8.1.1 Общие требования

Исследования, связанные с определением бактериофагов, проводят в усло­виях, исключающих возможность загрязнения окружающей среды.

Анализы проводят в боксе, в котором не ведут работы с бактериальными за­квасками и препаратами.

При отсутствии бокса работы можно проводить в лабораторном помещении, соблюдая особую осторожность:

• посуду с питательными средами, посевами, растворами с разведениями, ис­пользованные пипетки перед мойкой необходимо стерилизовать в автоклаве при температуре (121+1) °С в течение (25+5) мин или кипятить (1,2+0,2) ч.
• по окончании работ рабочее место тщательно дезинфицируют спиртом или другим дезинфицирующим средством и подвергают помещение УФ-обработке тече­ние (45+5) мин.

8.1.2 Тест-культура для определения бактериофага 

Тест-культура - штаммы молочнокислых бактерий, чувствительные к широко­му спектру фагов. Они выпускаются специализированными предприятиями в виде моновидовых и одноштаммовых жидких или сухих заквасок или бактериальных кон­центратов.

Для этих целей используется специальный диагностический набор «Фаготест- ЛК». В набор входят три тест-культуры, чувствительные к различным фагам, что да­ет возможность выявления их максимального спектра, и сухая питательная среда для их роста.

Подготовка рабочей тест-культуры для определения бактериофага

Рабочую тест-культуру готовят из сухой тест-культуры путем внесения в нее (9,5+0,5) см³ стерильной воды или физраствора с соблюдением правил асептики. Пробу тщательно перемешивают и используют в течение 2 ч.

8.1.3 Подготовка проб для определения наличия в них бактериофага

Подготовка проб включает освобождение пробы от нерастворимых соедине­ний (белок, жир) и освобождение пробы от микроорганизмов.

Освобождение пробы от нерастворимых соединений

При исследовании молока, закваски или иного продукта пробу предваритель­но освобождают от белка.

Для этого пробу молока подкисляют 10 % молочной кислотой до появления хлопьев, подогревают до температуры (42+2) °С и выдерживают при комнатной тем­пературе 10-15 мин для осаждения белка.

Пробу сыра (1,0+0,1) г предварительно растирают в ступке с (9,9+0,1) см³ сте­рильной воды или физраствора, подогретых до (45+1) °С.

Пробы фильтруют через стерильный бумажный фильтр в стерильную колбу для отделения белка или центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10-15 мин. При этом центрифужные стаканы и центрифуга должны быть обработаны спиртом. Ста­каны можно обрабатывать стерилизацией в автоклаве, завернутыми в плотную бу­магу.

При исследовании закваски, сыворотки, рассола или иного аналогичного объ­екта проводят перемешивание продукта, затем фильтрование через стерильные ватно-марлевые или ватные фильтры.

Для анализа используют надосадочную жидкость или фильтрат.

Освобождение пробы от микроорганизмов

Выделение бактериофага фильтрованием

Надосадочную жидкость пропускают через стерильные бактериальные фильт­ры (фильтр Зейтца или другие мембранные фильтры с диаметром пор не более 0,2 мкм). Можно использовать фильтры, применяемые для анализа воды.

Допускается выделение фага из молока непосредственно фильтрованием че­рез стерильные бактериальные фильтры.

Воду фильтруют непосредственно через стерильные бактериальные фильтры.

Выделение бактериофага с использованием хлороформа

10 см³ исследуемого образца, предварительно освобожденного от белка, по­мещают в стерильную пробирку, добавляют (1,2±0,2) % хлороформа с помощью пи­петки с резиновой грушей или шприца или другого приспособления, предотвращаю­щего непосредственный контакт работающего с хлороформом. Пробирку закрывают ватной пробкой, смесь тщательно перемешивают и выдерживают в течение (12+2) мин. Работы с хлороформом необходимо проводить в вытяжном шкафу.

Стерильной пипеткой с грушей или шприцем, не захватывая нижний слой с хлороформом, отбирают верхнюю часть смеси и переносят в стерильную пробирку.

Выделение бактериофага путем температурного воздействия

Пробу прогревают в водяной бане при температуре (65+1) °С в течение (25±5) мин и далее фильтруют через стерильный бумажный или ватно-марлевый фильтр или центрифугируют для удаления белкового осадка.

Выделение бактериофага из производственной атмосферы

Выделение проводят путем прямого осаждения фаговых частиц на чашки Петри с питательной средой и тест-культурами или с помощью аппарата Кротова (или его аналогов).

8.1.4 Подготовка чашек Петри с газонами из тест-культур 

В стерильную чашку Петри вносят (20+5) см³ предварительно расплавленной и охлажденной до (46±1) °С питательной среды КМАФАнМ по 4.6.2.1.

После застывания питательной среды ее поверхность подсушивают в течение (12±2) мин в термостате при (37+2) °С и создают газон из тест-культуры, т.е. на по­верхность среды наносят стерильной пипеткой 1-2 капли рабочей тест-культуры, приготовленной по 8.1.2, которую распределяют с помощью шпателя Дригальского или изогнутой стеклянной палочки равномерно по всей поверхности.

Допускается наносить тест-культуру на поверхность среды с помощью ватно­марлевого или марлевого тампона. Для этого стерильный тампон смачивают рабо­чей тест-культурой и протирают им поверхность подсушенной среды.

Подготовленные чашки Петри с тест-культурами должны быть исполь­зованы для проведения испытаний в течение 1 ч.

При необходимости более длительного хранения индикаторных чашек Петри их следует поместить в холодильник, но не более чем на 2 ч.

8.1.5 Подготовка индикаторных пробирок для обнаружения бактериофагов 

Индикаторные пробирки представляют собой пробирки с жидкой питательной средой и внесенной тест-культурой. Поэтому индикаторные пробирки готовят непо­средственно перед проведением исследований.

В случае необходимости допускается хранение подготовленных индикаторных пробирок (с внесенными тест-культурами) в холодильнике при температуре от 4 °С до 6 °С не более 1 ч.

Индикаторные пробирки готовят следующим образом. В пробирки с (10,0+0,1) см³ гидролизованного молока вносят по (0,10+0,01) см³ рабочих тест­культур по 8.1.2.