Кроме стандартного метода (ГОСТ 20264-2—74), требующего применения сложных реактивов, протеолити­ческую активность можно определить описанными ниже методами.

Интерферометрический метод. Этот метод разработан во ВНИИФСП (Всесоюзном научно-исследовательском ин­ституте ферментной и спиртовой промышленности). В нем степень гидролиза белка под действием протеолитических ферментов исследуемых препаратов определяется с по­мощью интерферометра ИТР-2 по разности показателей преломления светового луча, проходящего через испытуе­мый и контрольный раствор.

За единицу протеолитической активности принимают такое количество ферментного препарата, которое катали­зирует расщепление 1 г белка в строго определенных ус­ловиях: при температуре 30° С, pH среды 7,0, продолжи­тельности протеолиза 30 мин, постоянном соотношении субстрат — фермент, обеспечивающем гидролиз белка за 30 мин на 50% с образованием продуктов, неосаждаемых трихлоруксусной кислотой.

Активность ферментных препаратов определяют по спе­циально выведенному уравнению, в котором количество расщепленного белка характеризуется показателем интер­ферометра. Полученную величину пересчитывают на 1 г исследуемого препарата и выражают его активность в условных единицах. В качестве субстрата используют 1%-ный раствор казеина.

Техника определения следующая. В пробирку диаметром 20 мм и высотой 180 мм вносят 10мл 1 %-ного раствора казеи­на и прогревают в ультратермостате при температуре 30 ±0,2° С в течение 10 мин. Затем, не вынимая пробирки из термостата, добавляют в нее 5 мл ферментного раствора, перемешивают и оставляют на 30 мин для протеолиза. Протеолиз прекращают добавлением при перемешивании 10 мл 4%-ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), при этом также осаждаются нерасщепленные белки и высо­комолекулярные продукты протеолиза. Осаждение производится в том же термостате на протяжении 15 мин.

Для контрольного опыта используют те же реактивы, но в другом порядке. В аналогичную пробирку вносят 10 мл 4%-ного раствора ТХУ, добавляют 5 мл ферментного раствора, перемешивают и выдерживают 5 мин для инакти­вации фермента. Затем в смесь вносят 10 мл субстрата и вы­держивают 15 мин в ультратермостате при температуре 30° С для осаждения белка. По окончании, осаждения обе пробирки охлаждают до комнатной температуры и содержи­мое их фильтруют через бумажный складчатый фильтр.

Прозрачные фильтраты (рабочий и контрольный) вносят в камеры кюветы интерферометра ИТР-2 и измеряют разность показателей преломления рабочего и контрольного рас­творов m по барабану интерферометра. Для этого использу­ют кювету с длиной рабочей грани 2 см, в правую ее камеру наливают контрольный раствор, в левую — рабочий.

Для точности определения необходимо, чтобы показа­ние прибора не превышало 500, что соответствует переходу в вещества, не осаждаемые ТХУ кислотой (аминокислоты и пептиды), не более 75% взятого для определения белка. Нельзя также, чтобы количество превращенного белка было слишком малым —меньше 20%.

Протеолитическую активность ПС, ед/г, ферментного препарата рассчитывают по уравнению

ПС = (0,1702 m— 10,213)/(n • 1000),

где m — показание барабана интерферометра; 0,1702 и 10,213 — коэффициенты, найденные экспериментально; n — количество ферментного препарата во взятом для оп­ределения количестве ферментного раствора, мг.

Реактивы. 1. 1 %-иый раствор казеина. Готовят раство­рением в воде. 2. 4%-пый раствор ТХУ.

Унифицированный интерферометрический метод (Моди­фикация по А. П. Рухлядевой и Г. В. Полыгалиной). Этот метод дает возможность анализировать протеолити­ческие ферменты в любой зоне pH с использованием в ка­честве субстрата 1%-ного раствора казеината натрия. За единицу активности принимают такое количество фер­мента, которое катализирует расщепление 1 г белка до веществ, не осаждаемых ТХУ кислотой при строго определен­ных условиях: температура протеолиза 30° С, продолжи­тельность 30 мин, соотношение фермент — субстрат 1 : 2, продолжительность осаждения высокомолекулярных ве­ществ, образующихся при гидролизе белка,— 15 мин. При данном соотношении фермент — субстрат обеспечивается гидролиз белка на 50%.

Техника определения аналогична основному интерфе­рометрическому методу. В методику внесены следующие изменения: субстрат — 1%-ный раствор казеината натрия. Соотношение количества субстрата и раствора фермента 2:1. Субстрат готовят растворением в воде (для нейтраль­ных и щелочных протеаз) или в 0,1 н. растворе НСl (для кислых протеаз) при подогреве и перемешивании магнит­ной мешалкой. После растворения субстрат охлаждают и доводят pH до нужной величины 0,1 н. раствором NaOH.

После фильтрации определяют разность показателей пре­ломления по сравнению с контролем на интерферометре ИТР-2.

Расчет протеолитической активности ведут по уравнениям, учитывающим зависимость количества прогидролизован­ного белка от количества единиц активности фермента, введенного в реакцию с препаратом.

Протеолитическую активность препаратов ПС, ед/г, определяют по приведенным ниже уравнениям.

Для нейтральных и щелочных протеаз грибного происхо­ждения

ПС = (0,22m — 21,6)/(n • 1000);

для кислых протеаз грибного происхождения

ПС = (0,58/m — 128,9)/(n • 1000);

для протеаз бактериального происхождения

ПС = (0,35/m — 59,8)/(n • 1000).

Здесь m — показание интерферометра; n — количество ферментного препарата, взятого на анализ, мг.

Погрешность данного метода не превышает ± 5,0% относительных.

Метод Лейлян — Фольгарда в модификации УкрНИИПП. Особенностью данного метода является то, что суб­стратом в ферментной реакции служит казеин, предвари­тельно растворенный при помощи гидроксида натрия.

Для прерывания ферментной реакции используют тит­рованный раствор соляной кислоты, а для осаждения не­расщепленного белка — сульфат натрия. О количестве расщепленного белка судят по соляной кислоте, оставшей­ся в фильтрате, так как казеин связывает и увлекает в оса­док всегда определенное, пропорциональное его массе количество соляной кислоты. Оставшуюся в растворе со­ляную кислоту определяют титрованием гидроксидом нат­рия при индикаторе крезоловом красном.

Рассчитывают протеолитическую активность по раз­ности между расходом на титрование 0,1 н. раствора гид­роксида натрия в рабочем и контрольном опыте. За едини­цу протеолитической активности принято такое количество фермента, которое за 1 ч при температуре 30° С расщепляет 1 г казеина. ПС выражают числом указанных единиц в 1 г сухого препарата.

Определение проводят в двух параллельных пробах. Для этого в две конические колбы вместимостью 100 мл вносят пипеткой по 20 мл раствора казеина и прогревают в термостате или водяной бане при 30° С в течение 10 мин. Затем при помешивании в колбы добавляют по 10 мл фер­ментного раствора. Общий объем реакционной смеси дол­жен быть 30 мл. Если ферментного раствора берут меньше, то недостающий объем дополняют дистиллированной во­дой непосредственно перед введением ферментного раство­ра. Продолжительность ферментной реакции — 1 ч при температуре 30 ± 0,2° С. Действие фермента прерывают добавлением при перемешивании 20 мл 0,1 н. раствора HCI в 7,5%-ном растворе сульфата натрия и немедленно фильт­руют, возвращая первые порции на фильтр до полной про­зрачности раствора.

Параллельно ставят два контрольных опыта, в которых раствор НС1 в сульфате натрия вводят перед добавлением ферментного раствора. В этом случае отпадает также необ­ходимость выдерживания пробы в термостате.

После получения прозрачных фильтратов в опытах и конт­рольных пробах из каждой отбирают по 20 мл фильтрата, добавляют 2 капли индикатора крезолового красного и оттитровывают НС1 0,1 н. раствором NaOH до появления красного окрашивания.

Разность между расходом щелочи на титрование в ра­бочих и контрольных пробах, отнесенная к 10 мл фильт­рата, должна находиться в пределах 0,4—2,5 мм. При других значениях опыт повторяют с большим или меньшим количеством ферментного раствора.

По разности расхода 0,1 н. раствора NaOH на титро­вание в рабочей и контрольной пробе, пользуясь табл. 12, определяют протеолитическую активность фермент­ного препарата. Таблица составлена при условии, что для определения взято 10 мл ферментного раствора в разведении 1 : 100. При других дозировках протеолитическую активность ПС, ед/г, пересчитывают по формуле

ПС = е/n,

где е — количество единиц ПС, найденное по табл. 12; n — количество ферментного препарата или культуры, соответствующее 10 мл фильтрата (1/5 от количества, вне­сенного в реакционную смесь), г или мл.

Полученный результат пересчитывают на сухое вещество. Например, для определения ПС ферментного препарата приготовили 0,1 %-ный ферментный раствор. Для определе­ния взяли 10 мл его. На титрование опытной пробы израс­ходовали 2,7 мл 0,1 н. раствора, а контрольной — 1,5 мл. Влажность ферментного препарата 10%. Разность в пе­ресчете на 10 мл (2,7—1,5)/2 = 0,6 мл. По таблице она со­ответствует 0,0360 ед. ПС- п = 0,1 • 10/(100 • 5) = 0,002 г. В расчете на 1 г сухого вещества препарата

ПС = (0,0360/0,002) • [100/(100— 10)] = 20 ед/г.

Реактивы.

1. 5%-ный щелочный раствор казеина. 50 г (по сухому веществу) технически измельченного казеина помещают в химический стакан вместимостью 1 л, добавляют 50 мл дистиллированной воды и оставляют на 30 мин. Затем ста­кан помещают в водяную баню с температурой 65—70° С. При тщательном перемешивании стеклянной палочкой постепенно добавляют 50 мл 1 н. раствора NaOH. В процес­се растворения жазеина небольшими порциями (по 50—80 мл) добавляют воду (5—6 раз), нагретую до 65—70° С и выдерживают на водяной бане до полного исчезновения комочков. После полного растворения и охлаждения рас­твор переносят в мерную колбу вместимостью 1 л, доводят до. метки и, перемешав, фильтруют через четыре слоя марли.
2. 0,1 н. раствор НСl в 7,5%-ном растворе Na₂S0₄. В мерной колбе вместимостью 1 л растворяют дистиллиро­ванной водой фиксанал 0,1 н. НС1 и 75 г безводного суль­фата натрия (Na₂S0₄).
3. 0,5%-ный спиртовой раствор крезолового красного. 0,5 г этого индикатора растворяют в 100 мл 96%-ного спир­та-ректификата и фильтруют.
4. 1 н. раствор 0,1 н. раствор NaOH.