Контроль санитарно-гигиенического состояния питьевой воды проводят в соответствии с СанПиН 2.1.4.1074; ГОСТ Р 51232, ГОСТ 18963; МУК 4.2.1018 по следующим микробиологическим показателям:

• термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ);
• общие колиформные бактерии (ОКБ);
• КМАФАнМ (ОМЧ).

Упрощенная схема контроля качества воды в условиях производственных ла­бораторий представлена на рисунке 1.

Полная схема контроля качества воды в условиях производственных лабора­торий представлена на рисунке 2.

Примечание 1

Результаты посева фильтров на среде Эндо:

• на фильтрах нет роста колоний или рост пленчатых, губчатых, плесневых колоний - результат «отсутствие ОКБ и ТКБ в 100 см³ воды». Анализ закончен через 24 ч;
• на фильтрах рост изолированных типичных лактозоположительных колоний - под­считывают число колоний каждого типа отдельно, подтверждают их принадлежность к ОКБ и ТКБ (исследуют не менее 3-4 колоний каждого типа) по признакам:
• оксидазный тест;
• принадлежность к Г раму;
• ферментация лактозы на лактозной среде при (37±1) °С 48 ч для ОКБ и при (44±0,5) °С 24 ч для ТКБ.

Примечание 2

Результаты посева воды на среду накопления:

• отсутствие помутнения и образования кислоты и газа в засеянных объемах воды - результат «отсутствие ОКБ и ТКБ в 100 см³ воды». Анализ закончен через 24 ч;
• из флаконов, где отмечено помутнение и образование кислоты и газа, а также по­мутнение и кислота при использовании ГПС или помутнение при использовании ЛПС, дела­ют высев на среду Эндо. При отсутствии роста колоний или росте пленчатых, губчатых, плесневых колоний - результат «отсутствие ОКБ и ТКБ в 100 см³ воды». Анализ закончен через 24 ч. Рост изолированных типичных лактозоположительных колоний - подсчитывают число колоний каждого типа отдельно, подтверждают их принадлежность к ОКБ и ТКБ по признакам:

• оксидазный тест;
• принадлежность к Г раму;
• ферментация лактозы на лактозной среде при (37±1) °С 48 ч для ОКБ и при (44±0,5) °С 24 ч для ТКБ.

7.3.1 Отбор проб для контроля воды

Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих це­лей одноразовую посуду или емкости многократного применения, изготовленные из материалов, не влияющих на жизнедеятельность микроорганизмов.

Емкости должны быть оснащены плотно закрывающимися пробками (силико­новыми, резиновыми или из других материалов) и защитным колпачком (из алюми­ниевой фольги, плотной бумаги). Многоразовая посуда, в т.ч. пробки, должна вы­держивать стерилизацию сухим жаром или автоклавированием.

При отборе проб в одной и той же точке для различных целей первыми отби­рают пробы для микробиологических исследований. Если отбирают воду после обеззараживания химическими реагентами, то для нейтрализации остаточного коли­чества дезинфектанта в емкость, предназначенную для отбора проб, вносят до сте­рилизации натрий серноватисто-кислый в виде кристаллов из расчета 0,01 г на 500 см³ воды.

Пробу отбирают в стерильные емкости. Емкость открывают непосредственно перед отбором, удаляя пробку вместе со стерильным колпачком. Во время отбора пробка и края емкости не должны чего-либо касаться. Ополаскивать посуду запре­щается.

При исследовании воды из распределительных сетей отбор проб из крана проводят после предварительной его стерилизации обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 мин при полностью открытом кране. При отборе проб напор воды может быть уменьшен. Пробу отбирают непосредственно из крана без резино­вых шлангов, водораспределительных сеток и других насадок. Если через пробоот­борный кран происходит постоянный излив воды, отбор проб проводят без предварительного обжига, не изменяя напора воды и существующей конструкции (при на­личии силиконовых или резиновых шлангов).

При заполнении емкостей должно оставаться пространство между пробкой и поверхностью воды, чтобы пробка не смачивалась при транспортировании.

После наполнения емкость закрывают стерильной пробкой и колпачком.

Отобранную пробу маркируют и сопровождают документом отбора проб воды с указанием места, даты, времени забора, фамилии специалиста, отбирающего про­бу, и другой информации.

Пробы воды можно хранить при температуре 4-10 °С не более 6 ч. Если пробы нельзя охладить, их анализ следует провести в течение 2 ч после забора.

7.3.2 Проведение анализов

7.3.2.1 Определение общего числа микроорганизмов (ОМЧ) 

Сущность метода

Метод основан на определении общего числа мезофильных аэробных и фа­культативно-анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре или агаре для определения КМАФАнМ при температуре 37 °С в течение 24 ч, видимых с увеличением в два раза.

Проведение анализа

Пробу воды тщательно перемешивают, вносят в чашки Петри по 1 см³ и про­водят посев в соответствии с 5.6.1. При этом из каждой пробы делают посев не ме­нее двух объемов по 1 см³.

Обработка результатов

Подсчитывают все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличе­нии в два раза. Количество колоний на обеих чашках суммируют и делят на два. Ре­зультат выражают числом колоний образующих единиц (КОЕ) в 1 см³ исследуемой пробы воды.

Если подсчет отдельных колоний на чашках невозможен, то в протоколе отме­чают сплошной рост.

Общее число микроорганизмов (ОМЧ) должно составлять не более 50 КОЕ/см³. При получении неудовлетворительных результатов проводится усиленная обработка воды и повторный анализ.

7.3.2.2 Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранной фильтрации (основной метод)

Сущность метода

Метод основан на концентрировании бактерий из определенного объема ана­лизируемой воды на мембранном фильтре, выращивании их при (37+1) °С на диф­ференциальной питательной среде с лактозой и последующей идентификации коло­ний по культуральным и биохимическим свойствам.

Проведение анализа

Подготовка мембранных фильтров

Мембранные фильтры № 2 или № 3, а также планктонные фильтры № 6, про­веренные на отсутствие трещин, отверстий и т.п., помещают по одному на поверх­ность дистиллированной воды, нагретой до 80 °С в стакане (в чашке для выпарива­ния, эмалированной кастрюле и др.) и медленно доводят до кипения на слабом огне, после чего воду заменяют и кипятят 10 мин. Смену воды и последующее кипячение повторяют 3-5 раз до полного удаления остатков растворителей из фильтров, после чего они готовы к работе. Подготовленные фильтры хранят сухими или в широкогорлой банке с дистиллированной водой. Перед употреблением фильтры стерили­зуют кипячением в дистиллированной воде.

Фильтрующие мембраны «Владипор» марки МФА-МА №№ 5, 6, 7, 8 и 10, ви­зуально проверенные на отсутствие трещин, отверстий, пузырей и т.п., стерилизуют кипячением. При этом во избежание скручивания мембран необходимо соблюдать следующие правила. На дно стакана или другой емкости, в котором проводят кипя­чение, помещают «сторож для молока» или нержавеющую сетку для ограничения бурного кипения. Дистиллированную воду заливают в стакан или емкость в неболь­шом объеме, ограничивающем свободное вращение в ней фильтрующих мембран. Однако вода должна покрывать предназначенные для стерилизации фильтрующие мембраны. Дистиллированную воду доводят в сосуде до 80-90 °С, после чего, уба­вив нагрев, на поверхность воды по одной помещают фильтрующие мембраны. Воду с помещенными в нее мембранами медленно доводят до кипения и кипятят на сла­бом огне в течение 10-15 мин. Затем воду сливают и заменяют небольшим количе­ством (чтобы покрыть фильтрующие мембраны) стерильной дистиллированной во­ды. После чего фильтрующие мембраны готовы к употреблению. При необходимо­сти проводят повторное кипячение фильтрующих мембран.

Подготовка фильтровального аппарата к анализу

Перед посевом воды фильтровальный аппарат стерилизуют фламбированием после обтирания ватным тампоном, смоченным спиртом. После охлаждения на ниж­нюю часть фильтровального аппарата (столик) кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его верхней частью прибора (стака­ном, воронкой) и закрепляют устройством, предусмотренным конструкцией прибора.

Выполнение анализа

При исследовании питьевой воды анализируют 3 объема по 100 см³.

При получении стабильных отрицательных результатов допустима фильтра­ция 300 см³ через один фильтр.

При фильтрации воды неизвестного качества целесообразно увеличение ко­личества фильтруемых объемов для получения изолированных колоний на фильтре (например, 10, 40, 100, 150 см³ воды).

Отмеренный объем воды фильтруют через мембранные фильтры.

Фильтры помещают на среду Эндо. Чашки с фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре (37±1) °С в течение (24±2) ч.

Если на фильтрах нет роста или выросли пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, расплывчатые колонии, выдают отрицательный ответ: отсутствие ОКБ И ТКБ в 100 см³ исследуемой воды.

Анализ заканчивают через 24 ч.

Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичных лактозоположи­тельных колоний: темно-красных, красных с металлическим блеском или без него или других подобного типа колоний с отпечатком на обратной стороне фильтра, под­считывают число колоний каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их возможной принадлежности к ОКБ и ТКБ.

Для подтверждения наличия ОКБ исследуют:

• все колонии, если на фильтрах выросло менее 5 колоний;
• не менее 3-4 колоний каждого типа.

Для подтверждения наличия ТКБ исследуют все типичные колонии, но не бо­лее 10.

Каждую выбранную изолированную колонию исследуют на:

• наличие оксидазной активности;
• окраску по Г раму по 6.4.1;
• ферментацию лактозы до кислоты и газа.

Постановка оксидазного теста проводится по 6.3.2.

При контроле качества воды оксидазный тест предназначается для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от бактерий семейства Pseudomonadaceae и других водных сапрофитных бактерий.

При положительном результате колонию из дальнейшего исследования ис­ключают.

Если при исследовании колоний, окрашенных в темно-красный цвет, получают недостаточно четкий результат, необходимо пересеять культуру со среды Эндо на питательный агар. После инкубации тест повторяют.

Определение ферментации лактозы

Оставшуюся часть оксидазоотрицательной грамотрицательной изолированной колонии засевают параллельно в две пробирки с лактозной средой (лактозопептон- ной или полужидкой средой с лактозой) по 4.6.2.4:

• для подтверждения наличия ОКБ посев инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 48 ч;
• для подтверждения наличия ТКБ посев осуществляют в среду, предвари­тельно подогретую до температуры 43-44 °С, и инкубируют при температуре (44,0±0,5) °С в течение 24 ч.

Первичный учет образования кислоты и газа на подтверждающих полужидких средах возможен через 4-6 ч.

При обнаружении кислоты и газа дают положительный ответ.

При отсутствии кислоты и газа или при наличии только кислоты пробирки с по­севами для окончательного учета ТКБ продолжают инкубировать до 24 ч.

Пробирки с посевами для подтверждения наличия ОКБ после просмотра через 24 ч и получения отрицательного результата продолжают инкубировать до 48 ч для окончательного учета.

Если колония, подлежащая исследованию, незначительных размеров, ее пе­ресевают на скошенный питательный агар и после инкубации в течение 18-24 ч вы­полняют все необходимые подтверждающие тесты.

Грамотрицательные колонии учитываются как ОКБ при отрицательном окси- дазном тесте и ферментации лактозы при температуре 37 °С с образованием кисло­ты и газа.

Грамотрицательные колонии учитываются как ТКБ при отрицательном окси- дазном тесте и ферментации лактозы при температуре 44 °С с образованием кисло­ты и газа.

Если проведенные тесты дают положительный результат о принадлежности исследованных колоний к ОКБ (оксидазоотрицательные, грамотрицательные, фер­ментирующие лактозу с образованием кислоты и газа), то мы говорим о присутствии ОКБ в исследованном объеме.

Обработка результатов

При отсутствии общих и термотолерантных колиформных бактерий на всех фильтрах результат записывают «не обнаружено КОЕ ОКБ в 100 см³» и «не обнару­жено КОЕ ТКБ в 100 см³».

После идентификации всех выросших подозрительных колоний число колониеобразующих единиц ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают числом КОЕ в 100см³ воды.

7.3.2.3 Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий титрационным методом

Титрационный метод может быть использован:

• при отсутствии материалов и оборудования, необходимых для выполнения анализа методом мембранной фильтрации;
• при анализе воды с большим содержанием взвешенных веществ;
• в случае преобладания в воде посторонней микрофлоры. препятствующей получению на фильтрах изолированных колоний общих колиформных бактерий.

Сущность метода

Метод основан но накоплении бактерий поело посева установленного объема роды в жидкую питательную сроду с последующим пересевом на дифференциаль­ную плотную питательную среду с лактозой и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам.

Проведение анализа

При исследовании питьевой воды качественным методом (текущий саиэпи- демнадзор, производственный контроль) засевают 3 объема по 100 см³ исследуемой воды.

При исследованиях воды с целью количественного определения ОКБ и ТКБ при повторном анализе проводят посев: 3 объемов по 100 см³, 3 объемов по 10 см³ и 3 объемов по 1 см³.

Каждый объем исследуемой воды засевают в лактозо-пептонную или глюкозо- пептонную среду, приготовленные по 4.6.2.4. Посев 100 см³ и 10 см³ воды проводят в 10 см³ и 1 см³ концентрированной среды, посев 1 см³ пробы проводят в 10 см³ сре­ды обычной концентрации.

Посевы инкубируют при (37±1) °С в течение 24 ч при проведении анализа на среде ГПС и 48 ч при проведении анализа на среде ЛПС. Не ранее 24 ч инкубации проводят предварительную оценку посева. Из емкостей, где отмечено помутнение, изменение окраски (кислотообразование) и образование газа, а также помутнение и кислотообразование при использовании ГПС или помутнение при использовании ЛПС, проводят посев бактериологической петлей на сектора среды Эндо (4.6.2.6), разделенной на 3-4 сектора (5.6.2.2), для получения изолированных колоний. При получении сплошного роста необходимо рассеивать посевной материал на чашку со средой Эндо для выделения изолированных колоний.

Емкости без признаков роста на среде ЛПС оставляют в термостате и оконча­тельно просматривают через 48 ч. Посевы без признаков роста считают отрицатель­ными и дальнейшие исследования с ними не проводят. Из посевов, где отмечено помутнение и образование газа или только помутнение, делают высев на сектора среды Эндо.

Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре (37±1) °С в течение 18-20 ч.

При отсутствии роста колоний на секторах среды Эндо, а также при наличии пленчатых, губчатых, с неровными краями и поверхностью, плесневых и других не характерных для кишечных палочек колоний получают отрицательный результат.

При образовании помутнения, газа и изменения цвета в среде накопления и росте на среде Эндо колоний, типичных для лактозоположительных бактерий: тем­но-красных или красных, с металлическим блеском или без него, выпуклых с красным центром и отпечатком на питательной среде (изменение цвета среды под коло­нией), дают положительный ответ на присутствие общих колиформных бактерий в данном объеме пробы.

Наличие ОКБ требуется подтвердить:

• если в среде накопления отмечено только помутнение;
• если принадлежность к лактозоположительным колониям вызывает сомне­ние у исследователя.

В этих случаях:

• проверяют наличие отпечатка на среде Эндо после снятия петлей подозри­тельной колонии;
• выполняют оксидазный тест;
• подтверждают принадлежность к Граму по 4.1;
• подтверждают способность к газообразованию при посеве изолированных 1-2 колоний каждого типа с каждого сектора на среду с лактозой по 4.6.2.4 с после­дующей инкубацией посевов при температуре (37±1) °С в течение 24-48 ч.

При отсутствии изолированных колоний проводят рассев на среду Эндо об­щепринятыми методами.

Отрицательный ответ дают, если:

• в среде накопления нет признаков роста;
• на секторах среды Эндо нет роста;
• на секторах среды Эндо выросли не характерные для колиформных бакте­рий колонии (прозрачные с неровными краями, расплывчатые и т.п.);
• все колонии оказались оксидазоположительными;
• все колонии оказались грамположительными;
• если в подтверждающем тесте на среде с углеводом не отмечено газообра­зования.

Для определения термотолерантных колиформных бактерий работают с сек­торами среды Эндо, где выросли типичные лактозоположительные колонии. Делают посев 2-3 изолированных колоний каждого типа с каждого сектора в пробирки с лю­бой из лактозных сред.

Среду перед посевом нагревают на водяной бане или в термостате до 44 °С. Немедленно после посева пробирки помещают в термостат и инкубируют при тем­пературе (44±1) °С в течение 24 ч. Допускается просмотр посевов через 4-6 ч.

При образовании газа в среде накопления, росте на среде Эндо лактозополо­жительных бактерий и выявлении способности этих бактерий ферментировать лак­тозу до кислоты и газа в течение 24 ч при температуре 44 °С дают положительный результат на наличие в этом объеме пробы воды ТКБ. Во всех остальных случаях дают отрицательный ответ.

Допускается для ускорения выдачи ответа на присутствие ТКБ проводить по­сев 1 см³ из объемов среды накопления, где отмечено помутнение и газообразова­ние в пробирки с лактозо-пептонной средой с поплавком по 4.6.2.4 и предварительно прогретые до температуры 44 °С. Посевы выдерживают в термостате при темпера­туре (44±1) °С в течение 24 ч. При обнаружении изменения окраски индикатора и об­разования газа дают положительный ответ.

Обработка результатов

При исследовании 3 объемов по 100 см³ результаты оцениваются качественно и при обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы в одном из 3 объемов, делается запись в журнале: «обнаружены в 100 см³».

При исследовании количественным методом определяют наиболее вероятное число (НВЧ) ОКБ и ТКБ по таблице 19.

Результат представляют без доверительного интервала.

При отрицательном результате на наличие ОКБ и ТКБ во всех исследованных объемах выдают заключение в протоколе «не обнаружены в 100 см³».

Микробиологические показатели безопасности питьевой воды при контроле в условиях производственной лаборатории представлены в таблице 20.

Периодичность контроля:

• зависит от вида водоснабжения (централизованное или собственное) и вида выпускаемой продукции (непосредственное использование воды в ходе технологи­ческого процесса или для технических целей) и проводится 4-12 раз в год,
• усиленный контроль показателей проводят при появлении тех или иных ха­рактерных органолептических пороков продуктов или при снижении их хранимоспо- собности.

Картина роста БГКП на средах ГПС и ЛПС приведена в приложении Г.