Протеолитические ферменты в растительном сырье, как правило, представлены различными молекулярными формами, называемыми изоферментами. Последние отли­чаются химическими и физическими особенностями, но катализируют одну и ту же реакцию. Поэтому для опре­деления суммарного эффекта действия всех имеющихся в объекте исследования протеаз, а также выявления особен­ностей их действия в различных условиях (pH и темпера­тура) изучение проводят в автолитических пробах.

Определение по интенсивности гидролиза белков муки. Две параллельные навески муки по 5—10 г помещают в конические колбы вместимостью по 100 мл, добавляют в каждую по 40 мл дистиллированной воды, 20 мл фосфатно­го буфера pH 5,5 и 0,5 мл толуола, а затем ставят в термостат при температуре 35° С на 48 ч. Контрольный опыт проводят с предварительно инактивированными ферментами, для чего две аналогичные навески муки с прибавленной водой ки­пятят в течение 3—5 мин. После охлаждения с контроль­ными колбами поступают так же, как и с опытными. По окончании термостатирования содержимое фильтруют в мерные колбы вместимостью 100 мл каждая, доводят до метки и в 10—20 мл фильтрата определяют содержание аминного азота любым методом.

Для получения характеристики активности ферментов во времени колбы е автолитическими смесями выдерживают в термостате различные сроки (3; 6; 9; 12; 24; 48 и 72 ч). Для изучения активности ферментов при различных значениях pH среды в колбах с помощью фосфатного буфера создают разные значения pH субстрата (4,5; 5,0; 5,5; 6,2; 7,1; 8,0; 9,2 и т. д.). В зависимости от предполагаемой актив­ности ферментов колбы термостатируют 24—48 ч. Актив­ность выражают в миллиграммах аминного азота, обра­зовавшегося в течение 1 ч в пересчете на 1 г белка или муки.

Определение при действии протеолитических ферментов муки на «чужой» субстрат. Этот метод позволяет дифферен­цировать активность ферментов, находящихся в растворе и в адсорбированном состоянии на поверхности твердых частиц вещества. В качестве субстрата используется 10%- ный раствор пептона.

10 г муки тщательно растирают в фарфоровой ступке с битым стеклом в присутствии небольшого количества воды до получения однородной кашицы, количественно пере­носят в мерную колбу вместимостью 200 мл, прибавляют 0,5 мл толуола и настаивают при комнатной температуре в течение 2 ч, периодически взбалтывая. Закончив наста­ивание, содержимое колбы доводят до метки и после актив­ного перемешивания фильтруют.

В 4 колбы вместимостью по 100 мл каждая вносят по 10 мл фильтрата и добавляют по 20 мл воды. Затем в две из них вносят 10 мл фосфатного буфера с pH 5,5; 2 мл толуола и 10 мл 10%-ного раствора пептона, закрывают пробками и помещают в термостат при 37° С на 48 ч. В содержимом двух оставшихся колб, являющихся контрольными, инак­тивируют ферменты 3-минутным кипячением, после чего добавляют буфер, толуол, а также раствор субстрата итер- мостатируют таким же образом, как и опытные колбы.

По окончании термостатирования пробы кипятят З мин для инактивирования ферментов, переносят содержимое их в мерные колбы вместимостью по 100 мл и после доведения до метки определяют в каждой из них количество амин­ного азота.

Активность протеолитических ферментов выражают в миллиграммах аминного азота, образовавшегося за 1 ч в пересчете на 1 г белка или муки.

Определение методом автолиза водно-мучных суспен­зий по Н. Ф. Покровской. Активность протеолитиче­ских ферментов муки определяют путем автолиза водомуч­ной смеси при температуре 40° С.

В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 10 г ис­пытуемой муки, 40 мл воды и после тщательного размеши­вания оставляют в термостате при 40° С на 4 ч для автолиза. Затем осаждают оставшиеся белки добавлением 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, конечная концентра­ция которой в колбе должна составлять 4%. Смесь доводят до метки дистиллированной водой, фильтруют и в фильт­рате определяют азот методом Лоури или Кьельдаля. Прово­дят контрольный опыт, в котором протеолитические фер­менты инактивируют добавлением 4%-ной трихлоруксус­ной кислоты до автолиза.

О протеолитической активности ферментов муки судят по приросту азота в рабочем опыте по сравнению с конт­рольным.

Определение азота аминокислот по числу карбоксиль­ных групп. В водно-спиртовых растворах аминокислоты и полипептиды ведут себя как кислоты и могут быть опре­делены титрованием щелочью.

К 5 мл водного гидролизата белка прибавляют 50 мл 96%-ного этилового спирта, 4—5 капель индикатора тимолфталеина и оттитровывают до появления синего окрашивания 0,1 н. раствором гидроксида калия. Из ко­личества щелочи, израсходованной на титрование, вычи­тают результат титрования холостой пробы (вода, спирт, индикатор) и, умножая разность в объемах на титр 0,1 н. щелочи по азоту (0,001 42 г/мл), определяют количество азота в пробе (в граммах).

Если необходимо отдельно определить азот амино­кислот и полипептидов, то проводят два титрования в50%- ном спирте по фенолфталеину оттитровывают полипептиды и 28% аминокислот, а в 90%-ном спирте — все амино­кислоты и пептиды. Для расчета количества щелочи, из­расходованной на титрование отдельно аминокислот и по­липептидов, составляют два уравнения:

А = у + 0,28Х;

В = у + Х,

откуда

Х = (В — А) - 100/72; у = В — Х.

Здесь А — количество щелочи, израсходованное на тит­рование в растворе 50%-ного спирта, мл; у — количество щелочи, необходимое для оттитровывания полипептидов, мл; X — количество щелочи, необходимое для титро­вания присутствующих в растворе аминокислот, мл; В — количество щелочи, затраченное на титрование в 90%-ном спирте, мл.

Реактивы. 1. Фосфатная буферная смесь с pH 5,5. 2. То­луол. 3. 10%-ный раствор пептона. 4. Измельченное хими­ческое стекло. 5. Этанол 96%-ный. 6. 0,1 н. раствор гидро­ксида калия. 7. Раствор тимолфталеина (0,1 г в 125 мл эта­нола).