Для выбора наиболее эффективного стабилизатора необходимо иметь достаточно адекватные методы оценки действия их в пиве. Необходимо также уста­новить такой аналитический показатель, который бы коррелировал с коллоидной стойкостью пива и по­зволял вскоре после розлива предсказывать, как дол­го данное пиво будет оставаться прозрачным, особенно- при хранении в условиях пониженной температуры.

Большинство методов основано на определении ко­личества веществ — потенциальных образователей мути,, т. е. в основном полипептидов и полифенолов. По­скольку роль белков (полипептидов) в процессе обра­зования мути была установлена раньше, чем роль по­лифенолов, определению количества именно этих компонентов посвящено наибольшее число методов.

Методы определения высокомолекулярных белков (полипептидов). Методы определения полипептидов в пиве весьма разнообразны. Ниже приводятся наибо­лее распространенные из них.

Определение коагулируемого белка [107]. В этом методе определяются высокомолекулярные полипептиды, свертывающиеся при нагревании. Количе­ство коагулируемых азотистых веществ зависит от продолжительности и характера кипячения, поэтому должны строго соблюдаться определенные условия проведения анализа. Для кипячения можно использо­вать поваренную соль (40 г соли на 1 л воды), но соль неудобна тем, что она кристаллизуется на стенках бани. Лучше применять глицериновую баню, температура ко­торой поддерживается на одном уровне (108° С), или проводить кипячение на плитке с асбестовой сеткой. '

По Де Клерку [107] в колбу Кьельдаля на 500—' 800 мл вносят 100 мл сусла или пива, освобожденного' от углекислоты, и кипятят 3 ч с обратным холодильни­ком. Фильтруют содержимое колбы через фильтр диа­метром 11 или 12,5 см и промывают колбу и фильтр че­тырехкратно (по 20 мл) горячей кипяченой водой. При этом свернувшиеся белки остаются на стенках колбы. Вносят в колбу фильтр с осадком и сжигают по Кьель­далю. Сжигают отдельно такой же фильтр и содержа­ние азота в нем вычитают из значения его в главном опыте.

Однако не будет принципиальной ошибкой, если сжигать не осадок, а фильтрат после отделения скоагулированного белка, учтя разведение за счет промыва­ния фильтра. В этом случае можно брать 50 мл сусла и пива, а объем фильтрата довести до 100 мл.

Определение коагулируемого азота часто дает полез­ную информацию о предполагаемой стойкости пива. Считают, что с уверенностью говорить о хорошей стой­кости пива можно только в том случае, если количе­ство коагулируемого азота в нем не более 0,5 мг/100 мл.

Определение предела осаждения суль­фатом аммония [33, 107]. Методика проведе­ния этого несложного определения хорошо известна. По Гартонгу анализ выполняется следующим образом. Берут ряд пробирок с 10 мл пива, в которые добавля­ют насыщенный раствор сульфата аммония в повышаю­щихся количествах: 0,5; 0,6; 0,7 мл и т. д., перемешива­ют и через 15 мин рассматривают в проходящем свете. Объем сульфата аммония, который требуется для того, чтобы вызвать в пиве опалесценцию, характеризует предел осаждения. Результаты выражают в мл на 10 мл пива (иногда, в частности в СССР, предел осаж­дения выражают в мл на 100 мл пива). Обычно значе­ния предела осаждения лежат между 0,5 и 2,5 мл/10 мл. Стойкое пиво дает значения 1,5 мл и бо­лее на 10 мл.

Необходимо отметить, что визуальное установле­ние появления мути может быть источником ошибок. Нарцисс и Рёттгер [165] показали, что только самое первое легкое помутнение обусловливают вещества с молекулярной массой>60 ООО, если же добавлять суль­фат аммония до несколько более сильного помутнения, то в этом случае осаждаются уже вещества меньшей молекулярной массы. Необходимо учитывать также, что вещества полисахаридной природы, имеющие доста­точно высокую молекулярную массу, также выпадают в осадок при добавлении к пиву сульфата аммония.

Вариант более объективного, инструментального определения помутнения, возникающего от добавления сульфата аммония, предложен Симмондсом [218] и за­ключается в следующем. 200 мл пива, отмеренные ци­линдром, вносят в бутылку из бесцветного стекла вме­стимостью 300 мл и добавляют к нему 50 мл (при 27° С) насыщенного раствора сульфата аммония. Бу­тылку плотно закрывают, тщательно встряхивают и помещают в водяную баню температурой 30° С. Через 30 мин измеряют мутность в чувствительном нефело­метре (например, в мутномере фирмы «Радиометр»).

Однако и для этого варианта метода остаются в силе соображения о возможности возникновения помут­нения, вызванного веществами полисахаридной при­роды.

Басаржова и др. [85] разработали объективные ме­тоды определения веществ, высаливающихся насы­щенным раствором сульфата аммония, с помощью различного типа нефелометров. Предварительно по формазиновым суспензиям известной мутности (от 0,5 до 12 ед. ЕВС) строят калибровочные кривые. Один из вариантов метода заключается в следующем. В ряд пробирок вносят по 10 мл пива, освобожденного от СО₂, и добавляют туда же в повышающихся количествах на­сыщенный раствор сульфата аммония. В контроле к ряду пробирок с 10 мл пива добавляют такое же коли­чество воды. Измеряют мутность на ФЭКН при длине волны 570 нм. Измерение проводят через 15 мин после добавления сульфата аммония, причем в кювету раст­вор переносят за 2 мин до истечения 15 мин для того, чтобы раствор в кювете устоялся. Измерение делают против контроля.

Насыщенный раствор сульфата аммония готовят так, чтобы при температуре 20° С в 100 г раствора на­ходилось 43 г безводного сульфата аммония, а после от­стаивания раствора в течение 48 ч на дне колбы оста­вались нерастворившиеся кристаллики сульфата ам­мония. Если при приготовлении раствор оказывается мутным, его надо после 3—4 дней отстаивания тща­тельно профильтровать.

Авторы указывают следующее соотношение между результатами анализа и стойкостью пива:

пиво нестабилизированное показывало мутность 2 ед. ЕВС при добавлении 0,5—1,25 мл раствора сульфата аммония;

пиво, стабилизированное низкими дозами стаби­лизирующих средств и имевшее стойкость 3—4 мес, давало мутность 2 ед. ЕВС при добавлении 2,75 мл раствора сульфата аммония;

пиво со стойкостью до 6 мес. показывало мутность 2 ед. ЕВС при добавлении 3 мл раствора сульфата ам­мония;

пиво со стойкостью до 8 мес, сильно стабилизирован­ное, давало мутность 2 ед. ЕВС при добавлении 3,5 мл раствора.

Однако далеко не всегда удается установить такую тесную корреляцию между показателями «сульфат­ного теста» и стойкостью пива.

Осаждение полипептидов пива пикри­новой кислотой (реакция Эсбаха). Реактив Эс­баха готовится следующим образом: 12,5 г пикрино­вой кислоты растворяют в кипящей дистиллированной воде, добавляют 25 мл ледяной уксусной кислоты и объем доводят до 100 мл. Отмечают количество реак­тива (в миллилитрах), достаточное для возникновения помутнения в пиве. Расчет ведется в миллилитрах реак­тива на 10 мл пива. Этот реактив осаждает не только высокомолекулярные белки, но и среднемолекулярные полипептиды (молекулярная масса 4600).

Фракционирование азотистых веществ сусла и пива по Лундину и Шрёдерхай- му [107]. Этот метод позволяет разделить азотистые вещества сусла и пива на 3 фракции: фракция А — вы­сокомолекулярные полипептиды, осаждаемые опреде­ленным количеством танина; фракция В — полипептиды средней молекулярной массы, осаждаемые фосфомолиб­деновой кислотой; фракция С — низкомолекулярные азотистые вещества (аминокислоты и пептиды), остаю­щиеся в фильтрате после удаления осадка, образован­ного фосфомолибденовой кислотой. На коллоидную стойкость влияют вещества фракции А, более стойкое пиво содержит небольшое количество этих веществ.

Фракционирование по Лундину требует большой затраты времени и труда.

Определение высокомолекулярных белков с помощью краски Амидошварц 10 В. Клоппер [142] разработал метод определения вы­сокомолекулярных белков (полипептидов) в сусле и пиве по связыванию ими краски Амидошварц 10В. Ме­тод основан на том принципе, что высокомолекулярные азотсодержащие вещества образуют с красителегл нерастворимые соединения. Величина снижения опти­ческой плотности раствора Амидошварца пропорцио­нальна количеству высокомолекулярных полипепти­дов.

Определение проводится следующим образом. 5 мл сусла или пива вносят в центрифужную пробирку, до­бавляют 20 мл раствора красителя (примерно 440 мг/л, точная дозировка устанавливается по экстинкции раст­вора, содержащего 10 мг/л, которая должна быть 0,568 при 590 нм в кювете 10 мм). После перемешива­ния оставляют на 30 с, затем центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. 5 мл надосадочной жидкости перено­сят в 50 мл мерную колбу, доводят до метки и переме­шивают. В контроле 5 мл воды смешивают с 20 мл раст­вора Амидошварца и разводят в соотношении 1 : 10. При длине волны 590 нм в кювете 10 мм определяют оптическую плотность контроля и сравнивают с опыт­ным раствором. Была найдена хорошая корреляция (7=0,815) полученных значений с фракцией А по Лундину.

Все методы определения высокомолекулярных поли­пептидов пива могут использоваться для оценки дейст­вия того или иного стабилизатора, но они не дают «сколько-нибудь значительной корреляций с фактической коллоидной стойкостью пива.

Очень показательны в этом отношении результаты, полученные Греем и др. [71] еще в 1953 г. (табл. 73).

Таблица 73

Результаты анализов на содержание в пиве высокомолекулярных полипептидов и стойкость пива

* Мутность измерялась после 10 нед хранения при 30° С и суточного выдерживания при 0° С.

Данные табл. 73 показывают, что в пиве, .обработан­ном бентонитом, значительно снижено содержание ве­ществ, осаждаемых сульфатом аммония и пикриновой кислотой, однако заметное улучшение стойкости полу­чено только с очень большой дозой этого стабилиза­тора. Наоборот, в пиве, обработанном ферментным препаратом, количество этих веществ уменьшено не­значительно, однако стойкость пива очень высокая. Ав­торы работы считают, что полученные результаты ука­зывают на селективность и специфичность действия ферментов.

В настоящее время установлено, что появление кол­лоидного помутнения обусловлено не всей совокуп­ностью высокомолекулярных полипептидов пива, а только какой-то частью их. Полагают, что это те поли­пептиды, которые имеют наибольшее сродство с поли­фенолами.

Определение белков, чувствительных к танину. Начало такого рода исследованиям было положено Финком и Вилднером [114]. Первая часть их работы касалась осаждения белков сусла и пива тани­ном: как ведут себя различные белки сусла и пива при добавлении танина, осаждаются ли более или менее равномерно все группы белковых веществ или есть ка­кие-то группы, вступающие в реакцию с танином в боль­шей степени. К пробам сусла или пива добавляли раст­вор танина различной концентрации и оставляли на оп­ределенное время. Образующийся осадок или муть от­фильтровывали и определяли азот в осадке и все фор­мы азота в фильтрате. Исходили из концентрации тани­на, которая применяется на практике для стабилизации пива, — 10 г/гл.

В табл. 74 приведены данные по количеству осажда­емых различными концентрациями танина азотистых веществ сусла и пива. Отношение сусла или пива к раствору танина было 9:1.

Таблица 74

Осаждение различных азотистых веществ сусла танином

С повышением концентрации раствора танина коли­чество осаждаемых азотистых веществ во всех фракци­ях увеличивается. Наибольшее участие в образовании осадка с танином в сладком сусле принимает фракция коагулируемого белка, которая уменьшается на 87% при обработке 1%-ным раствором танина, затем пепто­ны и альбумозы. В пиве, как показывают данные табл. 75, соотношение было иное.

Осаждение танином различных азотистых веществ пива

В пиве в реакцию с танином вступает преимущест­венно фракция альбумоз, которая уменьшается на 73% при обработке 0,25%-ным раствором танина, затем коа­гулируемый белок, уменьшающийся при такой обработ­ке почти наполовину.

В результате исследований авторы предложили но­вый аналитический метод более глубокой характерис­тики белков пива — определение количества белка, оса­ждаемого танином. Под термином «таниновое число», предложенным этими авторами, понимается процент об­щего азота, осаждаемого 0,1%-ным (таниновое число I) или 0,2%-ным (таниновое число II) растворами танина в определенных условиях. Авторы считают, что танино­вое число характеризует содержание в пиве белковых веществ, влияющих на его стойкость, и может быть одним из показателей пригодности пива для пастериза­ции. Исследовали влияние разных факторов на характер образующегося осадка.

Окончательная пропись метода была следующей. К 180 мл освобожденного от СО₂ пива добавляют 20 мл 0,2%-ного раствора танина и ставят при температуре 10—12° С.

Через 1 ч фильтруют через двойной складчатый фильтр до прозрачности (обычно достаточно 2 раза). По 50 мл фильтрата сжигают по Кьельдалю.

Шапон предложил метод оценки количества белка, чувствительного к танину, путем добавления к пиву 0,1% галлотанина и нефелометрирования образующего­ся помутнения [159].

Посада и др. [190] разработали такой метод: в бу­тылку с пивом вместимостью 0,2 л добавляют опреде­ленное количество свежеприготовленного раствора гал- лотаниновой кислоты из расчета 5 г на 1 л пива и бу­тылку 1,5 ч встряхивают. Разница в нефелометрических показаниях до обработки и после нее характеризует галлотаниновую муть.

Метод Томпсона и Форварда [233]. К 180 мл пива, находящегося в кювете с длиной грани 55 мм при 20° С, добавляют при постоянном перемеши­вании свежеприготовленный раствор галлотаниновой кислоты концентрацией 100 мг/л. Скорость добавления 4,5 мл/ч. Когда концентрация галлотаниновой кислоты достигнет 5 мг/л, измеряют мутность в нефелометре Хелма. Из полученных результатов вычитают началь­ную мутность и получают значение галлотаниновой му­ти пива. Расчеты показывают, что на 180 мл пива надо добавить 0,4 мг галлотаниновой кислоты, т. е. 9 мл раствора в течение 2 ч.

Авторы считают, что этот метод может быть полезен в установлении небольших различий во фракции поли­пептидов, чувствительных к танину, которые трудно оп­ределить какими-либо другими методами.

Метод ВНИИПБПа. Во ВНИИПБПе разрабо­тан простой и быстрый метод определения количества высокомолекулярных полипептидов, способных реагиро­вать с танином [62]. При разработке метода исходили из соотношений ингредиентов, принятых в методе Лундина при определении фракции А.

В мерную колбу на 50 мл вносят 2,5 мл пива, осво­божденного от углекислоты, добавляют примерно 25— 30 мл дистиллированной воды, затем 5 мл 10%-ного раствора H₂SO₄ и 5 мл 1,6%-ного раствора танина. До­водят объем до метки дистиллированной водой и пере­ливают содержимое в колбу вместимостью 250—300 мл. Через час, тщательно перемешав суспензию танино-по- липептидного осадка, ее нефелометрируют на ФЭКН. При проведении анализа необходимо следить за тем, чтобы температура растворов и посуды была около 20° С (±2). С помощью этого метода была прослежена динамика изменения количества высокомолекулярных полипептидов пива под влиянием различных фермент­ных препаратов и изучено действие разных стабилизи­рующих средств.

В настоящее время результаты, получаемые по это­му методу, могут быть выражены прямо в величине фракции А по Лундину. Формула пересчета, рассчитан­ная Калашниковой с помощью ЭВМ по 192 определени­ям, имеет вид:

у = — 0,0450,0276х,

где (/ — таниновый показатель, опт. плотн.;

х — фракция А, мг/100 мл.

Методы определения содержания в пиве полифено­лов. До настоящего времени нет достаточно адекватно­го метода определения в сусле и пиве полифенолов, участвующих в образовании коллоидного помутнения. Это связано с тем, что при определении, например, толь­ко антоцианогенов остаются неохваченными многие ве­щества, также участвующие в помутнении. При опреде­лении же всей совокупности полифенолов получают ма­лозначимую информацию, поскольку многие полифено­лы не имеют отношения к помутнению.

Ниже приведены некоторые из методов определения полифенолов, наиболее широко используемых зарубеж- ними исследователями и наиболее приемлемых для практического осуществления.

Метод Овэйдеса, Рубина и Бреннера [176]. Этот метод основан на экстракции дубильных веществ этилацетатом и измерении светопоглощения на спектрофотометре. Предварительно строятся калибро­вочные кривые для дубильных веществ хмеля и солода.

Дубильные вещества солода получают следующим образом. Приготовляют конгрессное сусло, 300 мл его упаривают примерно до 100 мл и 1 н. раствором НС1 устанавливают pH 2,0. Проводится трехкратная экс­тракция дубильных веществ 100 мл этилацетата. Из этилацетатного раствора вода удаляется безводным сульфатом натрия. Этилацетат выпаривают на водяной бане и сухой остаток переводят в метанол, объем ко­торого доводят до 50 мл. В части раствора гравимет­рически определяют содержание дубильных веществ. С различными разведениями этого раствора строят ка­либровочную кривую. Максимум экстинкции лежит между 265—275 нм.

Определение дубильных веществ в пиве проводят в следующем порядке. В 50 мл градуированный цилиндр вносят 5 мл пива, освобожденного от СО₂, и 5 мл н. НС1. Объем доводят до 25 мл, затем добавляют изооктан до 50 мл. Смесь сильно встряхивают 30 с, затем переносят в делительную воронку и оставляют до хорошего раз­деления фаз. Водный раствор отделяется (примерно 22—23 мл), а изооктановый слой выбрасывается. Из водного раствора 10 мл вносят в делительную воронку и экстрагируют 50 мл этилацетата в течение 10 с. После хорошего разделения фаз водную фазу сливают и вы­брасывают. К этилацетатному экстракту добавляют без­водный сульфат натрия для удаления следов влаги. Рас­твор декантируют в 100 мл колбу. Этилацетат пол­ностью удаляют на водяной бане. Колба остается еще на 30 мин на водяной бане для полного удаления следов этилацетата. Остаток растворяют метанолом, причем производят 3 последовательные экстракции примерно по 3 мл метанола, метаноловые экстракты переносят в мерную колбу на 10 мл, в которой уже содержится 0.5 мл н. НС1. Доводят объем метанолом до 10 мл. Экстинкция этого раствора измеряется против контроля — 0,5 мл н. НС1 + 9,5 мл метанола.

Пфеффер [181], проверяя этот метод, нашел, что этилацетат экстрагирует и другие вещества, кроме ду­бильных, что завышает результаты гравиметрического определения при построении калибровочной кривой. Он установил наличие в этилацетатных экстрактах белка (до 14% в экстрактах из пива), что объясняется экс­тракцией белково-полифенольных комплексов. Макси­мумы поглощения дубильных веществ пива лежат около 263—280 нм, причем они выражены слабее, чем у рас­твора танина и катехина (у танина — при 276 нм, у ка­техина— при 278 нм).

Согава [219] считает этот метод достаточно простым, чувствительным и воспроизводимым. Он полагает, что, поскольку этилацетат сам по себе имеет большую адсорбцию при 270 нм, лучше проводить определение при 283 нм, так как при этой длине волны этилацетат совершенно прозрачен. Была рассчитана удельная ад­сорбция танина е[^=69,9 и полифенолов пива = 21,7. Пользуясь этими данными, рассчитывали содер­жание полифенолов по кривой, построенной по раство­рам танина.

Метод Стоуна и Грэя [по 181]. Этот метод является модификацией метода Де Клерка и др. [107], которым еще и сейчас пользуются в некоторых иссле­довательских и производственных лабораториях. Метод основан на колориметрическом определении интенсив­ности красного окрашивания, которое дают полифенолы с солями трехвалентного железа в щелочной среде. Определение велось в визуальном компараторе и коли­чество полифенолов определялось по стандартному рас­твору танина.

К пробам сусла или пива добавляют раствор гумми­арабика для предотвращения образования мути. Так как оптимум окраски лежит при pH 9, pH пробы пива устанавливается на эту величину разведенным ам­миаком. Расчет ведется по растворам танина известной концентрации.

В 25 мл мерную колбу вносят 10 мл раствора гумми­арабика (12,5 г гуммиарабика центрифугируют в 90 мл Н₂О), 10 мл испытуемой пробы и встряхивают. Добав­ляют 0,5 мл реактива, содержащего 2,5 г лимонно­кислого железо-аммония в 100 мл воды и 0,01%-ный раствор фенилртутного ацетата, и перемешивают. До­бавляют 5 мл разведенного NH₃ (1:2) и встряхивают. Отмечают время, доводят водой до 25 мл и точно через 5 мин фотометрируют.

Пфеффер проводил определение на спектрофотометре при 530 нм. Всего на каждое определение делается 4 из­мерения: А — проба с железным реагентом; В —проба без железного реагента; С—вода с железным реаген­том; D — вода без железного реагента. Содержание ду­бильных веществ (в мг) находят по формуле: (А—В) — (C — D)F. Коэффициент F берется по кривой, построенной по растворам танина.

Пфеффер отмечает, что если при определении ду­бильных веществ пользоваться коэффициентом, получен­ным по кривой для танина, то получаются заниженные результаты. Это объясняется тем, что различные дубиль­ные вещества дают различную окраску, причем танин дает с железом значительно более интенсивную окраску, чем дубильные вещества хмеля и особенно пива. Анто­цианогены дают примерно такую же по интенсивности окраску, как и танин, катехин — значительно слабее. Если на растворе танина А = 0,294, то на растворе кате­хина F=0,893.

Метод Гарриса и Рикеттса [128]. Опре­деляемые по этому методу антоцианогены включают все вещества, которые при нагревании с кислотой образуют красные пигменты — антоцианидины. Антоцианогены полностью адсорбируются на нейлоне, и адсорбат рас­творяется в смеси бутанол—НС1 и нагревается. Анто­цианогены переводятся в окрашенные антоцианидины. По интенсивности возникающей окраски определяют со­держание антоцианогенов.

Определение проводят в следующем порядке. 10 мл пива без СО₂ встряхивают 40 мин с 0,5 г нейлона. Встряхивание не должно продолжаться дольше, так как интенсивность образования окраски снижается. Нейлон отфильтровывают, отмывают водой от пива и раство­ряют в 15 мл смеси «-бутанол — НС1 (5:1). Реакцион­ная смесь нагревается до 105° С, причем каждые 3 мин встряхивается до тех пор, пока не образуется прозрач­ный раствор красного цвета. После этого температура выдерживается еще 30 мин. После охлаждения прозрач­ный пурпурно-красный раствор доводится смесью бу­танол — НС1 до 25 мл, интенсивность окраски изме­ряется на спектрофотометре при 550 нм. Из-. получен­ного значения вычитается значение, полученное в кон­трольном опыте, в котором вместо пива берется вода:. Если экстинкция выше 0,550, пиво надо развести. При адсорбции на нейлоне наблюдаются потери, которые- могут быть объяснены полимеризацией и образованием хинонов. Калибровочная кривая строится по определен­ным количествам лейкоцианидина, добавляемого к пиву.. Калибровочная линия не прямая.

Интенсивность образующейся окраски зависит от- наличия катализаторов (железо, медь) и от образования коричневого пигмента при нагревании с HCI, поэтому концентрация НС1 должна быть по возможности низ­кой. Влияние железа исключается добавлением к рас­твору бутанол — НС1 определенного количества железа (10 мг/л).

Метод Штайнера и Штокера [225] (в мо­дификации Пфеффера). Этот метод также основывается: на превращении антоцианогенов в антоцианидины по­средством обработки минеральной кислотой. Но в этом методе не производится адсорбция антоцианогенов, анто­цианогены определяются прямо в пиве. Пиво содержит довольно много веществ, которые при обработке смесью бутанол — НС1 образуют коричневые пигменты. По­скольку было установлено участие этих веществ в хо­лодном помутнении, определение их является положи­тельным моментом.

Смесь 5 мл пива, 2 мл концентрированной НС1, содержащей 0,001% железа, 10 мл бутанола, нагревают 30 мин на кипящей водяной бане и после охлаждения доводят бутанолом объем ее до 25 мл. Измерение про­изводится при 550 нм. Метод может быть применен: только для светлого пива.

Метод Макфарлана [155]. В этом методе вместо нейлона в качестве адсорбента применяется по­рошок PVP (Поликлар АТ). Адсорбированные веще­ства растворяются в растворе п-метил-2-пирролидона и НС1, содержащем сульфат железа, и посредством на­гревания переводятся в антоцианидины.

154 мг FeSO₄-7H2O растворяют в 100 мл концен­трированной НС1. К Ю мл этого раствора добавляют 70 мл концентрированной НС1 и водой доводят до 100 мл. Две части свежеперегнанного п-метил-2-пирро- лидона смешивают с 1 частью раствора FeSO₄ —HCI. Получаемый раствор содержит 10 мг Fe/л и может хра­ниться 1 мес. 100 мг PVP вносят в градуированную 15 мл центрифужную пробирку. Добавляют 5 или 10 мл лива без СО₂ (в зависимости от ожидаемого количества антоцианогенов — больше или меньше 50 мг/л). Про­бирку закрывают увлажненной резиновой пробкой и встряхивают в течение 30 мин, перед удалением пробки содержимое пробирки для оседания пены несколько мщ- нут центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают и остаток PVP промывают водой. К осадку добавляют 10 мл растворителя, перемешивают стеклянной палоч­кой, которую затем промывают бутанолом. Нагревают лробирку 30 мин в кипящей водяной бане. После охлаж­дения доводят объем смеси бутанолом до 15 мл и сильно перемешивают стеклянной палочкой. Центрифугируют 10 мин при 2500 об/мин. Надосадочную прозрачную жидкость красно-фиолетового цвета измеряют при 550 нм. Калибровочная линия по методу Макфарлана, которая строится по растворам цианидина, представляет собой прямую. При этом отмечается пропорциональ­ность между количеством взятого на анализ пива и экстинкцией. Так как калибровочная по этому методу идет значительно круче, количество антоцианогенов, рассчитанное по методу Гарриса и Рикеттса, примерно в 1,5 раза выше, чем по методу Макфарлана.

Метод Франкен-Люикс [116]. Этот метод основывается на реакции между катехином и молибде­новой кислотой, при которой возникает красное окра­шивание. Поскольку антоцианогены также определяются этим методом, то анализ дает сведения о содержании важнейших полифенольных веществ, участвующих в об­разовании мути (т. е. о таниногенах).

Для анализа 10 мл пива вносят в колбу, добавляют 1 мл 1,5 М фосфатного буфера (pH 7,2), 1 мл 1%-ного раствора сульфата натрия, 1 мл 2%-ного раствора молибдата натрия и 1 мл воды и все тщательно пере­мешивают. Измерения осуществляют в течение 10 мин при 400 нм.

Пфеффер несколько модифицировал метод, а именно: вместо 1 мл 1,5 М фосфатного буфера использовал .2 мл 0,75 М буфера и воду уже не добавлял.

Этот метод очень прост и достаточно точен. Тем не менее должны быть проведены глубокие исследования в направлении изучения специфики окраски в резуль­тате реакции с различными веществами полифенольной природы. В частности, необходимо установить, зависит ли интенсивность образующейся окраски от степени по­лимеризации полифенолов.

Во ВНИИПБПе было проверено влияние мелано- идинов на определение таниногенов методом Франкен- Люикс. Были испытаны растворы меланоидинов, выде­ленных Тихомировой и Беленькой из пива, а также рас­творы модельных меланоидинов, полученных из глицина и глюкозы. Проверка показала, что ни те, ни другие меланоидины не влияют на определение.

Методы Еруманиса [137]. Еруманис разработал и предложил аналитическому комитету ЕВС два ва­рианта метода определения общего количества поли­фенолов, основанного на реакции этих веществ с ли­моннокислым железо-аммонием (III) в щелочной среде.

По 1-му варианту метода реагенты готовят следую­щим образом:

1. В миксер вносят 10 г чистой натриевой соли КМЦ (карбоксиметилцеллюлозы), 2 г ЕДТА (этилендиамин­тетрацетат, динатриевая соль) и примерно 500 мл ди­стиллированной воды. Все тщательно перемешивают до растворения всех комочков. Переносят количественно в литровую мерную колбу и доводят объем дистилли­рованной водой до метки. Нерастворенные частички удаляют центрифугированием.
2. Для приготовления железного реагента 2,5 г коричневого цитрата железо-аммония (III) растворяют в 100 мл 0,1%-ного раствора уксуснокислой ртути.
3. Аммиак (концентрированный) разводят 2 объема­ми дистиллированной воды.

Для приготовления контрольного образца в бюретку вносят 10 мл дистиллированной воды, открывают кран и дают части воды стечь для удаления воздуха из крана. Кран закрывают, когда в бюретке останется 3—4 мл Н₂О. Вводят в бюретку слой ваты примерно высотой 5 мм и осторожно выравнивают ее стеклянной палочкой. Затем также вводят слой стеклянной ваты (5 мм). Отвешивают 120 мг Поликлара АТ и смывают его медленно дистиллированной водой в бюретку. После того как вода сойдет из бюретки, колонку осторожно промывают водой (примерно 8 мл), затем осторожно по стенке бюретки наливают 10 мл дегазированного пива, открывают кран и дают пиву стекать в мерную колбу на 25 мл. Промывают колонку трижды по 1,5 мл дистиллированной воды. В мерную колбу с пивом до­бавляют 8 мл реагента 1, встряхивают, добавляют 0,5 мл железного реагента 2, перемешивают и добав­ляют 0,5 мл реагента 3. После перемешивания доводят объем смеси дистиллированной водой до метки, снова перемешивают и измеряют оптическую плотность при 525 нм против дистиллированной воды.

Одновременно с контролем в мерную колбу на 25 мл вносят пипеткой 10 мл пива и добавляют те же реагенты и в той же последовательности, что и в контроле. Через 10 мин измеряют оптическуйэ плотность при 525 нм про­тив дистиллированной воды в 10 мл кювете.

Разница между оптической плотностью в главном опыте и в контрольном после умножения на коэффи­циент 630 дает содержание полифенолов в 1 л пива (в мг). Коэффициент получен из калибровочных кривых, построенных по полифенолам солода, хмеля и пива.

По 2-му варианту метода (более простому) пиво освобождают от СО2. Мутное пиво или сусло осветляют центрифугированием.

10 мл пива и 8 мл реагента 1 (КМЦ) вносят пипет­ками в одну мерную колбу на 25 мл, тщательно пере­мешивают, добавляют 0,5 мл железного реагента 2, перемешивают, добавляют 0,5 мл реагента 3 и снова перемешивают. Доводят объем водой до метки и пере­мешивают. Через 10 мин измеряют оптическую плот­ность в 10 мл кювете при 600 нм против дистилли­рованной воды.

Контроль I —в мерную колбу на 25 мл вносят 10 мл пива и 8 мл реагента 1, добавляют 0,5 мл реагента 3, доводят до метки и через 10 мин измеряют оптическую плотность так же, как и в главном опыте.

Контроль II — вместо пива берут 10 мл дистилли­рованной воды, остальное проводят все так же, как и в контроле I.

Содержание полифенолов (в мг/л) находят по фор­муле:

[Л —(В + С)] 820,

аде А,—оптическая плотность раствора в главной* опыте;”

В—то же, в контроле I;

С — тоже, в контроле II.

Еруманис установил, что на определение полифено­лов влияют меланоидины, редуцирующие сахара, цис­теин и аскорбиновая кислота. В варианте 2 эти веще­ства не принимаются во внимание, в варианте 1 влияние этих веществ исключено. Однако аналитический коми­тет ЕВС принял именно второй вариант для широкой проверки и апробации.

Для определения антоцианогенов Еруманис рекомен­дует метод Макфарлана с небольшими модификациями. Он отмечает, что при определении антоцианогенов с помощью цветной реакции с кислотой при нагревании интенсивность окраски снижается в том случае, если антоцианогены полимеризованы. Следовательно, интен­сивность окраски пропорциональна не количеству анто­цианогенов, а в значительной степени их полимериза­ции. В то же время определение общего количества полифенолов по реакции с железом не зависит от сте­пени полимеризации полифенолов: были получены иден­тичные значения при определении простых и конденси­рованных полифенолов. Отсюда следует, что отношение общего количества полифенолов к количеству антоциа­ногенов, определенному нагреванием в кислой среде, будет тем больше, чем более полимеризованы анто­цианогены. Еруманис предложил обозначать это отно­шение как индекс полимеризации, причем он отмечает, что определение только одних антоцианогенов бесцельно. Определение только тогда имеет смысл, когда одно­временно производится определение общих полифенолов.

Эти соображения Еруманиса могут быть применимы только в случае определения антоцианогенов методами, основанными на нагревании их в кислой среде (т. е. методами Гарриса и Рикеттса, Макфарлана и др.). Если же антоцианогены определяются другими мето­дами, для которых не установлена зависимость от сте­пени полимеризации, соотношение значений общих поли­фенолов и антоцианогенов указывает только на долю антоцианогенов (и катехинов) в общем количестве по­лифенолов. В этом случае лучше определять процентное содержание антоцианогенов от общего количества поли­фенолов.

По нашему мнению, вряд ли правильно трактовать изменение в количестве антоцианогенов только с точки зрения их полимеризации. Это изменение может отра­жать различие в качественном составе полифенольных веществ.

Басаржова и Черна [84] сравнили несколько методов определения полифенолов и показали, что наименьшее количество полифенолов дает 1-й вариант метода Еру- маниса, как более точный и специфичный. На данные других методов влияют, очевидно, вещества неполи- фенольной природы, присутствующие в сусле и пиве. Но 2-му варианту метода Еруманиса в сусле опреде­ляется на 11—25%, а в пиве на 32% больше полифе­нолов, чем по 1-му варианту. Содержание антоциано­генов, определяемое методом Гарриса и Рикеттса, со­ставляет 23—26% от полифенолов, определенных по 2-му варианту метода Еруманиса.

Метод Дадика [105]. Существенным моментом нового метода определения в пиве таниногенов — кате­хинов и антоцианогенов — является то, что в нем учи­тывается различие в абсорбции при двух длинах волн (455 и 545 нм) окрашенных продуктов, образующихся из катехинов и антоцианогенов при нагревании со спир­товым раствором НС1. Лейкоцианидин при нагревании со смесью пропанол (бутанол) — НС1 (5:1) образует пигмент с наибольшим максимумом при 545 нм и не­большим максимумом при 455 нм. d ( + )-Катехин, обра­ботанный таким же образом, дает пигмент с наибольшим максимумом при 455 нм и небольшим максимумом при 545 нм. С помощью этого метода было определено коли­чество таниногенов в 6 фракциях, полученных десорби­рованием адсорбата из 100 мл пива на Нейлоне-66. Суммарное количество таниногенов составило 150 мг/л, причем преобладали производные катехина.

Метод Нг и Мосека [172]. Метод основан на осаждении полифенолов уксуснокислым свинцом в кис­лой и щелочной среде. Предварительно таким же спо­собом выделяют полифенолы пива и используют их для построения калибровочной кривой после анализа образующегося осадка на полипептиды, полисахариды и минеральные вещества. Количество полифенолов рас­считывали по разнице между массой осадка и содер­жанием в нем указанных выше веществ.

Точно отмеренные 100 мл пива выливают в 400 мл ацетона при энергичном перемешивании, центрифуги­руют и надосадочную жидкость концентрируют в ва- куум-испарителе при 35° С примерно до 60 мл. Добав­ляют к полученному концентрату 5 мл насыщенного водного раствора уксуснокислого свинца, центрифуги­руют и полученный осадок обозначают как кислый. Доводят pH надосадочной жидкости до 8,5 концентри­рованным NaOH, центрифугируют и надосадочную жидкость выбрасывают, осадок обозначают как ще­лочной.

Добавляют к кислому осадку примерно 40 мл про­мытой смолы Dowex 50 Н+, осторожно перемешивают и выливают в 100 мл этилацетата, 10 мин перемешивают и центрифугируют. Повторяют то же самое с порцией 50 мл этилацетата, собирают и объединяют фильтраты. Упаривают фильтраты в ротационном испарителе до сухой массы при 35° С и растворяют в 10 мл метанола. Полученную фракцию называют кислой.

Добавляют к щелочному осадку примерно 80 мл сухой смолы Dowex 50 Н+ и приготовляют щелочную фракцию так, как описано приготовление кислой фракции.

Для проведения цветной реакции выбран окраши­вающий реагент, который имеет наименьшее взаимо­действие с белками и углеводами, — 4-аминоантипирин.

В мерную колбу на 10 мл вносят 0,5 мл кислой или щелочной фракции, добавляют 1 мл 15%-ного NH₄OH, 0,5 мл 2%-ного водного раствора 4-аминоантипирина и 0,5 мл 2%-ного водного раствора КзРе(СМ)₆. Объем доводят водой до 10 мл. Сосуд хорошо встряхивают и оставляют стоять 45 мин. Приготовляют контроль та­ким же образом, но без образца фракций. Оптическую плотность определяют при 550 нм. Расчет ведут по ка­либровочной кривой.

Было найдено, что количество полифенолов в кислой фракции колебалось от 10,4 до 20,3 мг/100 мл пива, в щелочной — от 34,3 до 42,0 мг. Отмечалась значитель­ная разница в окраске: кислая фракция давала корич­невую окраску, щелочная — красную. Эта окраска со­ответствовала стандартам — катехину и сиреневой кис­лоте соответственно. Следовательно, полифенолы в двух фракциях существенно различны: в кислой содержатся й основном флавоноидные вещества, в щелочной — фе­ноловые кислоты.

Полученные этим методом значения трудно сравни­вать с величинами, определяемыми другими методами, поскольку в большинстве методов не учитываются ве­щества, содержащиеся в щелочной фракции. В трех образцах канадского пива этим методом было найдено 678, 786 и 593 мг/л полифенолов, что значительно выше обычно указываемых в литературе.

Методы, основанные на определении интенсивности помутнения пива на холоде. Несмотря на большое число методов определения полипептидов и полифенолов в пиве, необходимых для оценки действия стабилизаторов, ни один из них не дает отчетливой корреляции с факти­ческой коллоидной стойкостью пива. По мнению многих исследователей, наиболее адекватные результаты дают методы, основанные на измерении холодного помут­нения.

Часто с этой целью используют простой метод: пиво в бутылке или разлитое высоким столбиком в пробирки, плотно закрытые резиновыми пробками, помещают в воду со льдом, а сосуд с водой ставят в холодильник. Точно через 24 ч измеряют помутнение пива с по­мощью мутномера, если определение проводится на бутылочном пиве, или на ФЭКН, быстро определяют мутность пива в пробирках. В последнем случае трудно избежать ошибки, связанной с возможным небольшим нагреванием пива при определении. Но для быстрой сравнительной оценки склонности различных образцов пива к помутнению на холоде этот простой метод вполне применим. Нефелометрические показания ФЭКН могут быть прокалиброваны или по формазиновому стандарту, или по большому числу параллельных определений на мутномере и ФЭКН.

Свежеразлитое пиво не всегда дает заметное обра­зование мути после 24-часовой выдержки при 0° С. Это объясняется тем, что растворимость имеющихся в пиве полипептидно-полифенольных комплексов еще велика, поскольку в этих комплексах участвуют малополимери- зованные, достаточно простые полифенолы.

Шапон [97, 159] предложил способ, которым можно выявить склонность пива к образованию мути уже на ранних стадиях его хранения. К пробам пива добавляютот 1 до 6%' этилового спир­та и помещают их в специ­альный рефрижераторный нефелометр при темпера­туре —8° С. Через 40 мин проводят измерение. Шапон считает, что эта проба при­водит к осаждению сущест­вующих в пиве комплексов, концентрация которых еще недостаточна для образова­ния мути при 0° С. Он пола­гает также, что такая проба может быть характеристи­кой пива с точки зрения возможной стойкости. Раз­ные образцы пива дают раз­личное помутнение при до­бавлении спирта и охлаж­дении до —8° С (рис. 40), причем более пологая кри­вая свидетельствует о высо­кой стабильности пива.

Рис. 40. Интенсивность помутнения различных образцов (1—4) охлажденного пива при добавлении этилового спирта.

Французские исследова­тели [159] собрали данные по 10 заводам за год и рассчитали коэффициент корре­ляции между двумя параметрами: мутностью пива че­рез 6 мес и показателем в тесте «спирт — холод» по Шапону. Коэффициент корреляции (г— 4-0,655) ока­зался высокозначимым. На рис. 41, взятом из работы этих авторов, показаны кривые помутнения нескольких образцов одного и того же пива, подвергнутого различ­ной стабилизирующей обработке.

Недостатки метода Шапона состоят в том, что для его осуществления требуется специальное, довольно сложное оборудование; в нем не находит отражения процесс изменения полифенолов, происходящий при длительном хранении или при тепловом воздействии (пастеризация).

Попытки учесть последнее обстоятельство делаются в так называемых ускоренных тестах, или тестах на ускорение старения пива. Эти тесты заключаются в вы­держке пива при высокой (40—60° С) и низкой (0°С) температурах. При разработке этих способов исходят из той предпосылки, что выдержка пива при высокой тем­пературе должна значительно усилить те процессы (главным образом окислительную и катализируемую кислой средой конденсацию полифенолов), которые мед­ленно протекают в пиве при хранении в условиях ком­натной температуры.

Рис. 41. Влияние этилового спирта на помутнение охлажденного до —8° С пива:

1 — необработанного; 2 — обработанного танином; 3 — протеолитическим фер­ментом; 4 — обоими стабилизирующими средствами.

Наиболее широко используются два варианта про­ведения ускоренного теста. В первом чередуется вы­держка бутылочного пива в течение 24 ч при 40 или 60° С и при 0°С. После холодной выдержки измеряют мутность с помощью соответствующего нефелометра. Наиболее часто для этой цели применяют Haze Meter. Такое чередование нагревания — охлаждения продол­жают до тех пор, пока мутность пива не станет равна 2 ед. ЕВС. Результаты проверки выражают числом цик­лов нагревания.

Второй вариант ускоренного теста, официально при­нятый комитетом ЕВС в 1963 г., состоит в том, что 5 или 6 бутылок с пивом помещают при 40° С (нестаби- лизированное пиво) или при 60°С (стабилизированное пиво) на 7 сут, после чего переносят их на 24 ч при О³ С и измеряют возникающее помутнение на Haze Meter. В этом случае результаты проверки выражаются прямо в единицах мутности ЕВС. Стойкое пиво должно при таком анализе давать мутность не более 2 ед. ЕВС.

Сокращенно этот анализ обозначают так: (7/1— 40° С/0°С).

Использование различной температуры для опытного (стабилизированного) и контрольного пива встречает возражение со стороны многих исследователей, причем большинство считают более приемлемой температуре 40° С.

Эти тесты дают весьма ценную информацию. Молль и др. [159] рассчитали коэффициент корреляции между прозрачностью пива через 6 мес (у) и результатами теста 7/1—40°С/0°С (х).

Уравнение регрессии имело вид: t/=0,82 + 0,29x.

Коэффициент корреляции (г=+0,695) был высокозначимым.

Пересчет данных ускоренных тестов на фактическую стойкость пива сопряжен с большими трудностями. На­пример, при пересчете числа циклов по первому ва­рианту ускоренного теста предлагаются различные коэф­фициенты, которые позволяют пересчитать число циклов в дни стойкости. Шильд и др. предлагают коэффи­циент 22. Так, если пиво выдерживает 8 циклов, то оно будет прозрачным (+/2 ед. ЕВС мутности) 176 дней, т. е. почти 6 мес.

Польские исследователи [221] предлагают следую­щую формулу для пересчета числа циклов в дни стой­кости:

Х=[(2 — a)l(b-a) + K\Z,

где X —действительная стойкость пива, дни;

а и b — мутность пива соответственно при предпоследнем и послед­нем определениях, ед. ЕВС;

К — число «теплых суток» до предпоследнего определения мут­ности пива.

Более или менее точные результаты получаются в том случае, если каждый завод предварительно уста­новит для своего пива коэффициент Z в этой формуле. Для исследованных образцов пива с 6-месячным гаран­тийным сроком стойкости, стабилизированных разными препаратами, значение Z колебалось в пределах 6,1—20,1 и в среднем составляло 11,2.

Недостатком ускоренных тестов ЕВС является то, что определение в них производится довольно дли­тельно — по второму, официальному, способу — за 8 дней. Чехословацкие исследователи [82] разработали более быстрый метод «шока», пользуясь которым можно по­лучить представление о коллоидной стойкости пива уже через 33 ч. Способ заключается в том, что не менее 3 бутылок пива помещают при 0° С на 6 ч, затем после быстрого подогревания примерно до 40° С оставляют бутылки при 66° С на 16 ч, охлаждают до 20° С и снова помещают при 0° С на 6 ч, после чего измеряют мут­ность.

Во ВНИИПБПе разработан и применяется [64] ва­риант лабораторного метода «ускоренного теста», кото­рый заключается в том, что пиво, разлитое высоким столбиком, почти под пробку, в пробирки, закрытые резиновыми пробками, помещают на 2 сут при темпе­ратуре 40° С, затем на сутки при 0° С, после чего на ФЭК.Н измеряют возникающее помутнение. Сокращенно анализ обозначается как 2/1—40°С/0°С.

Помимо длительности «ускоренных тестов», многие ученые считают их вообще не правомерными, поскольку, как отмечает Шапон, при 40 и 60° С могут ускоряться не только те реакции, которые медленно протекают при комнатной температуре, но могут возникать новые, не­свойственные обычным условиям хранения реакции. Тем не менее эти методы в настоящее время дают наиболее адекватную информацию о состоянии коллоидных си­стем пива и о склонности его к помутнению.

Химические способы определения коллоидной стой­кости пива. Метод Штайнера [224]. К 0,5 л пива добавляют 1 мл 40%-ного формальдегида, оставляют стоять 4 ч при 20° С, затем 3 ч при 0°С, после чего измеряют мутность, выражая ее в единицах ЕВС.

Данные этого метода сравнивали с данными двух гестов: 1) пиво выдерживали 2 сут при 40° С, затем на 24 ч помещали при 0°С; 2) пиво выдерживали 14 сут при 20° С, после чего также на сутки помещали при 0°С. В табл. 76 приведены результаты, полученные при­мерно по 100 образцам пива в каждом тесте на двух сортах пива.

Коэффициенты корреляции между данными форма­линового метода, с одной стороны, и данными методов 2/1—40°С/0°С и 14/1—20°С/0°С, с другой, оказались высокозначимыми и равнялись для специального пива + 0,639 и +0,720, для нормального пива +0,686 и + 0,761 соответственно. Расчеты показывают, что быст­рый формалиновый метод позволяет за 7 ч с высокой степенью вероятности оценить поведение пива после суточного охлаждения спустя 2 нед хранения. К сожа­лению, отсутствуют данные о корреляционной зависи­мости между данными этого метода и коллоидной стойкостью пива после более длительного срока его хранения.

Сравнение методов

Цинхониновый метод Томсона и Фор­варда [233]. Метод основан на свойстве полимеризо­ванных полифенолов образовывать нерастворимые ком­плексы с алкалоидами. С помощью перекиси водорода и пероксидазы производят быстрое окисление, полифе­нолов пива и после добавления раствора сульфата цинхонина измеряют на нефелометре образующуюся муть. Таким образом в методе учитываются легкоокис- ляемые полифенолы.

К 40 мл пива добавляют 160 мл воды и измеряют мутность (Я]) в кювете 55 мм в нефелометре Хелма. К другим 40 мл пива добавляют по каплям с постоян­ным перемешиванием 1 мл Н2О2 (0,2 М, приготовляется перед использованием). Через 1 мин после добавления перекиси вносят по каплям 0,4 мл свежеприготовлен­ного раствора пероксидазы хрена (0,04%) и оставляют на 30 мин. Затем добавляют 160 мл насыщенного рас­твора сульфата цинхонина (1,7%, профильтрованный через стеклянный фильтр), тщательно перемешивают и через 1 ч измеряют мутность (Я₂). Количество окис­ляемых полифенолов равно разности Я₂ и Я] и выра­жается в единицах Хелма.

Количество полифенолов в пиве, способных к взаимо­действию с сульфатом цинхонина, можно определить таким же образом, исключив стадию окисления. Тем­пература мало влияет на определение. Этим методом анализировали два типа пива — светлое и темное, ста­билизированное и нестабилизированное (табл. 77).

Таблица 7

Анализ пива цинхониновым, методом

Значительное улучшение стойкости сопровождается сильным снижением количества окисляемых полифено­лов и уменьшением содержания антоцианогенов. Была установлена обратно пропорциональная зависимость между цинхониновой мутью (количеством окисляемых полифенолов) и стойкостью пива (рис. 42).

Недостаток метода в том, что сульфат цинхонина — труднодоступное вещество.

Методы оценки окислительно-восстановительных свойств пива. Окислительно-восстановительные свойства пива отражают состояние его окисленности и имеют непосредственное отношение к стойкости.

Количество редуцирующих веществ, обусловливаю­щих окислительно-восстановительные свойства пива, определяют по скорости обесцвечивания (восстановле­ния) пивом определенного количества индикатора 2,6-ди- хлорфенолиндофенолята натрия: чем больше в пиве редуцирующих веществ, тем быстрее обесцвечивается добавленный индикатор. Если же пиво подвергалось окислительным воздействиям, в результате которых часть редуцирующих веществ оказалась окисленной, обесцвечивание индикатора происходит медленнее.

Таким образом, скорость восстановления индикатора является мерой концентрации и природы восстанавливающих веществ в данном образце пива. Для измерения степени окисленности пива и характеристики его вос­станавливающей способности предложен ряд методов, основанных на восстановлении этого индикатора.

Рис. 42. Соотношение между стойко­стью и цинхониновой мутью

Методом ITT (Indicator Time Test) устанавливают время (в секундах), которое требуется для полного обесцвечивания некоторого количества раствора инди­катора, добавленного к определенному объему пива [13]. Чем больше величина ITT, т. е. чем медленнее обесцве­чивается индикатор, тем сильнее окислено пиво и тем меньше в нем веществ, обладающих сильной восста­навливающей способностью. На определение не влияет присутствие растворенного кислорода, однако при силь­ной аэрации пива значение ITT изменится (увеличится). В присутствии аскорбиновой кислоты измерять ITT не­возможно — индикатор обесцвечивается мгновенно.

Клоппер предложил другой метод определения окис­лительно-восстановительного состояния пива под назва­нием «метод редокститрации». В этом методе опреде­ляют количество обесцвеченного индикатора за опре­деленное время (20 с). Результаты выражают в микро- грамм-эквивалентах (микровалях) веществ, обладающих сильной редуцирующей способностью.

Некоторые исследователи применяют такой вариант метода, в котором прослеживается динамика восстанов­ления индикатора. В методе Де Клерка с сотрудниками

[107] и Главачека [133] отмечается количество восста­новленного (обесцвеченного) индикатора (в процентах или микрограммах) за 15 с, 5 мин и 15 мин. По мнению исследователей, обесцвечивание за эти отрезки времени производится разными веществами, обладающими раз­личной восстанавливающей способностью (см. с. 107).

Беленькая и Тихомирова [9] предложили еще один вариант метода определения окислительно-восстанови­тельного состояния пива. Метод является модификацией! метода Штайнера, в котором с помощью спектрофото­метра определяется процент обесцвечивания 2.6-дихлор- фенолиндофенолята натрия в течение определенного) времени после прибавления красителя к пиву.

В предлагаемом методе учтено влияние pH пива на- цвет индикатора. Готовят буферные растворы с pH! 3,5 —6,5 и к 10 мл каждого раствора добавляют 0,25 мл 0,005 М раствора красителя. Измеряют на ФЭК опти­ческую плотность этих растворов — D_o— (светофильтр 6, кювета 10 мм) против воды. Строят калибровочную кривую значений D_o от величины pH (калибровочная имеет вид прямой линии).

К 10 мл исследуемого образца пива прибавляют 0,25 мл 0,005 М раствора красителя. Через 60 с после добавления растворов измеряют оптическую плотность в тех же условиях — D_x. Для сравнения используют сусло (пиво), к которому не прибавляют красителя. Затем измеряют pH пива и по калибровочной кривой находят величину D_o. Рассчитывают процентное обес­цвечивание красителя (ПОК), которое является вели­чиной, пропорциональной содержанию в пиве быстро восстанавливающих веществ (редуктонов).

Во ВНИИПБПе несколько видоизменили этот метод и прослеживали динамику восстановления (обесцвечи­вания) красителя на протяжении 10 мин, снимая пока­затели оптической плотности опытного образца через каждую минуту. На рис. 43 приведена динамика из­менения ПОК в двух образцах пива, выдержанных после розлива 2 сут при температуре 25 или 40° С. Снижение величины ПОК в последнем образце пива свидетель­ствует о прошедших в нем окислительных процессах.

Рис. 43. Динамика восстановления индикатора в зависимости от темпе­ратуры хранения пива.

Методы определения окислительно-восстановитель­ных свойств пива несложны и легко выполнимы в лю­бой заводской лаборатории. С их помощью можно полу­чить данные о степени окисленности пива для принятия соответствующих технологических решений с целью уменьшения контакта с воздухом. Методы непосредст­венного определения содержания воздуха в пиве на различных стадиях его изготовления более сложны и трудно выполнимы в заводских лабораториях.

Из обширного перечня методов для практического использования в заводских' лабораториях могут быть в настоящее время рекомендованы следующие: 1) изме­рение мутности в мутномерах (с. 220); 2) определение количества высокомолекулярных полипептидов, способ­ных реагировать с танином (метод ВНИИПБПа) (с. 235); 3) определение таниногенов по Франкен-Люикс (с. 240); 4) определение полифенолов по Еруманису (с. 241); 5) определение интенсивности помутнения пива на холоде (с. 246); 6) ускоренные тесты на холодную муть (с. 247); 7) определение окислительно-восстанови­тельного состояния пива по Беленькой и Тихомировой (с. 254).                                      4

Для более полного микробиологического контроля рекомендуется использовать питательные среды, прописи которых приведены на с. 221—226.