Флоуриметрический метод определения тиамина (В₁). Этим методом определяют свободный тиамин и общее его содержание в продукте. В основу его положена способность тиамина при окислении щелочным раствором гексацианофериата калия образовывать тиохромсоединение, обладающее ярко-синей флуоресценцией в ультрафиоле­товом свете.

Интенсивность флуоресценции, зависящая от концен­трации исследуемого вещества, определяется на флуориметре при освещении объекта ультрафиолетовыми лучами, полученными с помощью светофильтров, пропускающих ультрафиолетовые лучи с длиной волны 320—390 нм. Из­мерение производится с помощью фотоэлементов, соеди­ненных с чувствительным гальванометром.

В пищевой промышленности чаще других флуориметров применяется флуориметр ЭФ-3.

Ход определения следующий. 10 г муки или 15 г мякиша хлеба тщательно фастирают в фарфоровой ступке с 25 мл 0,1 н. раствора серной кислоты, суспензию переносят в мер­ную колбу вместимостью 100 мл и доливают раствором 0,1 н. серной кислоты до объема примерно 75 мд. Колбу помещают на кипящую водяную баню и при частом пере­мешивании нагревают 45 мин, охлаждают до 50° С, добав­ляют 2,5 М раствора уксуснокислого натрия до pH 4,5— 5,0 (около 5 мл), доводят водой до метки и фильтруют. В фильтрате определяют содержание свободного тиамина.

Для определения общего содержания тиамина необ­ходимо продукт дополнительно обработать фосфатазой для перехода тиамина кокарбоксилазы в свободное состояние. С этой целью к охлажденной после нагревания суспензии анализируемого вещества добавляют ферментный препарат пенициллиум из расчета 30 мг мицелия на 1 г сухого ве­щества взятой навески. Навеску препарата тщательно рас­тирают в небольшой фарфоровой ступке с 2—3 мл 2,5 М раствора уксуснокислого натрия и переносят в колбу с суспензией. Содержимое колбы доводят раствором уксуснокис­лого натрия до pH 4,5—5,0. Колбу закрывают ватной пробкой и помещают в термостат на 12—16 ч при 37° С, затем доливают дистиллированной водой до метки и фильт­руют.

В дальнейшем ход определения свободного и общего тиамина одинаков. Разница между обоими определениями дает величину связанного тиамина.

Для удаления флуоресцирующих примесей к 20 мл фильтрата добавляют пипеткой равный объем изобутилового спирта. Смесь встряхивают 1—2 мин и разделяют в дели­тельной воронке. Верхний слой, спиртовой, отбрасывают. Нижний — фильтруют. Для получения тиохрома отбирают по 5 мл водного раствора в две цилиндрические делитель­ные воронки вместимостью 25 мл, а в две другие воронки вносят по 5 мл стандартного раствора хлоргидрата ти­аминхлорида.

Для окисления тиамина в тиохром в одну воронку с ис­следуемым раствором и в одну воронку со стандартным раствором приливают по 3 мл смеси 0,04%-ного раствора гексацианофериата калия в 15%-ном растворе гидроксида натрия. Смесь готовят перед определением. В две другие (контрольные) воронки с исследуемым и стандартным раст­ворами добавляют по 3 мл 15%-ного раствора гидроксида натрия (без гексацианофериата калия), содержимое воро­нок встряхивают 2 мин, приливают из микробюретки во все воронки по 12 мл изобутилового спирта для экстракции тиохрома и встряхивают еще 1,5—2 мин. Смеси дают рас­слоиться. Затем нижний водный слой отбрасывают, а в спир­товой слой добавляют 2 г безводного сульфата натрия для обезвоживания, встряхивают и фильтруют через сухой бумажный фильтр. Для флуориметрии используют только совершенно прозрачные растворы.

На флуориметре сначала измеряют интенсивность флу­оресценции стандартного раствора тиамина, а затем иссле­дуемого.

Концентрацию тиамина X, 10^-3%, вычисляют по фор­муле

X = (A — a)CV • 100/[(В — b)/V₁p],

где А и а — показания прибора для исследуемого раствора соответственно с окислением и без окисления (контроль);

С — концентрация тиамина в стандартном растворе, мкг/мл;

V — объем мерной колбы, мл; В и b — показания при­бора для стандартного раствора соответственно с окисле­нием и без окисления (контроль); V₁— объем раствора, взятый для окисления 5 мл; р —навеска вещества, г.

Реактивы.

1. 0,1 н. раствор H₂S0₄.
2. 2,5 М раствор уксуснокислого натрия — растворяют 340 г CH₃COONa в 1 л воды.
3. Ферментные препараты из мицелия Penicillium, Asp. oryzae или другой источник фосфатазы.
4. Изобутиловый спирт.
5. .1%-ный раствор K₃Fe(CN)₆ — готовят в день употреб­ления. Для окисления вытяжек используют 0,04%-ный раствор K₃Fe(CN)_e в 15%-ном растворе Для этого 4мл 1%-ного раствора вносят в96 мл 15%-ного раствора NaOH. Этот раствор годен в течение 4 ч.
6. 15%-ный раствор
7. Сульфат натрия безводный (Na₂S0₄).
8. Основной стандартный раствор тиамина — 10 мг хлоргидрата тиаминхлорида растворяют в 0,001 н. НС1 в колбе вместимостью 100 мл и доводят до метки. Раствор сохраняют в холодильнике не более месяца.
9. Рабочий стандартный раствор тиамина — 1 мл стан­дартного раствора в мерной колбе доводят дистиллирован­ной водой до 100 мл. 1 мл рабочего раствора содержит 1 мкг хлоргидрата тиаминхлорида.

Определение суммарного содержания рибофлавина (В₂). Современные методы определения рибофлавина осно­ваны на способности его к флуоресценции. Растворы рибофлавина имеют ярко-желтую окраску. Для них ха­рактерна желто-зеленая флуоресценция с максимальной интенсивностью при pH 6—8.

Ход определения следующий. 10 г муки или 15 г мякиша  хлеба растирают в ступке с небольшим количеством фос­фатного буфера (pH 7,8—8,0), количественно переносят в колбу и добавляют в нее такое количество фосфатного бу­фера, чтобы общее разведение составляло 1:15 или 1 :20. Суспензию помещают на 45 мин в кипящую водяную баню, затем охлаждают до 30° С, проверяют pH (оно должно быть 7,8—8,0) и добавляют ферментный препарат трипсин или панкреатин (из расчета 30 мг препарата на 1 г сухого ве­щества), растертый в 10 мл фосфатного буфера. Смесь по­мещают в термостат при температуре 37° С на 12—16 ч.

При термостатировании от белка отщепляется прочно связанная с ним форма рибофлавина. После гидролиза смесь переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, до­водят водой до метки и фильтруют через складчатый фильтр. 5 мл фильтрата пипеткой переносят в коническую колбу со шлифом, добавляют 5 мл 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты и кипятят на водяной бане в тече­ние 10 мин для расщепления нуклеотидных форм рибо­флавина.

После охлаждения к смеси добавляют 2,5 мл 4 М раствора гидрофосфата калия с целью доведения pH до 6 и по каплям прибавляют 4%-ный раствор перманганата калия до появ­ления красноватой, не исчезающей окраски. Через 10 мин для разрушения избытка перманганата доливают по каплям 3%-ный раствор перекиси водорода до исчезновения окрас­ки, а затем приливают 0,2 мл рабочего раствора хлорида олова и 0,1 мл 2,5%-ного раствора гидросульфита натрия, гидрата. Смесь встряхивают 20 мин. При этом обратимо восстановленный рибофлавин переходит в окисленную флуоресцирующую форму. Объем вытяжки доводят до 15 мл дистиллированной водой, фильтруют и измеряют интен­сивность флуоресценции. Опытный и стандартный растворы наливают в кюветы из нефлуоресцирующего стекла.

Вначале измеряют флуоресценцию стандартного рабо­чего раствора рибофлавина, а затем исследуемого. После этого в пробирки со стандартным и исследуемым раствором добавляют по 0,1 г гидрокарбоната натрия и 0,1 г Na₂S₂0₄X X 2Н_гО (для гашения флуоресценции рибофлавина, кото­рая обычно гасится до нуля) и вновь измеряют флуоресцен­цию. Гашение и измерение на флуориметре повторяют несколько раз. Измерение производят при длине волны 350—480 нм.

Содержание рибофлавина X, мкг на 100 г продукта, вычисляют по формуле

Х = (А — а) 0,4V₁V2 • 100/[(B — b) V₃p],

где А и а —показания прибора для исследуемого раствора, соответственно до и после гашения флуоресценции рибо­флавина; 0,4 — концентрация стандартного раствора ри­бофлавина, мкг/мл; V₁ — общий объем вытяжки, 100 мл; V₃ — объем вытяжки, взятой для анализа при кислотном гидролизе, 5 мл; V₂— объем экстракта перед измерением флуоресценции, 15 мл; В и b — показания флуориметра для стандартного раствора рибофлавина, содержащего 0,4 мкг в 1 мл, соответственно до и после гашения флуорес­ценции; р — навеска, г.

Реактивы.

1. Фосфатный буфер (pH 7,8—8) — готовят 1/15 М рас­твор гидроортофосфата натрия, гидрата (11,870 г Na₂HP0₄ X X 12Н₂0 растворяют в 1 л воды) и 1/15 М раствор гидро­ортофосфата калия (9,078 г КН₂Р0₄ растворяют в 1 л воды). Смешивают 9,5 части приготовленного раствора Na₂HP0₄ X X 12Н_гО с 0,5 части раствора КН₂Р0₄.
2. 4 М раствор гидроортофосфата калия — 69,6 г К₂НР0₄ растворяют в 100 мл воды. При выпадении осадка перед использованием раствор подогревают.
3. 4%-ный раствор перманганата калия — приготовля­ют через каждые 2 недели.
4. 20%-ный раствор трихлоруксусной кислоты.
5. 3%-ный раствор перекиси водорода.
6. Раствор хлорида олова — основной раствор готовят растворением 10 г хлорида олова SnCI ₂ в 25 мл концентри­рованной НС1. Раствор хранят в темной склянке с притер­той пробкой при комнатной температуре. Рабочий раствор готовят каждый раз перед определением, разбавляя водой 0,2 мл основного раствора до объема 100 мл.
7. Концентрированная
8. Свежеприготовленный раствор гидросульфита натрия, гидрата. 0,250 г Na₂S₂0₄ 2Н₂0 растворяют в 10 мл 2%- ного раствора NaHC0₃.
9. Трипсин или панкреатин.
10. Стандартный рабочий раствор рибофлавина — 10 мг рибофлавина растворяют дистиллированной водой в мер­ной колбе вместимостью 250 мл. Раствор стоек в течение месяца при хранении в темном месте на холоду. Рабочий стандартный раствор готовят перед определением. Для это­го в мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 37,5 мл 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, 25 мл 4 М раствора К₂НР0₄, 1 мл исходного стандартного раствора рибофлавина. Затем объем доводят до метки. В 1 мл этого раствора содержится 0,4 мкг рибофлавина.

Определение никотиновой кислоты (витамина РР) в модификации Е. М. Степановой. В основу метода положена способность никотиновой кислоты при взаимодействии с бромистым роданом и метолом давать окрашенные раство­ры. Интенсивность их окраски измеряют на фотоэлектро­колориметре.

Ход анализа следующий. 20 г измельченного хлеба тщательно растирают в фарфоровой ступке с небольшой пор­цией 2 н. раствора серной кислоты, количественно перено­сят в мерную колбу вместимостью 50 мл и гидролизуют на кипящей водяной бане в течение 90 мин. Затем колбу охлаждают, доводят водой до метки и фильтруют. Первые порции фильтрата отбрасывают. Из последующих в мерную колбу вместимостью 50 мл берут 25 мл фильтрата, нейтра­лизуют его 10 н. раствором гидроксида натрия в присут­ствии фенолфталеина. При необходимости избыток щелочи удаляют 5 н. раствором серной кислоты. После этого к раствору приливают 2 мл сернокислого цинка, несколько капель спирта и по каплям добавляют 4 н. раствор гидро­ксида натрия до появления осадка- и бледно-розовой ок­раски. Содержимое колбы 10 мин перемешивают, доводят водой до метки и фильтруют.

Для проведения цветной реакции берут 8 пробирок с притертыми пробками. В три пробирки (1-ю—3-ю) нали­вают по 5 мл рабочего раствора никотиновой кислоты, в четыре пробирки — (4-ю—7-ю) — по 5 мл полученного фильтрата и в одну пробирку (8-ю) наливают 5 мл дистил­лированной воды. Эту пробирку используют для внесения поправки на реактивы.

Все пробирки помещают для нагревания в водяную баню при 50° С на 5 мин. Затем в 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, и 8-ю пробирки приливают по 2 мл роданобромидного раствора. 6-ю и 7-ю пробирки используют для поправки на аминоре­агирующие вещества. Содержимое пробирок с родано- бромидным реактивом перемешивают встряхиванием и нагревают на водяной бане при 50°С в течение 10 мин. За­тем пробирки охлаждают и оставляют в темном месте на 10 мин. После охлаждения в 1-, 2-, 3-, 4,- 5-, и 8-ю пробир­ки добавляют по 3 мл раствора метола, а в 6-ю и 7-ю — по 2 мл воды. Содержимое их перемешивают и оставляют на 1 ч в темном месте. Полученные окрашенные растворы,а также содержимое пробирок, взятых для введения по­правок, колориметрируют на фотоэлектроколориметре. Для расчетов берут средние величины из двух определений.

Содержание никотиновой кислоты X, мг на 100 г продук­та, рассчитывают по формуле

X = (A₁ — A₂)V₁V₃d•100/[(A₃ — A₄)V₂V₄р•1000],

где А₁ и А₂ — оптическая плотность соответственно испы­туемого раствора и используемая для поправки на амино­реагирующие вещества; А₃ и А₄— оптическая плотность соответственно стандартного раствора никотиновой кислоты и используемая для поправки на реактивы; V₁— объем гидролизата, 50 мл; V₂ и V₃— объем гидролизата, взя­того соответственно перед очисткой сернокислым цинком и после нее, 25 и 50 мл; V₄— объем раствора, взятого для цветной реакции; d — содержание никотиновой кислоты в 5 мл стандартного раствора, мкг; р — навеска, г.

Реактивы.

1. 2 н. раствор серной кислоты.
2. 0,1 н. раствор серной кислоты.
3. 10 н. раствор
4. 4 н. раствор
5. 80%-ный раствор сернокислого цинка.
6. Роданобромидный раствор (готовят перед употребле­нием) — к охлажденной бромной воде прибавляют по каплям 10%-ный раствор роданистого калия или аммония до окра­шивания сначала в светло-желтый цвет, а затем прибавляют 1%-ный раствор этих реактивов до обесцвечивания. После этого добавляют 20—50 мг углекислого кальция до образо­вания осадка. Раствор фильтруют и хранят на холоде в темноте.
7. Основной раствор никотиновой кислоты. Готовят его из расчета 1 мг никотиновой'кислоты в 1 мл. 10 н. рас­твора серной кислоты.
8. Рабочий раствор никотиновой кислоты. Готовят ежедневно из основного раствора из расчета 5 мкг кис­лоты в 1 мл раствора.
9. Раствор метола. К 100 г метола, смешанного с 0,7 г бисульфата натрия, добавляют 500 мл 0,1 н. раствора серной кислоты, нагретой до кипения, и вновь подогревают до кипения. При появлении окраски раствора добавляют ак­тивированный уголь и фильтруют раствор. К фильтрату добавляют 0,3 г бисульфата натрия, 700 мл спирта и помещают в ледяную баню на несколько часов (в темноте). Выпавшие кристаллы отфильтровывают, промывают и вы­сушивают на воздухе в темноте. Хранят в темной склянке с притертой пробкой. 80%-ный раствор метола на 0,5 н. растворе НСl готовят в день анализа.

Метод определения содержания каротиноидов. Этот метод заключается в экстракции каротиноидов смесью петролейного эфира и ацетона в аппарате Соксле, после­дующем омылении полученного экстракта гидроксидом натрия или калия и отделении каротиноидов от сопутству­ющих пигментов. Общее содержание каротиноидов опре­деляют на фотоэлектроколориметре. Разделяют их методом тонкослойной хроматографии с последующим спектрофото- метрированием.

Ход определения следующий. В патрон из фильтро­вальной бумаги помещают 10 г муки и подвешивают его к крючкам обратного холодильника. В круглодонную колбу наливают 30 мл смеси петролейного эфира и ацетона в соотношении 1 : 1 и закрывают ее обратным холодильни­ком. Пары растворителя, конденсируясь в холодильнике, стекают на муку, пропитывают ее и возвращаются в колбу. Экстракцию ведут в атмосфере азота. Продолжительность экстракции 30 мин с момента закипания.

К полученному экстракту приливают примерно равный объем 5%-ного спиртового раствора гидроксида калия и омыляют в течение 90 мин. Затем омыленный раствор переносят в делительную воронку и дают расслоиться. Ацетоновый слой удаляют, а отделившийся слой петролейного эфира, содержащий каротиноиды, промывают два-три раза 85%- ным этанолом, затем дистиллированной водой до исчезно­вения щелочной реакции по фенолфталеину.

Полученный экстракт каротиноидов помещают в колбу и добавляют к нему обезвоженный сульфат натрия для удале­ния примеси воды. Затем экстракт переносят в мерную кол­бу вместимостью 50 мл и доводят петролейным эфиром до метки. Общее содержание каротиноидов определяют ко­лориметрически при синем светофильтре (длина волны 453 нм) при толщине слоя в кювете 20 мм. Содержание кароти­ноидов определяют по калибровочной кривой. Для ее постро­ения готовят стандартный раствор кристаллического каро­тина, или азобензола (C₀H₅N-NC₆H₆), или хромпика (К₂Сг₂О₇).

При растворении 145 мг азобензола в 100 мл спирта получается раствор, эквивалентный по окраске 2,35 мг каро­тина в 1 л петролейного эфира, а 1 мл 0,036%-ного раствора в воде К₂Сг₂0₇ соответствует 2,08 мг каротина в 1 л петро- лейного эфира.

Этим же методом можно определять содержание каро­тиноидов в хлебе. Для этого 20 г измельченного мякиша помещают в колбу для экстракции и добавляют 30 мл сме­си петролейного эфира и ацетона. Далее поступают так же, как при определении содержания каротиноидов в муке.

Содержание каротиноидов X, мкг на 100 г продукта, вычисляют по формуле

X=aV • 100/р,

где а—содержание каротиноидов в 1 мл петролейного эфира, найденное по калибровочной кривой, мкг; V — об­щий объем раствора, подвергшегося колориметрированию, мл; 100 — пересчет на 100 г продукта; р — навеска иссле­дуемого продукта, г.

Разделяют каротиноиды методом тонкослойной хрома­тографии. Для этого экстракт каротиноидов упаривают до­суха при разрежении в атмосфере азота, а затем растворяют в 1—2 мл петролейного эфира. На стеклянную пластинку размером 130 X 180 мм наносят слой окиси алюминия II степени активности толщиной 0,5—1,0 мм. На расстоянии 1,5—2 см от края пластинки наносят 0,06—1 мл экстракта в виде полоски. В качестве свидетеля применяется раствор синтетического каротина.

В хроматографическую камеру за 20 мин до подготовки пластинки наливают смесь растворителей: бензина, петролей­ного эфира, ацетона и метанола в соотношении 40 : 10 : 4 : 1. Пластинку ставят в кювету наклонно под углом 25°. После разделения пигментов пластинку вынимают из кюветы, тщательно снимают с нее адсорбент с пятнами и элюируют хлороформом. Спектры поглощения элюатов снимают на спектрофотометре СФ-10 или СФ-14. Каротиноиды иденти­фицируют по максимумам поглощения их хлороформен­ными растворами.

Для разделения каротиноидных пигментов можно так­же применять адсорбционную колоночную хроматографию. В этом случае семь пигментов вносят в трехслойную хрома­тографическую колонку. Верхний слой (1—1,5 см) состоит из окиси алюминия, второй слой (3—4 см) — из гидрата окиси кальция, третий, нижний (5—6 см) — снова из окиси алюминия. Идентификация выделенных на колонке пигментов такая же, как и в случае тонкослойной хромато­графии.

Реактивы. 1. Петролейный эфир. 2. Ацетон. 3. 5%-ный спиртовой раствор гидроксида калия. 4. 85%-ный этанол. 5. 0,1%-ный раствор фенолфталеина. 6. Обезвоженный суль­фат натрия. 7. Кристаллический р-каротин. 8. Окись алю­миния II степени активности. 9. Бензин. 10. Метанол. 11. Хлороформ.

Ускоренный метод определения общего содержания ка­ротина (провитамина А). В КТИПП получены данные, по­казывающие, что при определении каротиноидов в хлебе более полное извлечение их из навески происходит при не­посредственном омылении продукта.

Для определения 10 г мякиша хлеба измельчают и по­мещают в колбу для экстракции с обратным водяным хо­лодильником. Туда же добавляют 50 мл 5%-ного спиртово­го раствора гидроксида калия. Омыляют на водяной бане при 80° С в течение 1 ч в токе азота.

Полученный экстракт переносят в делительную ворон­ку, добавляют к нему 30 мл петролейного эфира (темпе­ратура кипения 40—70°С) и 20—30 мл дистиллированной воды. При этом каротиноиды переходят в петролейный эфир. Эту операцию производят два-три раза.

Полученный петролейный экстракт промывают несколь­ко раз дистиллированной водой до отсутствия щелочной ре­акции по лакмусу. Сушат безводным сернокислым натрием, фильтруют, переносят в колбу вместимостью 100 мл, до­водят объем до метки петролейным эфиром и измеряют экстинцию на фотоэлектроколориметре. По калибровочной кривой определяют содержание каротиноидов в экстракте.

При определении каротиноидов в изделиях, содержащих жир, применение этой методики затруднено из-за образования после омыления устойчивой эмульсии. В этом случае навес­ку муки или хлеба подвергают либо холодной экстракции растиранием с ацетоном, либо горячей экстракции 30 мл ацетона в колбе на водяной бане с обратным холодильни­ком в течение 30 мин в атмосфере азота. Затем производят получасовое омыление 50 мл 5%-ного спиртового раствора щелочи, охлаждают, переносят в делительную воронку и далее ведут определение так, как при анализе изделий, не содержащих жира.