Фермент липоксигеназа катализирует окисление высокомолекулярных ненасыщенных жирных кислот — линолевой, линоленовой, арахидоновой и других до пере­кисей и гидроперекисей.

Г. Г. Дубцовым и М. П, Поповым разработан спектро­фотометрический метод определения активности липоксиге- назы. Сущность его заключается в учете образующихся перекисных соединений по характерному им поглощению света при 234 нм.

Вытяжку фермента приготовляют следующим образом. 5 г испытуемой муки перемешивают со 100 мл дистиллиро­ванной воды с помощью мешалки при частоте вращения 3000 мин^-1 в течение. 5 мин и фильтруют. Так как актив­ность вытяжки быстро снижается, ее следует готовить в день опыта.

Л. Я. Ауэрман и соавторы установили, что водо­растворимая часть липоксигеназы зерна составляет в сред­нем около 86%, а в муке —только около 54% от общей активности фермента. Поэтому они предложили определять общую липоксигеназную активность в суспензии (ЛАо_бщ) и в вытяжке (ЛА_раств). В этом случае суспензию отбирают после 5 мин перемешивания, не выключая мешалку, а оставшуюся суспензию фильтруют. Фильтрат используют для определения водорастворимой части липоксигеназы.

Субстратом служит смесь жирных кислот, выделенных из подсолнечного масла. Для его приготовления 50 г рафи­нированного подсолнечного масла растворяют при нагре­вании в 50 мл 96%-ного этилового спирта. Отдельно раст­воряют при нагревании 15 г гидроксида калия в 10 мл воды, и этот раствор разбавляют 50 мл 96%-ного спирта. Оба.раствора нагревают до начала кипения. Щелочной рас­твор вливают в раствор масла. Эту смесь перемешивают, нагревая ее до полного разложения мыла. Жирные кислоты отделяют в делительной воронке и промывают несколько раз горячей водой.

Липоксигеназа пшеницы оптимально действует в слабо­кислой среде. Для получения гомогенного субстрата вносят 0,5 мл реактива Твин-40 в 10 мл боратного буфера с pH 9,0, затем по каплям добавляют 0,5 мл смеси жирных кис­лот, активно перемешивают и добавляют 1,3 мл раствора 1 н. гидроксида натрия. Раствор доводят до 100 мл боратным буфером. В таком виде субстрат можно хранить в хо­лодильнике в течение недели.

Активность фермента определяют так. Непосредственно перед определением субстрат разбавляют 2,5 частями воды и подкисляют до слабокислой среды. В коническую колбу вносят 10 мл подкисленного субстрата и 1 мл суспензии (при определении ЛА_общ) или вытяжки фермента (при оп­ределении ЛА_раств). Через 10; 20 и 30 мин из колбы отби­рают по две параллельные пробы (0,5 мл-каждая) и пе­реносят в пробирки, содержащие 4,5 мл 96%-ного этило­вого спирта. В отобранных пробах определяют оптическую плотность на спектрофотометре СФ-4Аили СФ-16 при длине волны 234 нм. Контролем служит проба, в которой к 10 мл субстрата вместо фермента добавлен 1 мл воды.

Так как между концентрацией продуктов реакции и их светопоглощением существует линейная зависимость, то результаты определения активности липоксигеназы выра­жают величиной оптической плотности. За показатель ак­тивности липоксигеназы обычно принимают увеличение оптической плотности субстрата за 20 мин реакции.

Реактивы. 1. Рафинированное растительное масло. 2. 96%-ный этиловый спирт. 2. Гидроксид калия. 4. Твин- 40. 5. Боратный буфер с pH 9,0. 6. 1 н. раствор гидроксида натрия.