No module Published on Offcanvas position

УСКОРЕННЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА В МУКЕ ПО БИУРЕТОВОЙ РЕАКЦИИ

Биуретовая реакция заключается в способности белков образовывать комплексное окрашенное соедине­ние с ионом меди. Интенсивность возникающей при этом окраски легко определяется с помощью фотоэлектроколо­риметра.

Навеску муки 1,5 г взвешивают на аналитических ве­сах, помещают в сухую коническую колбу на 250—300 мл, снабженную пробкой, и обрабатывают 2 мл четыреххло­ристого углерода, добиваясь при этом полного смачивания. Затем добавляют 100 мл модифицированного биуретового реактива, закрывают колбу пробкой, энергично встряхивают ее в течение 60 мин, после чего вытяжку центрифу­гируют 10 мин при 4500 мин-1. В прозрачном центрифугате определяют оптическую плотность при длине волны 550 нм в кювете с длиной рабочей грани 5 мм.

Для расчета содержания белка строят калибровочную кривую по обезжиренной лиофилизированной или высу­шенной под вакуумом клейковине, используя 18 навесок клейковины массой от 0,120 до 0,375 г, что соответствует содержанию белка в муке от 8 до 25% с интервалом в 1 %.

Данный метод не применим для анализа темноокрашен­ных веществ. Для этого пригоден метод Лоури.

Реактивы. 1. Четыреххлористый углерод. 2. 10 н. рас­твор гидроксида калия. 3. Сегнетовая соль. 4. Сульфат меди. 5. Модифицированный биуретовый реактив. 15 мл 10 н. раствора КОН и 25 г сегнетовой соли (стабилизатора меди) растворяют в 900 мл дистиллированной воды. 30 мл 4%-но­го CuS04 медленно добавляют при постоянном помешивании и доводят объем до 1 л.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА РАСТВОРИМОГО БЕЛКА В МУКЕ ПО ЛОУРИ

В основе определения лежит реакция восстановле­ния реактива Фолина медными производными белка с обра­зованием окрашенных продуктов реакции. Интенсивность возникающей окраски измеряют с помощью фотоэлектро­колориметра. Метод применяют для определения белка в растворах с концентрацией 10—100 мкг.

В пробирку вместимостью 15—20 мл вносят 0,4 мл ис­следуемого раствора белка, добавляют 2 мл реактива С и энергично перемешивают. Через 10 мин добавляют 0,2 мл реактива Е, снова тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Интенсивность воз­никшего синего окрашивания измеряют на фотоэлектро­колориметре при красном светофильтре или на спектро­фотометре при длине волны 750 нм.

Концентрацию белка определяют с помощью калибро­вочного графика. Его строят по данным ряда точно приго­товленных белковых растворов. Для построения графика следует брать кристаллический препарат чистого белка, не имеющего отношения к изучаемому белку (например, несколько раз перекристаллизованный препарат яичного альбумина).

Реактивы.

  1. Реактив А (2%-ный раствор карбоната натрия в 0,1 н. растворе гидроксида натрия).
  2. Реактив В (0,5%-ный раствор сульфата меди в 1%- ном растворе тартрата натрия — калия). Растворяют 10 г тартрата натрия — калия в 300 мл дистиллированной воды и в полученный раствор добавляют 5 г сульфата меди. После растворения объем доводят дистиллированной водой до 1 л.
  3. Реактив С (49 мл реактива А, смешанные с 1 мл реак­тива В). Готовят перед анализом.
  4. Реактив Фолина. В круглодонную колбу вместимостью 1,5—2 л вносят 100 г фольфрамата натрия (Na2W04- 2Н20), 25 г молибдата натрия (Na2Mo0420) и растворяют их в 700 мл дистиллированной воды. К раствору добавляют 50 мл 85%-ной ортофосфорной кислоты (Н3Р04) и 100 мл концентрированной соляной кислоты. К колбе присоеди­няют обратный холодильник и смесь кипятят на сетке в те­чение 10 ч. После окончания кипячение в колбу вносят 150 г сульфата лития, добавляют 50 мл дистиллированной воды и 5 капель бромной воды. Смесь кипятят без холодиль­ника 15 мин под тягой для удаления избытка брома.

Раствор охлаждают до комнатной температуры, объем доводят водой до 1 л, а затем фильтруют и хранят в темной склянке с притертой пробкой. Чтобы определить кислот­ность полученного раствора, некоторое количество реакти­ва разбавляют 10 раз и титруют 0,1 н. раствором гидрок­сида натрия по фенолфталеину.

  1. Реактив Е. Готовят из реактива Фолина, разводя его дистиллированной водой до тех пор, пока концентра­ция кислоты в нем не будет равна 1 н. Например, если при титровании реактива Фолина оказалось, что его кис­лотность равна 2,5 н., то для приготовления реактива Е необходимо взять 10 мл реактива Фолина и 15 мл дистилли­рованной воды. Реактив Е можно хранить длительное время.
  2. Препарат электрофоретически чистого белка. 100 мг белка растворяют в 100 мл 0,1 н. NaOH. Для приготовле­ния разбавленных растворов берут 0,5—8 мл приготовлен­ного раствора и доводят до 10 мл водой. В каждой колбе определяют белок по указанной выше прописи.

В связи с тем, что приготовление реактива Фолина очень сложно, а его хранение — неудобно, учитывая также то обстоятельство, что реактив с течением времени меняет свои свойства, Л. П. Маслов с сотрудниками разрабо­тал взамен его гетерополисоединение (ГПС) типа 18-вольфрамомолибдо-2-фосфата, которое при определении бел­ков описанным методом дает такие же результаты.

Сравнительными определениями установлено, что при­менение ГПС предпочтительнее реактива Фолина, так как при одинаковой правильности результатов точность ана­лиза выше.

Методика получения реактива ГПС (NH4)6 [P2WnMo,Oe2] следующая. В 100 мл воды растворяют 29 г вольфрамата натрия и 13,5 г молибдата натрия. Полученный раствор до­водят до кипения и по каплям прибавляют смесь 27,5 мл 85%-ной фосфорной и 21 мл 36,5%-ной соляной кислоты. По мере прибавления этой смеси кислот бесцветный кипя­щий раствор приобретает желто-оранжевую окраску. Не охлаждая его, объем реакционной смеси доводят водой до 250 мл и кипятят еще 5 ч в термостойкой колбе с обрат­ным холодильником при постоянном объеме.

После охлаждения к реакционной смеси добавляют 1—2 мл насыщенного раствора хлористого аммония, отде­ляют небольшое количество нерастворимого осадка, к ма­точному раствору прибавляют 50 г кристаллического хло­ристого аммония и отфильтровывают ГПС.

Полученное ГПС представляет собой однородные кристал­лы желто-оранжевого цвета, хорошо растворимые в воде с образованием желтых растворов, сильно поглощающих свет в ультрафиолетовой области спектра при 220—280 нм. Раствор ГПС так же , как и реактив Фолина, окрашивается с восстановителями в синий цвет и поглощает свет в области 500—700 нм. Избыток щелочи мешает выполнению анализа.

В связи с тем, что реактив Фолина содержит значитель­ный избыток свободных кислот, при выполнении определе­ний с реактивом ГПС 0,5 н. раствор карбоната натрия заменяют 0,1 н. раствором. Раствор ГПС готовят разбав­лением 2 г ГПС в 100 мл воды.

Определение проводят на приборе ФЭК-60 при 670 нм (светофильтр№ 6) при толщине рабочего слоя кюветы 10 мм.