Для определения несброженных сахаров отобран­ные объекты подвергают лиофилизированию. Для этого 20—30 г теста распределяют тонким слоем на алюминиевых пластинках и замораживают над сухим льдом (температура около — 80° С), а затем подвергают лиофильной сушке при остаточном давлении 66 Па (0,5 мм рт. ст.) на протяжении 5-8 ч до конечной влажности 2—5%.

Экстракцию сахаров из лиофилизированных объектов производят на кипящей водяной бане обработкой 5 г 80 мл 82%-ного этанола. Полученный экстракт упаривают до 6 мл, охлаждают до 20° С, добавляют 2,5 мл 1%-ного раствора молибдата аммония, доводят дистиллированной водой до 20 мл и отфильтровывают через бумажный фильтр. Полученный фильтрат-пробу в количестве 100—200 мкл наносят на лист хроматографической бумаги капиллярными пипетками, как это описано на с. 93.

Сахара разделяют в смеси бутанол: пиридин: вода в со­отношении 3:2:1 восходящим способом в течение 20—24 ч при четырехкратной разгонке. Полученные хроматограм­мы проявляют 10%-ным раствором молибдата аммония. Проявленные хроматограммы подсушивают при комнат­ной температуре, а затем выдерживают в сушильном шка­фу при 100—105° С в течение 15 мин. Участки хроматограмм, содержащие пятна сахаров, вырезают, нарезают тонкими полосками и помещают в пробирки с притертыми стеклян­ными пробками.

Для определения моносахаров в пробирки добавляют по 6 мл реактива, содержащего 1,7% молибдата аммония и 1,7%-ной серной кислоты. Пробирки нагревают на кипящей водяной бане 18 мин, охлаждают до 20° С, выдерживают при этой температуре 45 мин и определяют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре при длине волны 656 нм в кювете с рабочей длиной грани 5 мм.

Чтобы определить дисахариды, сначала их гидролизуют. Для этого в пробирки с нарезанными полосками со­ответствующих участков хроматограмм добавляют по 6 мл 4%-ного раствора серной кислоты и выдерживают на ки­пящей водяной бане 2 ч. После охлаждения до 20° С в про­бирки вносят по 6 мл 3,4%-ного раствора молибдата аммония и анализируют, как моносахара.

Одновременно на те же листы хроматографической бу­маги наносят стандартные смеси сахаров-свидетелей, содержащих известное количество исследуемых сахаров. Оптическую плотность сахаров-свидетелей определяют ана­логично изложенному. Расчет количества сахаров в иссле­дуемых объектах ведут по уравнению

X =aD₂ • 100/(1000D)₁p),

где X — содержание моносахарида в исследуемом объекте % к массе продукта. Если определяют дисахара, результат умножают на 0,95; а — количество сахара, нанесенно­го на хроматографическую бумагу со стандартной смесью сахаров-свидетелей, мг; D₂— оптическая плотность сахара в испытуемом элюате; D1— оптическая плотность элюата сахара-свидетеля; р —навеска испытуемого объекта, со­ответствующая нанесенному на хроматографическую бу­магу количеству пробы, г.

Ее определяют по формуле

где 5 — навеска лиофилизированного вещества, взятого для определения, г; 0,1—0,2 — количество пробы, нане­сенное на хроматографическую бумагу, мл; 20 — объем раствора, в котором растворена навеска, мл; W_Л и Wн — влажность испытуемого вещества соответственно лиофили­зированного и натурального, %.

Реактивы. 1. 82%-ный этанол. 2. 1%-ный молибдат аммония. 3. 10%-ный молибдат аммония. 4. Реактив для элюирования, содержащий 1,7% молибдата аммония и 1,7% серной кислоты (в 1 л раствора содержится 17 г (NH₄)₂ Мо0₄ и 17 г концентрированной H_aS0₄). 5. 4%-ный раствор серной кислоты. 6. 3,4%-ный раствор молибдата аммония.