8.1.1 Общие требования
Исследования, связанные с определением бактериофагов, проводят в условиях, исключающих возможность загрязнения окружающей среды.
Анализы проводят в боксе, в котором не ведут работы с бактериальными заквасками и препаратами.
При отсутствии бокса работы можно проводить в лабораторном помещении, соблюдая особую осторожность:
- посуду с питательными средами, посевами, растворами с разведениями, использованные пипетки перед мойкой необходимо стерилизовать в автоклаве при температуре (121+1) °С в течение (25+5) мин или кипятить (1,2+0,2) ч.
- по окончании работ рабочее место тщательно дезинфицируют спиртом или другим дезинфицирующим средством и подвергают помещение УФ-обработке течение (45+5) мин.
8.1.2 Тест-культура для определения бактериофага
Тест-культура - штаммы молочнокислых бактерий, чувствительные к широкому спектру фагов. Они выпускаются специализированными предприятиями в виде моновидовых и одноштаммовых жидких или сухих заквасок или бактериальных концентратов.
Для этих целей используется специальный диагностический набор «Фаготест- ЛК». В набор входят три тест-культуры, чувствительные к различным фагам, что дает возможность выявления их максимального спектра, и сухая питательная среда для их роста.
Подготовка рабочей тест-культуры для определения бактериофага
Рабочую тест-культуру готовят из сухой тест-культуры путем внесения в нее (9,5+0,5) см3 стерильной воды или физраствора с соблюдением правил асептики. Пробу тщательно перемешивают и используют в течение 2 ч.
8.1.3 Подготовка проб для определения наличия в них бактериофага
Подготовка проб включает освобождение пробы от нерастворимых соединений (белок, жир) и освобождение пробы от микроорганизмов.
Освобождение пробы от нерастворимых соединений
При исследовании молока, закваски или иного продукта пробу предварительно освобождают от белка.
Для этого пробу молока подкисляют 10 % молочной кислотой до появления хлопьев, подогревают до температуры (42+2) °С и выдерживают при комнатной температуре 10-15 мин для осаждения белка.
Пробу сыра (1,0+0,1) г предварительно растирают в ступке с (9,9+0,1) см3 стерильной воды или физраствора, подогретых до (45+1) °С.
Пробы фильтруют через стерильный бумажный фильтр в стерильную колбу для отделения белка или центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10-15 мин. При этом центрифужные стаканы и центрифуга должны быть обработаны спиртом. Стаканы можно обрабатывать стерилизацией в автоклаве, завернутыми в плотную бумагу.
При исследовании закваски, сыворотки, рассола или иного аналогичного объекта проводят перемешивание продукта, затем фильтрование через стерильные ватно-марлевые или ватные фильтры.
Для анализа используют надосадочную жидкость или фильтрат.
Освобождение пробы от микроорганизмов
Выделение бактериофага фильтрованием
Надосадочную жидкость пропускают через стерильные бактериальные фильтры (фильтр Зейтца или другие мембранные фильтры с диаметром пор не более 0,2 мкм). Можно использовать фильтры, применяемые для анализа воды.
Допускается выделение фага из молока непосредственно фильтрованием через стерильные бактериальные фильтры.
Воду фильтруют непосредственно через стерильные бактериальные фильтры.
Выделение бактериофага с использованием хлороформа
10 см3 исследуемого образца, предварительно освобожденного от белка, помещают в стерильную пробирку, добавляют (1,2±0,2) % хлороформа с помощью пипетки с резиновой грушей или шприца или другого приспособления, предотвращающего непосредственный контакт работающего с хлороформом. Пробирку закрывают ватной пробкой, смесь тщательно перемешивают и выдерживают в течение (12+2) мин. Работы с хлороформом необходимо проводить в вытяжном шкафу.
Стерильной пипеткой с грушей или шприцем, не захватывая нижний слой с хлороформом, отбирают верхнюю часть смеси и переносят в стерильную пробирку.
Выделение бактериофага путем температурного воздействия
Пробу прогревают в водяной бане при температуре (65+1) °С в течение (25±5) мин и далее фильтруют через стерильный бумажный или ватно-марлевый фильтр или центрифугируют для удаления белкового осадка.
Выделение бактериофага из производственной атмосферы
Выделение проводят путем прямого осаждения фаговых частиц на чашки Петри с питательной средой и тест-культурами или с помощью аппарата Кротова (или его аналогов).
8.1.4 Подготовка чашек Петри с газонами из тест-культур
В стерильную чашку Петри вносят (20+5) см3 предварительно расплавленной и охлажденной до (46±1) °С питательной среды КМАФАнМ по 4.6.2.1.
После застывания питательной среды ее поверхность подсушивают в течение (12±2) мин в термостате при (37+2) °С и создают газон из тест-культуры, т.е. на поверхность среды наносят стерильной пипеткой 1-2 капли рабочей тест-культуры, приготовленной по 8.1.2, которую распределяют с помощью шпателя Дригальского или изогнутой стеклянной палочки равномерно по всей поверхности.
Допускается наносить тест-культуру на поверхность среды с помощью ватномарлевого или марлевого тампона. Для этого стерильный тампон смачивают рабочей тест-культурой и протирают им поверхность подсушенной среды.
Подготовленные чашки Петри с тест-культурами должны быть использованы для проведения испытаний в течение 1 ч.
При необходимости более длительного хранения индикаторных чашек Петри их следует поместить в холодильник, но не более чем на 2 ч.
8.1.5 Подготовка индикаторных пробирок для обнаружения бактериофагов
Индикаторные пробирки представляют собой пробирки с жидкой питательной средой и внесенной тест-культурой. Поэтому индикаторные пробирки готовят непосредственно перед проведением исследований.
В случае необходимости допускается хранение подготовленных индикаторных пробирок (с внесенными тест-культурами) в холодильнике при температуре от 4 °С до 6 °С не более 1 ч.
Индикаторные пробирки готовят следующим образом. В пробирки с (10,0+0,1) см3 гидролизованного молока вносят по (0,10+0,01) см3 рабочих тесткультур по 8.1.2.