Амперометрическое титрование представляет собой объемный метод анализа, в котором для индикации конеч­ной точки титрования используют диффузионный ток, наблюдаемый на ртутно-каломельном или вращающемся платиновом электроде.

Для амперометрического титрования SH-групп при­меняют прибор ПАТ (рис. 21). На его штативе закреплены электродвигатель 5 с редуктором, столик 1 для электроли­зера 2 с исследуемым раствором, каломельный электрод 3 и микробюретка 6 для рабочего раствора. Штатив имеет уст­ройство для подъема и опуска­ния вручную электролизера на определенную высоту (для по­гружения электродов).

Электродвигатель приводит во вращение мешалку 4, слу­жащую электродом, с частотой вращения 800 мин^-1. Она пред­ставляет собой стеклянную труб­ку, через которую пропущен провод, соединенный внизу с впаянной платиновой проволо­кой диаметром 0,5 мм. Наруж­ный рабочий конец проволоки имеет длину 4—5 мм. Раствор перемешивается двумя неболь­шими симметрическими стек­лянными «крылышками», распо­ложенными на трубке.

В качестве электрода сравне­ния служит каломельный элек­трод, соединенный с анализи­руемым раствором мостиком, заполненным насыщенным раствором хлорида калия.

Прибор снабжен блоком питания, работающим от батарейки на 4,3 В. Возникающий диффу­зионный ток регистрируется микроамперметром типа М 198/2. При амперометрическом титровании на приборе ПАТ испытуемый раствор помещают в электролизер, опускают в него электроды и титруют раствором нитрата серебра.

При приложении ЭДС в цепи устанавливается слабый ток — остаточный. От начала титрования испытуемого раствора до момента нейтрализации SH-групп ток — по­стоянный, так как ионы AgN0₃ связываются с испытуемым веществом. После нейтрализации, когда в растворе появится избыток ионов AgN0₃, сила тока резко возрастет пропор­ционально количеству добавляемого электролита. Титрова­ние оканчивается при достижении линейной зависимости силы тока от количества прибавляемого AgN0₃.

Техника определения следующая. Навееску теста в ко­личестве 1 г для определения SH-групп тщательно расти­рают в фарфоровой ступке в течение 2—3 мин до получения гомогенной суспензии с 30 мл модифицированной смеси Бенеша — Ларди — Бенеша следующего состава, мл: 1 М трис-буфер — 4; 1 М HN0₃ — 3,4; 1М КС1 — 0,3; 1 мг/мл ЭДТА — 0,3; салицилат натрия — 3,78 г; вода бидистил­лят до общего объема — 30.

Приготовленную таким образом суспензию помещают в стаканчик вместимостью 50 мл и опускают в него вра­щающийся платиновый электрод, а также электрод срав­нения. Электроды оставляют на 5 мин для установления равновесия в системе, после чего смесь титруют 0,001 М водным раствором AgN0₃, который добавляют-по 0,1 мл через каждую минуту. Диффузионный ток, возникающий при этом, фиксируют по показаниям микроамперметра, так как 1 мин необходима для реагирования AgN0₃ с SH-rpyn- пами и установления постоянной силы тока раствора. Тит­рование прекращают при достижении линейной зависимости между силой тока и прибавляемым количеством AgN0₃.

По результатам титрования на миллиметровой бумаге строят график, на котором наносят значение силы тока, как функцию добавляемого объема реактива, и определяют точку эквивалентности. Содержание SH-групп выражают в микроэквивалентах на 1 г белка исследуемого образца, исходя из расчета, что 1 мл 0,001 М AgN0₃ соответствует 1 мкэкв SH-групп. Содержание белка в пробе определяют по Кьельдалю.

Правильность количественного определения SH-rpynn в реакционной смеси этим методом проверяют титрованием раствора восстановленного глютатиона известной концент­рации. Для этой цели используют водный раствор глюта­тиона, содержащий 1 мкэкв SH-групп в 1 мл раствора.

Приготовленную смесь титруют раствором 0,001 М AgN0₃. 1 мл раствора AgN0₃, пошедшего на титрование, соответ­ствует 1 мкэкв SH-rpynn.

Дисульфидные связи определяют после их восстановле­ния в SH-группы. Для этого в реакционную смесь Бене­ша — Ларди — Бенеша дополнительно вводят 0,2 мл раст­вора сульфита натрия, насыщенного на холоду.

При необходимости определять все дисульфидные свя­зи, включая «скрытые», недоступные для непосредствен­ного восстановления сульфитом натрия, в смёсь вместо 3,78 г салицилата натрия вносят 12,6 г. мочевины. Под ее действием белковые молекулы «развертываются» и «скрытые» SS-связи поддаются восстановлению до SH- групп.

Для определения SS-связей 0,5 г теста растирают с 30 мл буферной смеси, содержащей сульфит натрия, и переносят в стаканчик прибора. Суспензию титруют, как при опре­делении SH-групп в тесте.

Так как сульфит натрия восстанавливает дисульфидные связи по схеме

R-SS-R’ + SO₃^--→RSH^- + R'-SSO₃^- ,

то 1 моль R—SS—R’ образует 1 моль RSH^-.

Содержание дисульфидных связей рассчитывают как разность между содержанием SH-групп, оттитрованных после добавления сульфита натрия к буферной среде и до его добавления.

Для определения SH-групп и SS-связей в клейковине навеску сырой клейковины, отмытой по стандартной мето­дике, встряхивают на холоду в течение суток с 50-кратным 12%-ным водным раствором салицилата натрия, затем дважды центрифугируют при частоте вращения 7000 мин^-1. На определение SH-групп берут 5 мл полученного центри- фугата, а на определение SS-связей— 1 мл. При подготов­ке реакционной смеси учитывают содержание салицилата натрия, содержащееся в пробе салицилатного центрифу- гата клейковины, взятой на определение. Для определения SH-групп в клейковине в реакционную смесь добавляют 2,83 г салицилата натрия, а для определения SS-связей — 3,58 г. Дальнейшее определение производится аналогично тому, как это делается для теста.

Реактивы. 1. 1 М раствор триса (триоксиметиламино- метан). 2. Раствор ЭДТА 1 мг/мл (этилендиаминтетрааце­тат), трилон Б. 3. 12%-ный раствор салицилата натрия. 4. 1 Мраствор HN0₃. 5. 1 М раствор КС1. 6. 0,001 н. раст-вор глютатиона. 7. Насыщенный на холоду раствор сульфа­та натрия.

Все реактивы должны быть химически чистыми и свеже­приготовленными.