Амилолитическую активность АС определяют по степени гидролиза крахмала до декстринов ферментами испытуемого препарата. За единицу амилолитической ак­тивности принято такое количество фермента, которое ка- ализирует гидролиз 1 г крахмала при 30° С в течение 1 ч . строго определенных условиях. Количество расщепленного крахмала не должно превышать 30% от исходного. В дан­ном методе процесс декстринирования не доводится до ста­дии получения неокрашивающихся йодом веществ.

Количество крахмала, подвергнувшегося гидролизу, устанавливают по изменению его окраски с йодом, которую измеряют с помощью фотоэлектроколориметра.

Для точности определения необходимо строго соблюдать условия проведения ферментативной реакции: температура 30° С, pH среды для грибных препаратов 4,7, для бакте­риальных 6,0, продолжительность реакции 10 мин, концен­трация субстрата 1 %, объем реакционной смеси 15 мл (10 мл субстрата и 5 мл ферментного раствора).

Техника определения следующая. В две пробирки (диаметром 2 и высотой 18 см) вносят по 10 мл 1%-ного раствора крахмала и темперируют их в ультратермостате при 30° С 10—15 мин. Затем, не вынимая из термостата, в пробирку, которая будет служить контрольной, добавляют 5 мл дистиллированной воды, во вторую — опытную — 5 мл ферментного раствора. Содержимое пробирок быстро и тщательно перемешивают и помещают для выполнения гид­ролиза в ультратермостат точно на 10 мин (по секундо­меру).

В две конические колбочки набирают по 50 мл основно­го раствора йода и тотчас после окончания ферментации крахмала из пробирок отбирают по 0,5 мл реакционной смеси и вносят их в колбочки. Содержание колб перемеши­вают, фермент при этом инактивируется, а содержимое колб в результате йод-крахмальной реакции окрашивается: контрольная проба — в синий цвет, опытная — в фиоле­товый различной интенсивности (в зависимости от количест­ва непрогидролизованного крахмала).

Оптическую плотность полученных окрашенных растворов измеряют сразу после смешивания на фотоэлектро­колориметре при красном светофильтре (λ = 656 нм) при длине рабочей грани кюветы 1 см. Контрольным раствором при колориметрнровапии является дистиллированная вода, Отсчет снимают по красной шкале левого барабана при­бора.

Оптическая плотность контрольного раствора, характе­ризующая количество взятого для определения крахмала, обозначается буквой Д1 (она должна быть не менее 0,7). Оптическая плотность опытного раствора Д₂ характеризует количество крахмала и декстринов в реакционной смеси,

Количество прогидролизованного крахмала С, г, оп­ределяют из уравнения

С = (Д₁-Д₂).0,1/Д₁.

Если эта величина меньше 0,02 или больше 0,07, то анализ повторяют при другом разведении ферментного раствора.

Так как ферменты грибных и бактериальных препара­тов специфичны по действию на крахмал, то и расчет их активности различен.

Амилолитическая активность АС, ед/г, рассчитывается по приведенным ниже уравнениям.

Из плесневых грибов:

АС = (7,264С — 0,03766) • 1000/р;

из бактериальных:

АС = (5,885С + 0,001671) • 1000/р.

Здесь С — количество крахмала, прогидролизованного в период реакции, г; р — количество ферментного препа­рата, взятого для анализа, мг.

Чтобы выразить АС в международных единицах — (мкмоль/мин)/г, следует полученный результат умножить на 103, так как 1 г/ч прореагировавшего крахмала со­ставляет 103 мкмоль/мин. Например, для определения АС ферментного препарата грибного происхождения приго­товили исходный раствор в мерной колбе вместимостью 100 мл, внеся туда 0,1 г препарата. Для приготовления ра­бочего ферментного раствора взяли 2 мл исходного и разбавили его до 200 мл водой. Ферментную реакцию проводили с 5 мл рабочего раствора, который содержал

n = 0,1 • 2 • 5 • 1000/(100 • 200) — 0,05 мг препарата.

Оптическая плотность контрольного раствора крахмала Д₁ — 0,71, а опытного Д₂ = 0,385. Отсюда количество гид­ролизованного крахмала

С = (0,71 —0,385)0,1/0,71 = 0,045 77 г.

Амилолитическая активность препарата

АС = (7,264 • 0,04577 — 0,03766) 1000/0,05 = 5896 ед/г.

Реактивы.

1. Основной раствор йода. 0,5 г металлического йода по­мещают в бюкс с притертой крышкой и растворяют в 2 мл дистиллированной воды в присутствии 5 г йодида калия. После полного растворения йода раствор переносят в мерную колбу вместимостью 200 мл с притертой пробкой и объем доводят до метки дистиллированной водой. Основной рас­твор хранят в темноте и используют в течение 1 месяца.
2. Рабочий раствор йода. Получают разбавлением 2 мл основного раствора 0,1 н. соляной кислотой в мерной колбе до 100 мл. Оптическая плотность при колориметрировании на ФЭК, (длина грани кюветы 1 см, светофильтр синий X = 453 нм) должна быть 0,160. В случае отклонения от этой величины ее приводят к необходимой добавлением- нескольких капель 0,1 н. НС1 или основного раствора йода.
3. Ацетатный буферный раствор (pH 4,7). Раствор А — 1 н. раствор уксусной кислоты: 57,25 мл (60,12 г) ледяной уксусной кислоты или 58,63 мл (61,22 г) уксусной кислоты в 1 л.

Раствор Б — 1 н. раствор ацетата натрия.: 136,09 крис­таллического или 82 г безводного CH₃COONa в 1 л.

Для получения буферного раствора с pH 4,7 смешивают в равных, количествах растворы А и Б, а для получения раствора с pH 4,6 смешивают 17 мл раствора Л с 10 мл раст­вора Б.

4. Фосфатный буферный раствор (pH 6,0). Для при­готовления буфера используют растворы гидроортофос­фата натрия — 11,376 г/л и дигидроортофосфата калия — 9,078 г/л, смешивая их в соотношении 1 : 9. pH проверяют на потенциометре.
5. 1%-ный раствор крахмала. 1 г навески сухого веще­ства растворимого картофельного крахмала переносят в в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют 25 мл во­ды и после перемешивания еще добавляют 25 мл воды. За­тем колбу помещают в кипящую водяную баню на 15 мин, непрерывно помешивая до полного растворения крахмала. Содержимое колбы охлаждают при помешивании и добавля­ют 10 мл буферного раствора (ацетатного с pH 4,7 при ана­лизе грибных пли фосфатного с pH 6,0 при анализе бакте­риальных препаратов) и содержимое колбы доводят до метки дистиллированной водой.

Для проверки оптической плотности полученного раствора к 10 мл его добавляют 5 мл дистиллированной воды, хорошо перемешивают и 0,5 мл переносят в коническую колбочку, в которую вносят также 50 мл рабочего раствора йода. Оптическую плотность окрашенного раствора опре­деляют на фотоэлектроколориметре в кювете с длиной грани 1 см при красном светофильтре (λ= 656 нм). Опти­ческая плотность должна быть не менее 0,7.