решении •задач биотехнологии разбирается в гл. 7.

Регулировать особенности протекания процесса можно так­же путем разумного выбора катализатора. Сегодня большие усилия затрачиваются на выделение, изучение свойств и спосо­бов использования термофильных микроорганизмов и их фер­ментов во многих уже применяющихся в промышленности био- катализируемых реакциях. Получаемые при этом преимущества определяются увеличением стабильности белков и их более высокой каталитической активностью. Модернизировать процес­сы можно и путем применения организмов, обитающих в экс­тремальных условиях (например, при низких pH или высоких концентрациях солей). Так, для производства органических кис­лот имеет смысл попытаться использовать ацидофильные гало­филы; галофильные виды уже сейчас применяются при выра­ботке полиолов (образование глицерола при участии Duniella).

Применение иммобилизованных биокатализаторов как в со­ставе целых организмов, так и в виде изолированных фермен­тов будет играть все большую роль в разработке и проведении биотехнологических процессов, поскольку это облегчает работу с ними, повторное их использование и отделение продукта ре­акции. Сама иммобилизация тоже может благоприятно сказы­ваться на стабильности и рабочих характеристиках катализато­ра, что в конечном счете может создать основу для кардиналь­ного пересмотра экономической конкурентоспособности опреде­ленного типа биопроизводства.

Повторное использование кофактора

Для проявления каталитической активности 30% известных фер­ментов нужен один из пяти кофакторов (NAD, NADP, ATP, FAD либо CoA). Само применение этих ферментов в биоката­лизе будет определяться тем, удастся ли повторно использовать эти дорогие вещества либо вообще обойтись без них. Существу­ет три подхода к решению этой проблемы: ферментативный, химический и электрохимический.

Ферментативную регенерацию кофакторов, например, можно осуществить при участии ряда имеющихся в продаже фермен­тов, которые в качестве восстановителя используют дешевые субстраты. В этом направлении была проведена большая работа по использованию формиатдегидрогеназы — фермента, который катализирует восстановление NADH при превращении формиа­та в углекислый газ. Так как продукт реакции является газом, он легко удаляется из реакционной смеси и не мешает выделе­нию из нее продукта реакции. Основная трудность здесь — по­теря самого кофактора из реакционной смеси. Предпринимались попытки повторного использования регенерированного кофакто­ра в такой системе путем присоединения его к более крупным молекулам с сохранением его каталитической активности. Такой комплекс можно удерживать в реакторе при помощи ультра­фильтрующей или гидрофобной жидкой мембраны. NAD вклю­чали в полиэтиленгликоль (с мол. массой 10 000—40000) и ис­пользовали в мембранном реакторе. К сожалению, каталитиче­ская активность таких иммобилизованных кофакторов обычно сильно падает и составляет всего несколько процентов от их активности в свободной форме. Коферменты и соответствующие регенерирующие ферменты стабилизировали также путем им­мобилизации в структуре гелей.

Химическое окисление NADH можно осуществить в реакции присоединения к нему кислорода с использованием акцепторов электронов вроде PMS/DCPIP или FMN.

Несомненный интерес представляет и электрохимическое окисление NAD(P)H и восстановление NAD(P)+. Для окисле­ния восстановленных коферментов был предложен ряд электро­дов. Осуществить стереоспецифическое электрохимическое вос­становление оказалось гораздо сложнее. Недавно были разра­ботаны соответствующие процессы с применением электродов с ферментами, которые участвуют в реакции стереоспецифиче­ского восстановления за счет электрохимического восстановле­ния редокс-центров ферментов. Это удалось осуществить бла­годаря разработке методов переноса электронов между элект­родами и этими редокс-центрами. В результате в некоторых случаях каталитический процесс протекает в отсутствие кофак­тора. Такое замещение кофактора модифицированным электро­дом, видимо, легче осуществить для реакций восстановления, чем окисления.

• 4.4.3. Будущий вклад биотехнологии в химическую промышленность

Источником сырья для различных отраслей химической промыш­ленности в обозримом будущем будут нефть и ее производные. Получаемые из них с малыми затратами продукты вряд ли по­требуется производить при помощи какой-то другой технологии. Факторами, которые могут оказать сильное влияние на внедре­ние биотехнологии в эту область, являются истощение источни­ков сырья, повышение стоимости энергии и постоянная необхо­димость эффективной переработки отходов. Уменьшение доступ­ных источников горючего приведет к тому, что все более широко будут использоваться ресурсы биомассы. Бродильные производ­ства и технологии на основе ферментов будут и далее дополнять спектр обычных химических технологий. Что же касается при­менения биотехнологии в крупномасштабных производствах хи­мических веществ или полимеров, то перспективы здесь весьма ограничены. C экономической точки зрения наиболее целесооб­разным представляется использование специфических преиму­ществ биокаталитических процессов в малообъемных производ­ствах редких химических веществ с высокой прибавочной стои­мостью.

ЛИТЕРАТУРА

Современная химическая биотехнология

Atkinson B., Mavituna F. (1983). Biochemical and Bioengineering Handbook, Nature Press, UK.

Cain R. B. (1980). Transformation of aromatic hydrocarbons. In: Hydrocarbons in Biotechnology (eds. Harrison D. E. F., Higgins I. J. and Watkinson R.), pp. 99—133, Heyden₁ London.

Dellweg H. (ed.) (1983). Biotechnology, Vol. 3: Biomass, Microorganisms for Special Applications, Microbial Products 1, Energy from Renewable Sources, Verlag Chemie, Weinheim.

Evelegh D. E. (1981). The microbiological production of industrial chemicals, Scient. Am., 245, 154—178.

Godfrey T., Reichelt J. (1983). Industrial Enzymology: The Application of Enzy­mes in Industry, The Nature Press, Macmillan, UK.

Kieslich K., Sebek O. K. (1979). Microbial transformation of steroids. In: Annual Reports on Fermentation Processes, Vol. 3 (ed. Perlman D.), pp. 267—297, Academic Press, New York.

Peppier H. J., Perlman D. (eds.) (1979). Microbial Technology, Vol. 1 and 2: Microbial Processes, Academic Press, London.

Rose A. H. (ed.) (1978—1980). Economic Microbiology Series, Vol. 2: Primary Products of Metabolism, Vol. 3: Secondary Products of Metabolism, Vol. 5: Microbial Enzymes and Bioconversions, Academic Press, London.

Schindler J., Schmid R. D. (1982). Fragrance or aroma chemicals: microbial synthesis and enzymatic transformation — a review, Process Biochem., 17(5), 2—8.

Scott C. D. (ed.) (1983). Fifth Symposium on Biotechnology for Fuels and Che­micals, Biotechnology and Bioengineering Symposium Number 13, John Wiley and Sons, New York.

Sebek O. K., Kieslich K. (1977). Microbial transformation of organic compounds: alkanes, alicyclics, terpenes and alkaloids. In: Annual Reports on Fermentation Processes, Vol. I (ed. PerIman D.), pp. 267—297, Academic Press, New York.

Smith J. E., Berry D. R., Kristiansen B. (eds.) (1983). The Filamentous Fumgir Volume IV, Fungal Technology, Edward Arnold, London.

Получение химических веществ из биомассы

Curtin M. Е. (1983). Harvesting profitable products from plant tissue culture. Biotechnology, 1(8), 649—657.

Eveleigh D. E. (1983). Biological routes for cellulose utilisation. In: Biotech’83, Proceedings of the International Conference on the Commercial Applications and Implications of Biotechnology, pp. 539—548, Online Conferences Ltd., Midlesex₁ UK.

Flinn J. E., Lipinsky E. S. (1983). Production of chemicals via advanced biotech­nological processes. In: Biotech’83, Proceedings of the International Confe­rence on the Commercial Applications and Implications of Biotechnology pp. 523—538, Online Conferences Ltd., Middlesex, UK.

Fowler M. W. (1981). Plant cell biotechnology to produce desirable substances Chern. Ind., 7, 229—233.

Jones L. Н. (1983). Plant cell cloning and culture products. In: Biotechnology (eds. Phelps C. F. and Clarke P. H.), pp. 221—232, Biochemical Society Sym­posium Number 48, Biochemical Society, London.

Staba E. J. (ed.) (1980). Plant Tissue Culture as a Source of Biochemicals, CRG Press, Boca Raton, Florida.

Перспективы развития

Brown G. B., Manecke G., Wingard L. B. {eds.) (1978). Enzyme Engineering, Vol. 4, Plenum Press, New York.

Klibanov A. M. (1983). Unconventional catalytic properties of conventional enzymes: applications in organic chemistry, Basic Life Sci., 25, 497—518.

Maugh T. H. (1984). Semisynthetic enzymes are new catalysts, Science, 223, 154—156.

Maugh T. H. (1984). Need a catalist? Design an enzyme, Science, 223, 269— 271.

Neidleman S. L., Geigert J. (1983). Biological galogenation and epoxidation. In: Biotechnology (eds. Phelps C. F. and Clarke P. H.), pp. 39—52, Biochemical Society Symposium Number 48, Biochemical Society, London.

Omata T., Iida T., Tanaka A., Fukui S. (1979). Transformation of steroids by gel­entrapped Nocardia rhodochrous cells in organic solvents, Eur. J. appl. Micro­biol. Biotechnol., 8, 143—155.

Pye E. K., Weetall H. H. (eds.) (1978). Enzyme Engineering, Vol. 3, Plenum Press, New York.

Ulmer K. M. (1983). Protein engineering, Science, 219, 666—671.

Wingard L. B., Berezin I. V., Klyosov A. A. (eds.) (1980). Enzyme Engineering, Future Directions, Plenum Press, New York.

Wiseman A. (ed.) (1977—1983). Topics in Enzyme and Fermentation Biotechno­logy, Vols. 1—7, Fillis Horwood, Chichester.