Для осуществления любого биотехнологического процесса необходимы культура микроорганизмов, питательная среда, аппаратура для выращивания и проведения вспомогательных операций, средства контроля и управления.

Культивирование является основной стадией технологического процесса и во многом определяет количественные и качественные характеристики производства биопрепаратов.

На стадии культивирования осуществляется накопление как самой биомассы, так и продуктов метаболизма (жизнедеятельности) микроорганизмов.

Иногда, например при производстве бактериальных препаратов, целевым продуктом является сама биомасса, в других случаях продукты, синтезируемые клеткой, – антибиотики, ферменты, аминокислоты и др. При этом синтезируемый продукт может накапливаться как внутри клеток, так и выделяться в среду культивирования. Необходимые полезные свойства целевых продуктов (клеток или продуктов метаболизма) создаются в основном на стадии культивирования. Основная задача на последующих стадиях состоит главным образом в том, чтобы при выделении, сушке и других операциях максимально сохранить и стабилизировать эти полезные свойства.

Культивирование – это процесс выращивания микроорганизмов в (на) питательной среде, в результате которого происходит размножение и накопление их биомассы и продуктов метаболизма (продуктов микробного синтеза).

В том случае, когда культура растет на поверхности жидкой питательной среды, потребляя содержащиеся в ней субстраты и выделяя в эту среду продукты метаболизма, такой способ культивирования называют поверхностным. При твердофазном культивировании клетки растут на поверхности плотной питательной среды, содержащей достаточное количество влаги и питательных веществ.

При глубинном способе культивирования микроорганизмы распределяются по всему объекту жидкой питательной среды, а кислород и питательные вещества поступают к клеткам в результате интенсивного перемешивания. Этот способ наиболее широко применяется в настоящее время в производстве большинства препаратов по следующим причинам.

1. Позволяет получить большое количество бактериальной массы за короткое время. Так, при культивировании микроорганизмов группы кишечной палочки в условиях состояния покоя количество микробов не превышает 1–2 млрд см³, а с применением принудительной аэрации урожайность, в зависимости от состава питательной среды достигает 50–60 млрд см³. Это объясняется тем, что при аэрации практически отсутствует начальная стационарная фаза и бактерии сразу начинают интенсивно размножаться, переходя в логарифмическую фазу.
2. Процесс легко управляем. При глубинном выращивании имеются существенные различия в степени потребления углеродных и азотистых веществ. Они интенсивно потребляются при аэрации культуральной жидкости, поэтому, чтобы процесс роста и размножения не прекращался быстро, нужно в процессе культивирования дополнительно вводить углеродные и азотистые соединения, а при необходимости и другие стимуляторы роста микроорганизмов.
3. Добавление питательных веществ, особенно углеводных (глюкоза) и биологических стимуляторов, усиливает интенсивность размножения, что и приводит к увеличению концентрации микроорганизмов. Данный способ позволяет легко корректировать рН среды в процессе культивирования, что очень важно для достижения максимальной интенсивности размножения.
4. При данном способе культивирования отмечена максимальная воспроизводимость результатов.

Технологический процесс глубинного выращивания микроорганизмов в аппаратах-культиваторах (ферментерах) складывается из следующих этапов: отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними; приготовление посевной микробной культуры; приготовление и стерилизация питательных сред; подготовка культиватора к посеву; внесение посевного материала в культиватор; выращивание микроорганизмов для контроля процесса культивирования.

Кроме того, он включает ряд вспомогательных операций: стерилизацию оборудования и коммуникаций; приготовление пеногасителей и дополнительных растворов.

Эталонные или референтные штаммы хранятся и поддерживаются в ВГНКИ. Эти штаммы, в свою очередь, являются производственными, поскольку на их основе готовятся вакцины.

При этом инактивированные вакцины, как правило, готовятся из высоковирулентных штаммов, а живые вакцины – из аттенуированныx (ослабленных), авирулентных штаммов.

Наряду с производственными, эталонными штаммами в ВГНКИ хранятся контрольные штаммы, которые используют для оценки качества вакцинных препаратов. Эти штаммы должны быть генетически однородными популяциями микроорганизмов со стабильным морфологическими, специфическими и биологическими свойства-; ми. Основные требования к этим штаммам – их высокие антигенные] и иммуногенные свойства.

Антигенные свойства штаммов оцениваются по титру антител в сыворотке крови чувствительных животных через определенные cpoки после введения им микроорганизмов.

Иммуногенные свойства штаммов определяются по устойчивости привитых животных к заражению возбудителем болезни определенной дозой контрольного (вирулентного) штамма и выражаю; 50 %-й дозой иммунногенности (ImD₅₀) или по нарастанию титра антител в сыворотке крови. При этом 80 % привитых животных должна быть специфически невосприимчивы к инфекции.

Безвредность (реактогенность) эталонного, производственном штамма проверяют по показателю потери массы и по выраженности реакции у лабораторных и естественно-восприимчивых животных на 5–10-кратное увеличение прививочной дозы.

Производственные, эталонные штаммы должны сохранять генетическую стабильность антигенных, иммуногенных и других присущих им биологических свойств на протяжении 10 последовательных пересевов как in vivo, так и in vitro.

Обычно производственное культивирование микроорганизмов при приготовлении вакцин осуществляют в больших объемах. Поэтому вначале из имеющегося эталонного штамма микроорганизма, находящегося, как правило, в лиофильно высушенном состоянии в ампуле, делают посевы в небольшие емкости на скошенный в пробирках агар, во флаконы емкостью 100 или 200 мл, заполненные наполовину питательной средой. Затем из пробирок и флаконов делают пересевы в большие емкости – бутыли объемом 18–20 л.

При хорошем накоплении микроорганизмов выросшую в 20-литровых бутылях посевную культуру вносят в реактор. Необходимое количество посевной культуры для производственного культивирования микроорганизмов составляет от 1 до 10 % объема питательной среды. Посевные микробные культуры контролируют на сохранение ими типичных морфологических, культуральных, биохимических, антигенных и иммуногенных свойств и отсутствие в них посторонней микрофлоры (ПМФ).

В промышленных условиях питательные среды обычно готовят в отдельном цехе, обеспечивающем потребности всех основных цехов предприятия. Среды готовят в емкостях, снабженных механическими мешалками, добавляя в определенной последовательности растворимые (соевая мука, кукурузная мука, мел) компоненты. При необходимости отдельные компоненты подвергают дополнительной обработке измельчению, просеиванию, отвариванию, экстрагированию. Для лучшего растворения компонентов среду нагревают до 70–80 °С острым паром. Когда в приготовлении питательной основы используют гидролизаты, контролируемым показателем качества является содержание аминного азота, уровень которого доводят путем разведения до необходимых величин. При приготовлении питательных сред для глубинного культивирования особое внимание уделяют их тщательной гомогенизации. Твердые частицы нерастворимых компонентов должны быть достаточно мелкими, что обеспечивает надежность стерилизации, поскольку крупные частицы медленнее прогреваются, при этом повышается вероятность сохранения в них посторонней микрофлоры, особенно при непрерывной стерилизации.

Приготовленную питательную среду стерилизуют в установках непрерывной стерилизации (УНС) и передают в цех культивирования, заполняют ею предварительно простерилизованные реакторы. В некоторых случаях среду стерилизуют непосредственно в культиваторе (обычно при небольших объемах среды). Реактор заполняют на 2/3 его объема. Перед началом культивирования берут пробы среды с целью определения качества стерилизации. Это достигается путем высева из отобранных проб на МПБ, МРБ, агар Сабуро или Чапека.

Культиватор имеет рубашку для нагревания паром и охлаждения водой с соответствующей запорной арматурой. Внутри реактора имеется турбинная механическая или электромагнитная мешалка со скоростью вращения 150–600 об/мин, устройство для подачи воздуха. На крышке реактора имеются отверстия для подачи дополнительных растворов, внесения посевного материала, отвода отработанного воздуха, порточная ячейка Ph-метрии, смотровое окно, устройство для взятия проб, внесения пеногасителя, глюкозы и других питательных веществ, а при необходимости и факторов роста. Современные реакторы оснащены различными измерительными приборами.

Глубинный способ выращивания в АКВ позволяет получать более стабильные результаты по стерильности и накоплению микробной массы.

Выращивание микроорганизмов в биореакторе может осуществляться с применением активной аэрации микробных культур, в покоящемся состоянии без применения механических мешалок (без аэрации), в состоянии анаэробиоза.

Промышленное культивирование микроорганизмов с применением активной аэрации осуществляют в реакторах объемом от 0,01 до 100 м³, как правило, в асептичесих условиях. Пустой аппарат тщательно моют, проверяют герметичность, стерилизуют острым паром. Одновременно стерилизуют все коммуникации. Затем в реактор подают простерилизованную в УНС и охлажденную до 25–35 °С питательную среду, вносят посевной материал в количестве 5–10 % объема питательной среды, включают систему аэрации и перемешивающее устройство. Так, для л истерий и сальмонелл скорость вращения механической мешалки составляет 150–180 об/мин, а культура микробов аэрируется подогретым до 37 °С очищенным, стерильным воздухом с коэффициентом подачи 1,5 л воздуха на 1 л среды в одну минуту. Коэффициент заполнения реактора равен 0,6. Превышение этой величины может привести к значительному пенообразованию, уносу ее воздухом и нарушению асептических условий.

Температуру культивирования поддерживают путем подачи охлаждающей воды в рубашку и другие теплообменные устройства аппарата. Оптимальная температура для разных микроорганизмов различна, обычно от 25 до 37 °С.

Для регулирования рН культуральной жидкости в ходе культивирования добавляют соответствующие титрующие агенты – щелочи, кислоты, раствор аммиака, глюкозы и др. Продолжительность выращивания микроорганизмов в культиваторе 18–24 ч, для спорообразующих она колеблется от 40 до 250 ч (для актиномицетов и микроскопических грибов).

Процесс культивирования контролируют по изменениям температуры, рН, расхода воздуха, частоты вращения мешалки, содержанию О₂, а также путем периодического отбора проб (через 1–12ч в зависимости от длительности процесса). В пробах определяют содержание углеводов, общего и аминного азота, наличие посторонней микрофлоры, исследуют морфологию микробных клеток

Технология культивирования в покоящемся состоянии без аэрации осуществляется с микроорганизмами, относящимися к группе микроаэрофильных (возбудители бруцеллеза, лептоспироза, кампилобактериоза и др.), которые не требуют принудительной аэрации питательтной среды, в которой они выращиваются. Применяют баллоный и реакторный способ культивирования. Баллоный способ культивирования лептоспир заключается в том, что микробные культуры лептоспир каждого серологического варианта выращиваются в 20-литровых стеклянных бутылях с 10–12 литрами сывороточной или альбуминно-сывороточной (производственной) средами при 27–28 °С в течение 5–7 суток. Реакторный способ культивирования осуществляется в АКВ.

К анаэробным микроорганизмам относятся такие, которые способны жить и размножаться при отсутствии атмосферного кислорода. В силу биологических особенностей анаэробов методы культивирования их в промышленности имеют свои особенности. При культивировании анаэробных микроорганизмов в реакторах создаются условия полного вытеснения из питательной среды свободного кислорода. Это достигается путем заполнения анаэробостатов газовой смесью водорода и диоксида углерода, остаточный кислород удаляется путем каталитического связывания с воздухом. Анаэробные условия могут быть достигнуты также добавлением в среду восстанавливающих агентов таких, как цистина и сульфида натрия, аскорбиновой кислоты. Степень анаэробиоза определяется показателем окислительно-восстановительного потенциала. При культивировании анаэробов необходимо постоянно корректировать рН среды, поддерживая се в пределах 7,2–7,8. В процессе выращивания анаэробов рН среды очень быстро снижается в кислую сторону, что приводит к ингибированию их роста.

При глубинном выращивании микроорганизмов их культуры могут находиться в периодических или закрытых, и непрерывных – открытых системах.

Закрытой называют такую систему, когда хотя бы один из компонентов питательной среды или она вся не может ни поступать в систему, ни покидать ее. В такой системе скорость роста микроорганизмов должна после ускорения стремиться к нулю из-за недостатка субстрата или из-за гибели микробных клеток вследствие накопления ими продуктов метаболизма. Следовательно, периодические культуры микроорганизмов находятся в неустойчивом состоянии.

Открытая (хемостатная) система – это когда питательные компоненты могут поступать в реактор, в котором выращивается тот или иной микроорганизм, и удаляться из реактора в виде продуктов синтеза микроорганизмов (антибиотики, витамины, ферменты и т.д.) или биомассы самих микроорганизмов. При этом скорость поступления питательной среды в реактор и удаление из него продуктов синтеза или биомассы можно регулировать в нужной среде размножения микроорганизмов.

В периодическом состоянии динамика роста и размножения микроорганизмов в жидкой питательной среде обладает рядом особенностей, общих для бактерий, актиномицетов, микроскопических грибов, микоплазм и других про- и эукариот. При индивидуальном развитии им свойственна высокая скорость размножения. Развитие происходит в виде последовательных фаз, характер и продолжительность которых зависят от физиологического состояния клеток, определяемого в свою очередь условиями разнообразных факторов среды, в которой развивается популяция того или иного организма.

Другими словами, фазы роста микроорганизма отражают количественные и качественные изменения в их биомассе и окружающей среде. В простой гомогенной периодической культуре микроорганизмов разные авторы выделяют от 4 до 8 и даже до 16 фаз.

Рост микробной популяции изображают обычно графиками, откладывая на оси абсцисс – время роста, а на оси ординат – число микробных клеток. Каждая фаза является суммированным выражением размножения и отмирания клеток в микробной популяции.

Каждая фаза роста и размножения микроорганизмов характеризуется следующим образом:

1. Исходная фаза является фазой задержки (лаг-фаза) роста, когда размножения микробных клеток не происходит.
2. Фаза положительного ускорения роста. Длительность этого периода для большинства микроорганизмов составляет 2 ч и зависит от температуры, состава питательной среды, качества посевного материала. Многие авторы эти две фазы рассматривают вместе. Число клеток остается постоянным из-за отсутствия в этот период клеточного деления. Общее состояние микробных клеток характеризуется как состояние приспособления к питательной среде. В этот период усиливается синтез веществ, клеток, они увеличиваются в размере, в них образуется большое количество индуцибельных ферментов.
3. Фаза логарифмического (лог-фаза) или экспоненциального (показательного) роста характеризуется постоянной и максимальной скоростью роста клеток. Рост микробов в этой фазе происходит в геометрической прогрессии. Продолжительность генерации в лог-фазе у разных микроорганизмов не одинакова. Так, величина gдля сальмонелл равна 20–30 мин, для стрептококков и стафилококков 25–35 мин, для эшерихий 15–17 мин. На продолжительность генераций влияют температура, рН, состав среды, скорость оборотов мешалки и другие параметры культивирования. В период логарифмического роста величина микробных клеток по сравнению с лог-фазой уменьшается и делается относительно постоянной.
4. Фаза отрицательного ускорения. В этой фазе скорость размножения замедляется, а время генерации увеличивается. Наступление этой фазы обусловлено истощением питательной среды и накоплением в культуральной жидкости токсических веществ, которые начинают ингибировать развитие культуры. Кроме того, в этой фазе происходит наивысшие накопление микробной массы в единице объема.
5. Стационарная фаза роста или максимума, на протяжении которой численность микробной популяции не уменьшается. В этой фазе скорость разножения и отмирания клеток одинаковая. Концентрация живых клеток в этой фазе достигает максимума, и она называется М-концентрацией. В этой фазе биомасса микроорганизмов и продукты их биосинтеза обладают наибольшей биотехнологической ценностью.
6. Фаза отмирания микробной популяции. Любая микробная популяция, растущая в сосуде с несменяемой средой, вступает после фазы стационарного роста в стадию отмирания.

Продолжительность стадии отмирания у различных микроорганизмов не одинакова: у пневмококка она составляет 2–3 суток, у эшерихий – несколько месяцев. В этот период в культуре значительно снижается уровень живых клеток, у них уменьшается биохимическая и антигенная активность. Учитывая это, для изготовления ряда биопрепаратов отбирают культуры микроорганизмов чаще всего в фазе отрицательного ускорения роста или в начале стационарной фазы, когда концентрация живых микробных клеток приближается к максимальной.

Хемостатное, или непрерывное, культивирование представляет собой прочную систему в которой жизнеспособность микробной популяции поддерживается непрерывной подачей свежей питательной среды и постоянным отбором микробной биомассы или образовавшихся продуктов метаболизма. При этом культура микроорганизмов как бы фиксируется в стационарной фазе роста, что позволяет получать нужные продукты обмена в максимальном количестве.

Нужно сказать, что до 50-х годов для культивирования микроорганизмов с целью их всестороннего изучения служила простая периодическая культура. Только с переходом к методу хемостатного культивирования обнаружился недостаток периодической культуры, которая не дает полного представления обо всех изменениях, происходящих в клетке, и о влиянии внешних факторов на протекающие в ней процессы.

Развитие хемостатного культивирования открыло возможность управлять процессом, контролируя рост и поведение микроорганизмов, а при необходимости вмешиваться в этот процесс, изменяя скорость роста до задаваемых пределов путем воздействия на такую культуру внешними факторами. В настоящее время интерес к непрерывному культивированию растет как в нашей стране, так и за рубежом. Однако несмотря на преимущества хемостатных культур, в биологической промышленности при производстве вакцин они не получили еще достаточно широкого применения по следующим причинам: технические трудности, в первую очередь связанные с созданием асептических условий; не во всех случаях непрерывный процесс предпочтительнее периодического, поскольку при низкой удельной скорости биомассы периодический процесс по эффективности не уступает непрерывному и более выгоден, так как его проще осуществить. Интенсивный биосинтез многих продуктов метаболизма происходит при медленном росте биомассы, поэтому в периодических процессах концентрация целевого продукта в культуральной жидкости обычно выше, чем в непрерывных, что существенно повышает эффективность стадий выделения и очистки продукта.

Все это свидетельствует о том, что периодические процессы в будущем найдут более широкое применение.

Вирусы являются внутриклеточными микроорганизмами, поэтому они на искусственных питательных средах не растут. Для выращивания их используют живые лабораторные модели: лабораторных или сельскохозяйственных животных, развивающиеся куриные эмбрионы (РКЭ) или эмбрионы других птиц, а также культуру клеток приготовленную из тканей животных или людей.

С начала открытия вирусов в течение многих лет выращивании вирусов осуществляли и продолжают осуществлять по настоящее время заражением животных. Причем в начале развития вирусологи» этот метод являлся единственным методом культивирования вирусов. С одной стороны, этот метод был необходим для изучения многих вопросов вирусологии особенно при диагностике вирусных заболеваний, а также при приготовлении ряда противовирусных вакцин. В то же время этот метод культивирования вирусов вскоре стал серьезным препятствием в получении высококачественных и в достаточном количестве вакцин для нужд животноводства и медицины. Кроме того, как было установлено, не все животные одинаково чувствительны к различным вирусам.

Но, несмотря на указанные ограничения, и сейчас некоторые виды лабораторных и сельскохозяйственных животных используют для культивирования вирусов. Обычно выбор животного зависит от применяемого вида вируса. В качестве лабораторных моделей используют белых мышей (иногда новорожденных) и крыс, желательно инбредных линий, золотых сирийских хомяков, морских свинок, хорьков, кроликов, собак, кур, голубей, обезьян, овец, телят, жеребят, поросят и др.

Наиболее пригодными для культивирования вирусов являются животные, свободные от специфических патогенных возбудителей заболеваний, а также животные-гнотобионты (стерильные животные).

Перед заражением у животных обрабатывают место инъекции,; после чего с учетом тропизма вируса вводят вирусосодержащий материал оральным, ректальным, интраназальным, накожным, внутрикожным, подкожным, внутримышечным, внутривенным, внутрибрюшинным способами, а также в мозг, на роговицу глаза, в тестикулы, и иногда другими методами.

Зараженных содержат изолированно от здоровых животных и за ними ведут клинические наблюдения. Признаками заражения животных является развитие типичных клинических симптомов заболевания или их гибель.

При производстве противовирусных биопрепаратов лабораторных животных используют для контроля, а также для приготовления некоторых тканевых вирусных вакцин. Типичным примером является производство антирабической фенол-вакцины из мозга овец, зараженных вирусом-фикс бешенства, формол-вакцины против ящура из вирусов, полученных после заболевания крольчат (лапинизированный вирус), некоторых вакцин против оспы, изготовленных из тканей, содержащих вирус оспы, и т. д.

Рассмотрим кратко технологию культивирования аттенуированного штамма С 113/86 вируса оспы овец, из которого в настоящее время готовят сухую живую вакцину против оспы данного вида животных. Для этого 5–6 овец заражают вирусосодержащей суспензией лиофилизированного вируса оспы указанного штамма, которую готовят путем разведения 1:100. Предварительно у овец выстригают и выбривают шерсть со стороны брюшной полости и тщательно обрабатывают ее дезинфицирующей жидкостью. Вирусосодержащий материал вводят внутрикожно в несколько точек в области брюшной стенки, вводя в каждую точку по 0,2–0,6 см³ вируса. После заражения за животными ведут наблюдение. В соответствии со стадиями развития оспенного процесса на месте введения вируса через 3–4 сут развивается обильная кожная экзантема и на коже появляются красные пятнышки. Примерно еще через 3–4 сут на месте заражения появляются плотные узелки (папулы), окруженные возвышающимся красным пояском. На 7–10-е сутки, не ожидая следующих стадий развития оспенного процесса, животных убивают. У них препарируют кожу и со всей поверхности брюшной стенки срезают папулы. От каждой овцы папулы собирают в отдельные специальные емкости. Собранный материал хранят при–40 °С до получения из него вакцины.

Начало применения развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) Для выращивания вирусов приходится на 1928–1935 годы. Этот период австралийский ученый Бернет назвал «первой золотой эпохой» Развития вирусологии, поскольку она открыла возможность культивирования вирусов в довольно удобной живой лабораторной модели в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ), как правило, интактных по отношению ко многим возбудителям инфекционных болезней.

В РКЭ способно развиваться большинство вирусов. Это обусловлено тем, что куриный эмбрион содержит четыре различных естественных питательных субстрата для размножения вирусов: амнион, аллантоис, хориоаллантоисную мембрану и желточный мешок, клетки которых, как и клетки самого эмбриона, являются высокочувствительными к различным вирусам. Вследствие этого куриные эмбрионны пригодны для выделения вирусов из патологического материала, получения антигенов, определения титров инфекционности вирусов, постановки реакции нейтрализации и т. д. В силу высокой производительности и накопления некоторых вирусов РКЭ используют как модель для получения вакцин против ряда заболеваний животные d человека.

Для получения РКЭ используют яйца от белых леггорнов, имеющие тонкую скорлупу. Они должны быть свежими (не позднее десяти суток). В противном случае развитие зародыша, несмотря на оплодотворение, сильно задерживается. Яйца должны быть чистыми, но не мытыми. Инкубацию проводят в обычных инкубаторах с автоматическим приспособлением для переворачивания яиц, вентилятором термометром и гигрометром. Работу проводят при 37,2–38,7 °С и влажности 60–70 %. Возраст РКЭ, используемых для работы, зависит от вируса, которым будут заражать куриные эмбрионы. Однако независимо от этого яйца нужно овоскопировать через 3–4 суток, для того чтобы удалить неоплодотворенные яйца (болтуны) и яйца с погибшими эмбрионами. Дальнейшее развитие эмбрионов проводят с соблюдением вышеуказанных условий. Обычно развивающиеся куриные эмбрионы заражают в возрасте 7–11 сут.

Работу по заражению РКЭ проводят в стерильном боксе, где имеются рабочие столы, стулья, куда подведены вода, газ, вакуум. Перед началом работы стол дезинфицируют. Заранее готовят необходимые инструменты, асептический раствор, йодированный спирт, согнутый зубной зонд или бормашину для просверливания скорлупы. Заражение эмбрионов проводят при помощи стерильных специальных шприцов и игл. Расплавленным парафином заливают отверстия в скорлупе после заражения. Кроме того, необходима емкость с дезинфицирующей жидкостью для использованного инструмента. В боксе должна быть специальная подставка для яиц. Вне зависимости от патогенности используемых вирусов работа производится в масках, защитных очках, резиновых перчатках, в специальных костюмах для стерильных помещений.

В настоящее время согласно международным требованиям (GMP) работу с вирусосодержащим материалом проводят в ламинарныx боксах, обеспеченных избыточным поддувом стерильного воздуха проходящего через мембранные фильтры.

Заражение куриных эмбрионов проводят заранее подготовленным вирусом в дозировках, оттированных по LD₅₀. Чтобы иметь стерильную (без бактерий) суспензию вируса, полученную из куриного эмбриона, к инокулируемому вирусному материалу добавляют по 100–1000 мг стрептомицина и 100–1000 ЕА пенициллина.

Способы заражения куриных эмбрионов зависят как от вида используемого вируса, так и от цели заражения. Введение вируса произиодят в аллантоисную полость, в амнион, нахориоаллантоисную оболочку или в желточный мешок.

В промышленных условиях на биопредприятиях при объемном производстве антигенов и противовирусных вакцин наиболее часто применяется метод заражения куриных эмбрионов в аллантоисную полость. Остановимся на технологии получения вирусного материала из куриных эмбрионов, зараженных этим способом.

Перед получением вируса скорлупу над воздушной камерой дезинфицируют и отделяют ножницами или пинцетом. Нижнюю пленку подскорлуповой оболочки, формирующую пугу, и хориоаллантомсную оболочку прокалывают и отсасывают пипеткой или специальным аппаратом, аллантоисную жидкость. Из одного эмбриона в зависимости от его возраста можно собрать до 8–10 мл аллантоисной жидкости. Полученную аллантоисную жидкость проверяют на стерильность путем высевов на питательные среды, а также на содержание вируса и его количества путем постановки реакции гемагллютинации.

Способ культивирования вирусов в аллантоисной полости куриных эмбрионов в биопромышленности используется при получении антигенов для диагностики гриппозных инфекций у людей, лошадей, птиц, а также для получения живых и инактивированных вакцин против гриппа у людей, животных и птиц, псевдочумы птиц из штамма «Н», инфекционного ларинготрахеита птиц и др.

В ряде случаев живые вакцины готовят из вирусов, выращенных на хориоаллантоисной оболочке куриных эмбрионов (например, сухая эмбрион-вакцина из голубиного вируса против оспы птиц). Для получения вирусного материала в таком случае яйцо разрезают вдоль до конца воздушной камеры. Эмбрион, желточный мешок и белок удаляют, а хориоаллантоисную оболочку собирают пинцетом, переносят в сосуд для промывания в растворе Хенкса. При просмотре хориоаллантоисных оболочек на темном фоне можно хорошо видеть множество очагов некроза, число которых указывает на степень размножения вирусов.

Значительным вкладом в развитие вирусологии явилось применение тканевых культур, что существенно продвинуло вперед вирусологические исследования.

Культивирование вирусов вне организма связано с открытием возможности выращивания вирусов полиомиелита в экстраневральныхтканях (А. Эндерс, Н. Робинсон, С. Веллер, 1949) и усовершенствованием метода тканевых культур (Д. Дульбекко и др., 1952). Этому в офомной степени также способствовало открытие антибиотиков, создание синтетических и полусинтетических питательных сред.

Широкое применение культивирования вирусов в клеточных культурах началось в 1950–1957 гг. И этот период известным в мире вирусологом Д. Бернетом назван «второй золотой эпохой» развития вирусологии.

Главным преимуществом перед другими методами культивирования вирусов способ культур тканевых клеток является относительно дешевым и благодаря этому он может быть использован для культивирования практически всех известных вирусов. При помощи культур клеток можно получить достаточно «чистый» вирус, с небольшим числом чужеродных антигенов, в виде клеточных компонентов, что очень важно при приготовлении противовирусных вакцин, сывороток и диагностикумов.

В настоящее время на биопредприятиях Российской Федерации на основе клеточных культур производится более 40 вирусных вакцин, обеспечивающих надежную профилактику вирусных инфекций у животных. В необходимых случаях на основе культур клеток производят иммуноферментные и другие высокочувствительные диагностикумы для выявления вирусных инфекций. Приготовление указанных препаратов требует высокой чистоты производства, создания банков клеточных культур и вирусов.

В вирусологии наиболее часто используют следующие культуры клеток:

– однослойные (монослой) – это клетки тех или иных органов или тканей, растущие в один слой на поверхности сосуда. Следует заметить, что все клеточные культуры, фиксированные к стенке сосудов, в которых они выращиваются, являются однослойными. Это необходимо учитывать при характеристике других клеточных культур и их линий;
– первичная – это такая культура, для которой использованы клетки, органы или ткани, взятые непосредственно изорганизма;
– клеточная линия – получается из первичных культур клеток после первого пассажа.

В первичной культуре клеток представлено большое количество клеточных линий. Основной из них является перевиваемая (стабильная) клеточная линия. Она обладает способностью к неограниченному количеству пассажей (не менее 70 раз с 3-дневным интервалом); диплоидная – линия клеток, 75 % которых имеют кариотип, свойственный нормальной клетке организма, из которого они выделены; гетероплоидная – линия клеток, которая содержит менее 75 % диплоидных клеток. Такие клетки не обладают признаками новообразований. В то же время они не имеют ограничений способности роста in vitro;

– субклеточная культура (субкультура). По сути это перевиваемая линия, получаемая из первичной культуры клеток путем переноса клеток из одной системы (емкости) в другую, т. е. это вторичная культура клеток.

По частоте использования клеточные культуры подразделяются на первичные (периодические) и перевиваемые, или постоянные. Первые используются в технологическом процессе, как правило, однократно. Вторые являются непрерывными, постоянными клеточными линиями, которые в технологическом процессе используются многократно.

Все постоянные клеточные линии, в отличие от культур нормальных первичных клеток с ограниченным сроком жизни, являются трансформированными. Другими словами, они изменены по ряду признаков, главным из которых является «бессмертие» (В.А. Сергеев, 1993). Другие категории трансформации, например, онкогенность, контактное торможение, приспособление к среде и т. д., у различных линий проявляются неодинаково. Все они получены при спонтанной или индуцированной трансформации клеток в организме или в культуре. Многие постоянные клеточные линии получены из опухолей животных.

Субкультивирование клеток, а затем и становление постоянной клеточной линии, были успешными, когда первичную однослойную культуру получали путем посева механически измельченной суспензии трипсинизированных клеток.

Способы выращивания клеточных культур
в промышленных условиях

Выращивают соответствующие клетки ткани в различных стеклянных емкостях в состоянии покоя, роллерным или динамичным методом и методом суспензионных клеточных культур.

Выращивание клеточных культур в состоянии покоя удобнее всего производить в стеклянных матрасах емкостью 1,5 л. В стерильные матрасы наливают 300 см³ ростовой питательной среды, а затем вносят необходимое количество матровой культуры клеток соответствующей концентрации. Матрасы помещают в термостаты предварительно пометив верхнюю стенку. На внутренней плоской поверхности другой стенки в процессе культивирования будет формироваться монослой клеток.

Культивирование клеточных культур роллерным методом осуществляется в 3-литровых бутылях, установленных на специальных стеллажно-ярусных аппаратах, обеспечивающих вращение бутылей. В начале в подготовленные соответствующим образом стерильный бутыли наливают ростовую питательную среду в количестве 1/10 объема сосуда. В среду вносят матровую культуру клеток концентрацией 600–800 тыс. на 1 мл. Затем бутыли устанавливают на стеллажно-ярусный аппарат и осуществляют культивирование клеток при 37 °С. Во вращающихся бутылях клеточный монослой располагается по всей цилиндрической поверхности горизонтально вращающихся сосудов. Большое значение имеет скорость вращения бутылей. Она не должна быть слишком высокой, чтобы не препятствовать приpeплению клеток. Но она должна быть и не слишком низкой, так как длительное нахождение клеток в газовой фазе ухудшает условия их питания. Обычно скорость вращения бутылей составляет 10–12 об/ч.

Роллерный метод еще называется динамичным. Этот метод позволяет получить большое количество клеток той или иной клеточной линии.

Способностью к росту и размножению в роллерных условиях обладают первичные культуры клеток, субкультуры, перевиваемые клеточные линии. Преимуществом роллерного способа культивирования клеток по сравнению с традиционными методами выращивания их в состоянии покоя (в матрасах или пробирках) является более экономичное использование питательных сред и более высокий выход антигена при последующем культивировании в таких культурах клеток вирусов.

Идентичным роллерному методу является выращивание монослойных клеточных культур в ферментерах «Гироген». Такой ферментер впервые описан в 1978 г. Герардом, представителем швейцарской фирмы «Хеман АГ», которая с 1974 г. занимается разработкой техники для суспензионного культивирования клеток млекопитающих. Ферментер «Гироген» состоит из большого количества стеклянных трубок, где клетки растут не только на внутренней, но и на внешней поверхностях стекла. Питательная среда вносится в ферментер отдельно или вместе с клеточной суспензией. Весь технологический процесс регулируется автоматически. При этом рН среды поддерживается в пределах 7,2–7,4 с помощью подачи газовой смеси из воздуха и углекислого газа на поверхность питательной среды. Использование установки «Гироген» обеспечивает повышение производительности труда, экономию рабочего времени, сокращение трудовых ресурсов. Фирма «Хеман АГ» выпускает несколько разновидностей ферментеров: лабораторные № 9, 16, 47; промышленные № 150, 300, 600.

Кроме указанных способов выращивания клеточных культур, растущих на поверхности стенок тех или других емкостей, в крупномасштабном производстве используют метод выращивания суспензионных клеточных культур. Этот метод впервые описал С. Оуенс (1953). Он показал способность клеток размножаться в жидкой среде и свободно суспендированном состоянии. Клетки перевиваемых линий могут длительно культивироваться во взвешенном состоянии. В таких условиях клетки размножаются, не прикрепляясь к стенкам культурального сосуда, благодаря постоянному перемешиванию среды.

Способ суспензионного выращивания клеток в биологической промышленности стал применяться сравнительно недавно.

Даже за короткий срок получены впечатляющие результаты. Большие успехи достигнуты при получении суспензионных постоянных культур клеток ВНК-21 для выращивания вируса ящура, вируса бешенства, клеток почки поросят JBRS-2 для размножения вируса ящура, вируса везикулярной болезни свиней и др. Выращивание клеточных культур осуществляют в специальных реакторах емкостью 1000 и более литров при 36–37 °С, рН 7,4 и непрерывном перемешивании суспензии клеток при 300–350 об/мин.

Несмотря на достижения по выращиванию суспензионных культур, на многих предприятиях биологической промышленности чаще используются методы получения клеточных линий в состоянии покоя или роллерным (динамичным) способом.

 5.6. КЛАССИФИКАЦИЯ ВАКЦИН
И ТЕХНОЛОГИЯ ИХ ПРИГОТОВЛЕНИЯ

Под общим названием «вакцины» объединяют все препараты, получаемые как из самих патогенных микроорганизмов или их компонентов, так и продуктов их жизнедеятельности, которые применяются для создания активного иммунитета у животных и людей.

В настоящее время появилась классификация, согласно которой все вакцины подразделяются на две группы: корпускулярные (у вирусов – цельновирионные) и компонентные (субъединичные). К первой группе относятся как живые, так и инактивированные вакцины.

Живые гомологичные вакцины в свою очередь могут различаться способом получения и быть представленными природно аттенуированными или икусственно ослабленными штаммами, включая рекомбинантные и реассортантные.

К компонентным (субъединичным) вакцинам относятся все остальные, которые не вошли в первую группу. Такие вакцины включают только те компоненты, которые вызывают образование антител.

К инактивированным, но не корпускулярным вакцинам относятся анатоксины. Они по сути приближаются к субъединичным вакцинам, но полной аналогии с ними делать не следует.

Живые, инактивированные вакцины, анатоксины могут быть noливалентными, комбинированными, гомологичными, гетерологичными.

Вакцины, содержащие антигены более чем одного вида микроорганизмов, называют комбинированными или ассоциированными.

Вакцины, содержащие антигены микроорганизма, против которого предполагается создать иммунитет, называются гомологическими.

Если болезнь, вызываемая одним видом микроорганизма, профилактируется вакциной, приготовленной из другого вида микроорганизма, то такая вакцина называется гетерологичной. Наиболее часто такие вакцины готовят и применяют для профилактики вирусных инфекций.

С учетом традиционной и современной классификации все вакцины делятся:

• по направленности применения – противобактериальные, противогрибковые, противовирусные;
• по способности микроорганизмов к размножению (репликации) – живые, инактивированные, в том числе анатоксины;
• по сырьевым компонентам – корпускулярные (у вирусов – цельновирионные); субъединичные; вакцины из экзопродуктов (анатоксины).

По совокупности признаков все вакцины классифицируются на:

• живые и инактивированные;
• поливалентные и ассоциированные;
• гомологичные и гетерологичные;
• корпускулярные и субъединичные;
• рекомбинантные и реассортантные;
• генно-инженерные и пептидные (синтетические).

Живые (аттенуированные) вакцины представляют собой иммунопрофилактические препараты, состоящие из наследственно измененных форм возбудителей инфекционных заболеваний, суспендированных или высушенных в соответствующих физиологических средах.

Вакцинные штаммы живых вакцин претерпели такие генетические изменения, в результате которых они безвозвратно потеряли способность вызывать в восприимчивом организме патологические изменения, ранее определяющие болезнь. Вместе с тем они сохранили гены, определяющие способность вызывать специфические иммунологические реакции, проявляющиеся выработкой антител.

Живые вакцины готовят из специально полученных вакцинных штаммов микроорганизмов с резко ослабленной вирулентностью и хорошо сохранившимися иммуногенными свойствами.

Убитые (инактивированные) вакцины. Данный тип вакцин представляет собой препарат, содержащий культуру высоковирулентных штаммов возбудителей инфекционных болезней, обезвреженную действием физико-химических факторов, утратившую способность к репродуцированию, но сохранившую иммуногенные свойства возбудителя.

Химические вакцины готовят из отдельных антигенов, которые обладают протективными свойствами.

Для получения антигенов применяют различные химические методы. Однако при введении подобных антигенов в организм они быстро рассасываются и не обеспечивают необходимого длительного иммуногенного раздражения. Поэтому к ним добавляют различные адъюванты. В качестве адъювантов применяют гидрат оксида алюминия, алюминиево-калиевые квасцы, минеральные и животные масла.

Иммунитет при ряде заболеваний (дифтерия, столбняк, ботулизм и др.) имеет преимущественно антитоксический характер. Поэтому, для профилактики этих заболеваний используют анатоксины (обезвреженные токсины микроорганизмов). Метод приготовления анагокисна заключается в том, что к токсину добавляется небольшое количество формалина (0,3–0,4 %) и выдерживают его при 37 °С 30–32 дня. В результате такой обработки они утрачивает токсичность, но сохраняют иммуногенные свойства. Анатоксины очищают от балластных белков питательной среды и адсорбируют на депонирующих веществах (адъювантах).

Генно-инженерные вакцины – препараты, приготовление которых связано с использованием методов генной инженерии. Существуют технологии рекомбинантной ДНК для клонирования вирусных или бактериальных белков (антигенов) в бактериальных, дрожжевых и животных клетках.

Синтетические вакцины – препараты известного состава, содержащие полученную искусственным путем антигенную детерминанту.

Примером антибактериальных синтетических вакцин могут служить синтезированные фрагменты стрептококкового белка М, дифтерийного токсина и холерного токсина. Очищенный белок М нельзя использовать в качестве вакцины, так как он имеет эпитопы, общие с клетками ткани сердца человека. Синтетические фрагменты белка М приводят к эффективной защите против нескольких типов стрептококков группы А, не вызывая выработки перекрестно-реактивных антител к тканям человека.

ДНК-вакцины. В качестве вакцин используют плазмидные векторы, кодирующие иммуногенные белки, при этом антигены патогенных микроорганизмов, индуцирующие иммунный ответ, синтезируются клетками самого макроорганизма. Это новый способ иммунизации, который интенсивно разрабатывается в последнее время.

По количеству содержащих в вакцине антигенов различают моновакцины, приготовленные из одного возбудителя или антитела, и поливакцины, содержащие антигены против нескольких вариантов инфекций.

 5.7. ТЕХНОЛОГИЯ ПРОМЫШЛЕННОГО
ПРИГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИН

Полученный из ВГНКИ аттенуированный штамм того или иного микроорганизма в условиях биопредприятий адаптируют к производственным питательным средам. Затем его выращивают, как правило, глубинным способом в реакторах и после получения бактериальной культуры ее центрифугируют в суперцентрифугах (сепараторах) для получения концентрата биомассы. Жидкая часть (культуральная жидкость) удаляется. Концентрат бактериальной массы суспендируют в среде высушивания (защитная среда) в соотношениях, необходимых для каждой вакцины концентрации микробных клеток. Чтобы смесь была равномерной концентрации, суспендирование проводят в работающем гомогенизаторе в течение определенного для каждого препарата времени. Полученную концентрированную бактериальную массу соединяют в определенных соотношениях с защитной средой, разливают во флаконы или ампулы и подвергают лиофильной сушке. После этого ампулы запаивают, а флаконы закрывают резиновыми пробками из нейтрального материала и герметизируют, обкатывая флаконы алюминиевыми колпачками. После этикетировки приготовленные серии вакцин сдают на контроль.

Большинство живых вакцин выпускаются в сухом виде. Кроме сухих, живые вакцины выпускаются и в жидком виде. По сути это культура выросших аттенуированных штаммов, отстандартизированных путем сепарирования и суспендирования до необходимой концентрации, ее фасуют во флаконы емкостью 50–100–200 мл и сдают на контроль.

Технология приготовления инактивированных вакцин

Инактивированные вакцины готовят из высоковирулентных штаммов соответствующего вида микробов. Поэтому полученную из него нативную культуру необходимо обезвредить (инактивировать). Способы инактивации бывают разными. Они должны быть щадящими, не нарушающими иммуногенности препарата. Есть так называемые гретые вакцины, когда полученную культуру убивают воздействием температуры в пределах 56–58 °С. Эти вакцины применяют редко. В ветеринарии таким образом готовят колипротектант – взвесь убитой нагреванием, отмытой от токсинов и консервированной формалином культуры одного штамма эшерихий. Для получения колипротектанта культуру эшерихий культивируют в реакторах в бульоне Хоттингера с добавлением углевода. По окончании культивирования бактериальную массу в реакторе инактивируют (убивают) длительным нагреванием, затем охлаждают и сепарируют. Осадок бактериальной массы суспензируют в физиологическом растворе, устанавливают нужную концентрацию микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности и консервируют формалином.

Чаще всего культуры микробов инактивируют (убивают) химическими веществами – эфиром, фенолом, формалином, спиртом, ацетоном, мертиолятом и др. Предпочтительным является формалин, гак как он способен не только убивать микробную клетку, но и инактивировать микробные токсины и превращать их в так называемый анатоксин.

Инактивацию культуры микроорганизмов осуществляют путем добавления к ней формалина с содержанием формальдегида 36 % и иыдержки ее при 37 °С в течение нескольких часов или суток. Большинство формализованных вакцин являются концентрированными. Выросшую бактериальную массу концентрируют с использованием сепараторов. Осажденную бактериальную массу выгружают в гомогенизатор, где ее стандартизируют путем разбавления формалинизированным физиологическим раствором до необходимой концентрации, и затем смешивают с адъювантом, который одновременно является и сорбентом микробных клеток. В качестве сорбентов наиболее часто используют гидроксид алюминия (ГОА), алюмокалиевые квасцы, маслоланолиновую смесь и др. Смысл использования указанных депонентов заключается в том, что высокоочищенный концентрированный препарат, введенный в организм без депонента, быстро выводится из него, не обеспечивая должного иммунологического ответа. – Антиген, введенный вместе с депонентом, задерживается на месте введения (в депо), что обеспечивает создание иммунитета большей напряженности и значительной длительности.

После соединения бактериальной массы с адъювантом вакцину фасуют во флаконы, закрывают их пробками из нейтральной резины: и для герметичности обкатывают алюминиевыми колпачками. На флаконы наносят этикетки с указанием биофабрики-изготовителя- названия препарата, способа его применения и дозировки. После этого препарат сдают на контроль.