Свободные аминокислоты играют значительную роль в процессе приготовления хлеба. Они служат питатель­ными и стимулирующими веществами для дрожжей и мо­лочнокислых бактерий, являются источником альдегидов, составляющих ароматический комплекс хлеба, непремен­ными участниками реакции меланоидинообразования, обу­словливающей аромат и цвет корки хлеба.

Качественное и количественное определение аминокислот производят разделением их методом распределительной хроматографии на бумаге. Этот метод заключается в раз­делении веществ смеси, обладающих различными коэффициентами распределения между двумя жидкими фазами— растворителями. Одна из жидких фаз — неподвижный растворитель — прочно удерживается на поверхности твердого вещества-носителя, которым служит специальная бумага. Исследуемая смесь растворяется в подвижном растворителе и в небольшом количестве в виде капли наносится на бумагу, пропитанную неподвижным раство­рителем.

При промывании носителя подвижным растворителем вещества исследуемой смеси разделяются благодаря не­одинаковой скорости их продвижения по носителю. Разде­ление можно проводить нисходящим и восходящим методами.

После разделения исследуемой смеси хроматограммы проявляют специальными проявителями. Для идентифи­кации полученных пятен используют метод свидетелей.

Определение качественного состава аминокислот. Аминокислоты разделяют на бумаге спиртовым раство­рителем (н-бутиловый спирт: уксусная кислота: вода) с последующим проявлением пятен аминокислот цветной реакцией с нингидрином. В слабокислой среде нингидрин . с аминокислотами дает производное — дикетогидринде- лиденди-кетогидриндиамин (ДИДА) — имеющее синий цвет. 

Для проведения работы, кроме обычного лабораторного оборудования, требуется иметь хроматографическую бу­магу марки «Ленинградская быстрая» или «F-1», микро­пипетку с грушей и микровинтом, капиллярные пипетки, установку для нанесения фильтрата на бумагу, хроматографические камеры, сушильный шкаф.

Для нанесения исследуемой пробы пользуются листом оргстекла размерами 70 X 70 см, имеющим на расстоянии 5 см от одного из краев щель длиной 60 и шириной 1,5 см. Для подсушки наносимых пятен пробы необходим тепло­электровентилятор или калорифер.

Для точного отмеривания фильтрата пользуются микро­пипеткой вместимостью 0,1 мл. Ее устанавливают в штативе и через эластичную трубку соединяют с резиновой грушей, зажатой между двумя пластинками микровинтом. Очень малый шаг винта позволяет изменять объем груши в преде­лах вместимости микропипетки.

В качестве первого растворителя используется смесь н-бутилового спирта, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:1. Вторым растворителем служит смесь тех же веществ в соотношении 4 : 0,5 : 1,5.

В качестве свидетелей используют растворы чистых ами­нокислот. Для этой цели служит выпускающийся промыш­ленностью набор аминокислот. Готовят исходные 0,4%- ные растворы аминокислот в дистиллированной воде. В тех случаях, когда растворение затруднено (тирозин, цистин), растворы подкисляют несколькими каплями 1 н. соляной кислоты.

Из исходных растворов аминокислот составляют 3 рабо­чие смеси свидетелей. Первая — А — содержит растворы глицина (1мл), гистидина (1,0 мл), глутаминовой кисло­ты (1,5 мл), валина (1 мл) и аланина (0,5 мл). Вторая — В — состоит из растворов лизина (1 мл), аргинина (1 мл), аспарагиновой кислоты (1 мл), триптофана (0,5) мл и лейцина (1,5) мл. Третья — С — содержит растворы серина (0,5мл), аспарагина (1 мл), цистина (1 мл), треонина (0,5 мл), фенилаланина (1 мл) и метионина (1,0 мл).

Исходные и рабочие растворы свидетелей хранят в плотно закупоренных бутылках в холодильнике с добав­лением консерванта, в качестве которого используют йо­дистую ртуть (на кончике шпателя).

Проявителем служит 0,5%-ный раствор нингидрина в ацетоне, содержащий 4% дистиллированной воды и 1% ледяной уксусной кислоты.

Исследуемую пробу подготовляют следующим образом. Навеску теста или густого полуфабриката в. количестве 40 г или жидкого полуфабриката в количестве 80 г расти­рают в фарфоровой ступке с дистиллированной водой и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл. После доведения до метки содержимое колбы тщательно взбалтывают, затем центрифугируют в течение 10 мин при частоте вращения 8000 мин^-1. Центрифугах дважды фильтруют через плотный узкопористый фильтр.

Пробу из мякиша и корки хлеба подготовляют анало­гично. Для анализа берут навески мякиша и корки соот­ветственно 30 и 20 г. "Подготовленную пробу помещают в микробюретку, откуда в точных количествах набирают ее в капиллярные пипетки для нанесения на хромато­графическую бумагу.

Для получения четких пятен аминокислот достаточ­но нанести на хроматографическую бумагу 50—60 мкд пробы.

Подготовку хроматографической бумаги и нанесение на нее пробы производят следующим образом. Лист хро­матографической бумаги размещают на стекле и с помощью линейки и простого карандаша расчерчивают так, как это указано на рис. 18. Заштрихованные участки листа отре­зают. На расстоянии 4,5 см от нижнего края листа про­водят горизонтальную стартовую линию, на которой через 3 см друг от друга намечают точки расположения проб.

Перед нанесением проб лист хроматографической бума­ги располагают так, чтобы стартовая линия проходила по середине щели стекла. На каждую точку стартовой линии наносят по 60 мкл фильтрата проб. Рабочие растворы свидетелей (А, В и С) используют в количестве 5 мкл каждый. Образуемые пятна не должны быть слишком большими или слишком малыми. Практика показала, что наилучшее разделение аминокислот происходит тог­да, когда диаметр пятен будет в пределах 6—7 мм. Пятна подсушивают умеренно теплым воздухом.

После того, как вся проба будет перенесена на бумагу и пятна подсохнут, в случае восходящей хроматографии лист сворачивают в цилиндр, сшивают белыми нитками по пунктирной линии (см. рис. 18) и помещают в хрома­тографическую камеру, в которую заблаговременно нали­вают около 300 мл первого растворителя. Стартовая линия с пятнами фильтрата должна быть выше уровня раствора.

Если используется способ нисходящей хроматографии, то конец полоски хроматографической бумаги с нанесен­ными каплями фильтрата опускают в кювету с растворите­лем, погружая его на 1,5—2 см. Кювету укрепляют в верх­ней части хроматографической камеры, а для поддержания бумажных лент используют стеклянные перекладины. Что­бы свисающая вниз лента бумаги сохраняла вертикальное положение, к ее нижнему концу также прикрепляют стек­лянные палочки.

Установка для восходящей хроматографии показана на рис. 19, а, а установка для нисходящей хроматографии — на рис. 19. б.

При получении хроматограмм с небольшим количеством образцов используют более узкие листы бумаги и в ка­честве камер применяют стеклянные цилиндры меньшего диаметра.

Камеры, в которых производится разделение смеси (разгонка), должны плотно закрываться крошкой или проб­кой и герметизироваться. Для этого применяют вазелин, изоляционную или резиновую ленту. Разделение смеси проводят при комнатной температуре в течение 40—48 ч, давая фронту подвижного растворителя продвинуть­ся по бумаге на 35—40 см. По окончании первой раз­гонки хроматографическую бумагу вынимают из ка­меры и тщательно в тече­ние 7—8 ч просушивают под вытяжным шкафом. Затем в аналогичных усло­виях производят разделе­ние второй раз (II разгон­ка). Вторая разгонка производится до фронта пер­вой разгонки.

Вторая просушка про­водится так же, как и в первый раз. После нее хроматографическую бу­магу помещают в камеру, содержащую второй раствори­тель. Третья разгонка ничем не отличается от предыдущих и заканчивается в момент достижения растворителем фронта предыдущих разгонок.

По окончании разделения исследуемой смеси хромато­графическая бумага тщательно проветривается под вытяж­ным шкафом и просушивается до исчезновения следов вто­рого растворителя. На это требуется 7—8 ч.

Бумагу проявляют свежеприготовленным раствором нингидрина, опрыскивая ее из пульверизатора или протя­гивая через кювету с проявителем. Второй способ более быстрый и надежный.

Необходимо помнить, что на всем протяжении работы с хроматографической бумагой, начиная с ее разметки и на­несения пятен и кончая проявлением, нельзя прикасаться к ней руками, так как на руках всегда есть следы амино­кислот, которыми можно загрязнить бумагу. При работе с бумагой ее берут руками только за край, противополож­ный стартовой линии, и боковые края, которые сшиваются.

После протягивания бумаги через проявитель ее неко­торое время (до появления пятен) выдерживают при комнатной температуре, а затем — 30 мин в затемненном сушильном шкафу при температуре 50—55° С.

При использовании в качестве растворителей вышепри­веденных смесей аминокислоты по направлению движения растворителя располагаются в следующем порядке: цистин, лизин, гистидин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кис­лота, серин, глицин, глутаминовая кислота, треонин, ала­нин, тирозин и у-аминомасляная кислота (вместе), трипто­фан, метионин, валин, фенилаланин, лейцин и изолейцин.

При данных условиях разгонки трудно отделяются одна от другой такие аминокислоты: лизин и гистидин, аспара­гиновая кислота, серин и глицин, глутаминовая кислота и треонин. При необходимости раздельного определения лизина и гистидина следует пользоваться двумерной хро­матографией или методом электрофореза.

Для разделения аминокислот, находящихся в центре хроматограмм (аспарагиновой кислоты, серина и глицина, глутаминовой кислоты и треонина), обычно прибегают к шестикратной разгонке.

Определение количественного содержания аминокислот.

Для осуществления этого метода также используют хромато­графическое разделение аминокислот на бумаге. Разница с вышеизложенным методом заключается в том, что на бу­магу наносят не 60 мкл исследуемого фильтрата, а 200 мкл и не в виде пятна, а полосой длиной до 4 см. Кроме того, на тот же лист бумаги наносят точное количество растворов свидетелей. Готовят их для количественного ана­лиза отдельно, тщательно взвешивая навески и отмеряя растворы при составлении смесей. Каждую рабочую смесь свидетелей доводят до объема 5 мл дистиллированной во­дой. Для определения растворы свидетелей наносят на бу­магу по 20 мкл. Процесс разгонки и проявления такой же, как и при качественном анализе.

 Количественное содержание аминокислот определяют следующим образом. Из готовых хроматограмм вырезают участки с ярко-лиловыми пятнами испытуемых аминокислот и аминокислот-свидетелей. Сбоку хроматографического листа вырезают такие же по площади контрольные чистые участки для приготовления контрольных проб. Вырезанные участки бумаги измельчают и помещают в пробирки. Для элюирования аминокислот из бумаги в каждую пробирку добавляют по 5мл 0,005%-ного раствора сульфата меди в 75%-ном этиловом спирте. Лиловая окраска аминокислот переходит в оранжево-красную вследствие образования Cu-производного ДИДА. Для полноты экстракции пробир­ки оставляют в темном месте на 40 мин, а после этого опре­деляют оптическую плотность растворов с помощью фото­электроколориметра при зеленом светофильтре в кювете с рабочей длиной грани 10 мм. Отсчет ведут по левому барабану прибора.

На основании найденной оптической плотности иссле­дуемого раствора аминокислоты и раствора-свидетеля, а также зная количество аминокислоты в растворе свидете­ля, вычисляют содержание данной аминокислоты в иссле­дуемом объекте А, 10 ³%, из уравнения

А = аЕ_р •100/(Е_сп),

где а — количество аминокислоты в растворе свидетеля, нанесенном на хроматографическую бумагу, мг; Е_р — опти­ческая плотность элюата исследуемой аминокислоты; Е_с — оптическая плотность элюата свидетеля; п — навеска исследуемого объекта, соответствующая взятому для опре­деления количеству фильтрата, г. Полученный результат при необходимости пересчитывают на сухое вещество объекта исследования A₁= А •100/ (100 — W).

Рассчитаем, например, содержание валина в тесте, если для количественного анализа взято 40 г теста в мерную колбу вместимостью 100 мл. На лист хроматографической бумаги наносили 200 мкл фильтрата. Оптическая плот­ность элюата этой аминокислоты была 0,082, а элюата ва­лина из раствора свидетелей — 0,052.

Определим, прежде всего, количество валина, которое находилось в 20 мкл раствора свидетелей. Валин находится в смеси свидетелей А. Для приготовления этой смеси бра­ли 1 мл 0,4%-ного раствора валина и доводили общий объем до 5 мл. Подставляя в формулу указанные данные,

а = 0,4 • 1 • 0,02/(100 • 5) = 0,016 • 10^-3 г = 0,016 мг;
n= 40 • 0,2/100 = 0,08 г;

А =0,016 • 0,082 • 100/(0,052 • 0,08) = 23,65 • 10^-3%.

Расчет количества аминокислот в исследуемом объекте можно вести также по калибровочному графику.

Реактивы.

1. Свидетели. 20 мг каждой аминокислоты растворяют в 5 мл дистиллированной воды. Из полученных раство­ров готовят три смеси свидетелей, объемом 5 мл каждая.

Смесь А: раствор гистидина — 1 мл, глутаминовой кислоты—1,5 мл, валина—1 мл, аланина — 0,5 мл, глицина — 1 мл.

Смесь В: раствор лизина — 1 мл, аргинина — 1 мл, аспарагиновой кислоты — 1 мл, лейцина — 1,5 мл, трипто­фана — 0,5 мл.

Смесь С: раствор серина — 0,5 мл, аспарагина — 1 мл, фенилаланина — 1 мл, треонина — 0,5 мл, метионина — 1 мл, цистина — 1 мл.

2. 0,005%-ный раствор сульфата меди (CuS0₄ • 5Н₂0).