Для выведения улучшенных пород домашних животных и птиц (коров с более высокой удойностью, овец с качественной шерстью, кур с более высокой яйценоскостью и т. д.) проводят множество раундов скрещиваний и отбора, каждый раз используя в качестве производителей животных с наилучшими характеристиками. В результате со временем можно получать более или менее чистые линии высокопродуктивных пород животных. Стратегия скрещивания и отбора, требующая больших временных и материальных затрат, оказалась тем не менее исключительно успешной, и сегодня почти все аспекты биологических основ выведения новых пород домашнего скота могут быть к ней сведены. Однако после того как эффективная генетическая линия получена, вводить новые признаки методом скрещивания и отбора становится все труднее. Так, линия с новым «ценным» геном может нести также и «вредные» гены, вследствие чего потомки могут оказаться менее продуктивными. Чтобы быть уверенными в том, что новая, улучшенная линия сохранит исходные полезные признаки и приобретет новые, необходимо разработать абсолютно новую стратегию.

Успешные эксперименты по введению чужеродных генов в клетки млекопитающих и возможность создания генетически идентичных животных путем переноса ядра из эмбриональной клетки в яйцеклетку с удаленным ядром (перенос ядра, клонирование) позволили включать в хромосомную ДНК высших животных отдельные функциональные гены или целые их кластеры. Используемая стратегия состоит в следующем.

• Клонированный ген вводят в ядро оплодотворенной яйцеклетки.
• Инокулированные оплодотворенные яйцеклетки имплантируют в реципиентную женскую особь (поскольку успешное завершение развития эмбриона млекопитающих в иных условиях невозможно).
• Отбирают потомков, развившихся из имплантированных яйцеклеток, которые содержат клонированный ген во всех клетках.
• Скрещивают животных, которые несут клонированный ген в клетках зародышевой линии, и получают новую генетическую линию.

Такой подход имеет много практических приложений. Например, если продукт вводимого гена стимулирует рост, то трансфицированные животные будут расти быстрее при меньшем количестве пищи. Повышение эффективности усвоения пищи всего на несколько процентов может существенно снизить стоимость конечного продукта (говядины, свинины и т. д.).

Идея генетического изменения животных путем введения генов в оплодотворенные яйцеклетки была реализована на практике в 1980-х тт. Как и во многих других новых областях науки, для упрощения обмена информацией между учеными был введен ряд новых терминов. Так, животное, чей генотип был изменен путем введения чужеродной (экзогенной) ДНК, было названо трансгенным, вводимая ДНК – трансгеном, а весь процесс – трансгенной технологией, или трансгенозом.

Эксперименты по генетической модификации многоклеточных организмов путем введения в них трансгенов требуют много времени Тем не менее трансгеноз стал мощным инструментом для исследования молекулярных основ экспрессии генов млекопитающих и их развития, для создания модельных систем, позволяющих изучать болезни человека, а также для генетической модификации клеток молочных желез животных с целью получения с молоком важных для медицины белков. Был даже предложен новый термин «фарминг», относящийся к процессу получения из молока трансгенных домашних ("pharm") животных аутентичных белков человека или фармацевтических препаратов. Использование молока целесообразно потому, что оно образуется в организме животного в большом количестве и его можно надаивать по мере надобности без вреда для животного. Вырабатываемый молочной железой и секретируемый в молоко новый белок не должен при этом оказывать никаких побочных эффектов на нормальные физиологические процессы, протекающие в организме трансгенного животного, и подвергаться посттрансляционным изменениям, которые по крайней мере близки к таковым в клетках человека. Кроме того, его выделение из молока, которое содержит и другие белки (табл. 19.1), не должно составлять большого труда.

Таблица 19.1. Белковый состав (г/л) молока коров и овец

 ТРАНСГЕННЫЕ МЫШИ: МЕТОДОЛОГИЯ

Трансгенные технологии разрабатывались и совершенствовались на лабораторных мышах. С начала 1980-х гг. в различные линии мышей были введены сотни генов. Эти исследования в значительной мере способствовали установлению механизмов генной регуляции и развития опухолей, природы иммунологической специфичности, молекулярной генетики роста и развития, других фундаментальных биологических процессов. Трансгенные мыши сыграли свою роль в исследовании возможности крупномасштабного синтеза лекарственных веществ, а также в создании трансгенных линий, позволяющих моделировать различные генетические болезни человека. Введение чужеродной ДНК мышам можно осушествить разными методами: 1) с помощью ретровирусных векторов, инфицирующих клетки эмбриона на ранних стадиях развития перед имплантацией эмбриона в самку-реципиента; 2) микроинъекцией в увеличенное ядро спермия (мужской пронуклеус) оплодотворенной яйцеклетки; 3) введением генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток в предимплантированный эмбрион на ранних стадиях развития.

Использование ретровирусных векторов

Преимущество метода, основанного на использовании ретровирусных векторов (рис. 19.1), перед другими методами трансгеноза состоит в его эффективности. Однако размер вставки в этом случае ограничивается 8 т. п. н., вследствие чего трансген может оказаться лишенным прилегающих регуляторных последовательностей, необходимых для его экспрессии.

Рис. 19.1. Получение линии трансгенных мышей с использованием ретровирусных векторов. Эмбрион, обычно находящийся на стадии 8 клеток, инфицируют рекомбинантным ретровирусом, несущим трансген. Самки, которым был имплантирован эмбрион («суррогатные» матери), производят на свет трансгенное потомство. Для идентификации мышат, несущих трансген в клетках зародышевой линии, проводят ряд скрещиваний.

Использование ретровирусных векторов имеет и еще один большой недостаток. Хотя эти векторы создаются так, чтобы они были дефектными по репликации, геном штамма ретровируса (вируса-помощника), который необходим для получения большого количества векторной ДНК, может попасть в то же ядро, что и трансген. Несмотря на все принимаемые меры, ретро-вирусы-помощники могут реплицироваться в организме трансгенного животного, что совершенно недопустимо, если этих животных предполагается использовать в пищу или как инструмент для получения коммерческого продукта. И поскольку существуют альтернативные методы трансгеноза, ретровирусные векторы редко используются для создания трансгенных животных, имеющих коммерческую ценность.

Метод микроинъекции ДНК

В настоящее время для создания трансгенных мышей чаще всего используют метод микроинъекций ДНК. Он заключается в следующем (рис. 19.2).

• Увеличение числа яйцеклеток, в которых будет инъецирована чужеродная ДНК, путем стимуляции гиперовуляции у самок-доноров. Сначала самкам вводят сыворотку беременной кобылы, а спустя примерно 48 ч – хорионический гонадотропин человека. В результате гиперовуляции образуется примерно 35 яйцеклеток вместо обычных 5–10.
• Скрещивание с самцами самок с гиперовуляцией и их умерщвление. Вымывание из яйцеводов оплодотворенных яйцеклеток.
• Микроинъекция ДНК в оплодотворенные яйцеклетки – как правило, сразу после выделения. Часто вводимая трансгенная конструкция находится в линейной форме и не содержит прокариотических векторных последовательностей.

Рис. 19.2. Получение линий трансгенных мышей методом микроинъекций. Яйцеклетки выделяют из самок-доноров, у которых была индуцирована гиперовуляция и проведено спаривание с самцами. Трансгенную конструкцию инъецируют в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Яйцеклетки имплантируют в «суррогатную» мать, которая производит на свет трансгенных мышат – основателей трансгенных линий.

У млекопитающих после проникновения сперматозоида в яйцеклетку ядро спермия (мужской пронуклеус) и ядро яйцеклетки существуют раздельно. После того как последнее заканчивает митотическое деление и становится женским пронуклеусом, может произойти слияние ядер (кариогамия). Мужской пронуклеус обычно гораздо больше женского, его легко локализовать с помощью секционного микроскопа и ввести в него чужеродную ДНК. При этом яйцеклетку на время проведения микроинъекции можно перемещать, ориентировать нужным образом и фиксировать. Опытный экспериментатор за день может инокулировать несколько сотен яйцеклеток.

После введения ДНК от 25 до 40 яйцеклеток имплантируют микрохирургическим путем в «суррогатную» мать, у которой вызывают ложную беременность скрещиванием с вазэктомированным самцом. У мышей спаривание – это единственный известный способ подготовки матки к имплантации. Поскольку вазэктомированный самец сперматозоидов не продуцирует, ни одна из яйцеклеток «суррогатной» матери не оплодотворяется. Эмбрионы развиваются только из введенных яйцеклеток, и мышата рождаются спустя примерно 3 нед после имплантации.

Для идентификации трансгенных животных выделяют ДНК из маленького кусочка хвоста и тестируют ее на наличие трансгена с помощью блот-гибридизации по Саузерну методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Чтобы определить, находится ли трансген в клетках зародышевой линии животного, трансгенную мышь скрещивают с другой мышью. Далее можно проводить скрещивание потомков для получения чистых (гомозиготных) трансгенных линий.

Описанный подход кажется на первый взгляд относительно простым, однако он требует четкой координации разных этапов. Даже высококвалифицированному специалисту удается получить жизнеспособных трансгенных животных в лучшем случае лишь из 5% инокулированных яйцеклеток (рис. 19.3). Ни один из этапов эксперимента не эффективен на все 100%, поэтому для микроинъекций необходимо использовать большое число оплодотворенных яйцеклеток. Например, при получении трансгенных мышей после инъекции ДНК выживают только 66% оплодотворенных яйцеклеток; мышата развиваются примерно из 25% имплантированных яйцеклеток, причем трансгенными из них оказываются лишь 25%. Таким образом, из 1000 имплантированных оплодотворенных яйцеклеток развивается от 30 до 50 трансгенных мышат. Кроме того, введенная ДНК может интегрировать в любое место в геноме, и зачастую множество ее копий включаются в один сайт. И наконец, не все трансгенные мышата будут обладать нужными свойствами. В организме некоторых особей трансген может не экспрессироваться из-за неподходящего окружения сайта интеграции, а в организме других число копий чужеродного гена может оказаться слишком большим, что может привести к гиперпродукции белка и нарушению нормальных физиологических процессов. И все же, несмотря на все это, метод микроинъекций используют для получения линий мышей, несущих функциональные трансгены, довольно часто.

Рис. 19.3. Суммарная эффективность трансгеноза после микроинъекций. Все оплодотворенные яйцеклетки (100%) коровы, свиньи, овцы и мыши инокулировали трансгеном, однако успешная имплантация и появление потомства были редкими событиями: трансгенное потомство давали менее 5% обработанных яйцеклеток.

Использование модифицированных
эмбриональных стволовых клеток

Клетки, выделенные из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, могут пролиферировать в культуре, сохраняя способность к дифференцировке в любые типы клеток, в том числе и в клетки зародышевой линии, при введении в другой эмбрион на стадии бластоцисты. Такие клетки называются плюрипотентными эмбриональными стволовыми клетками (ES). ES-клетки в культуре легко модифицировать методами генной инженерии без нарушения их плюрипотентности. Например, в определенный сайт несущественного гена в их геноме можно встроить функциональный трансген. Затем можно отобрать измененные клетки, культивировать их и использовать для получения трансгенных животных (рис. 19.4). Это позволяет избежать случайного встраивания, характерного для метода микроинъекций и ретровирусных векторных систем.

Рис. 19.4. Получение трансгенных мышей с помощью генетической модификации эмбриональных стволовых (ES) клеток. ES-клетки получают из внутренней клеточной массы бластоцисгы мыши. Их трансфицируют вектором, несущим трансген, культивируют и идентифицируют трансфицированные клетки методом позитивно-негативной селекции или ПЦР. Популяцию трансфицированных клеток вновь культивируют и вводят в бластоцисты. которые затем имплантируют в матку «суррогатных» матерей. Скрещивая животных-основателей, несущих трансген в клетках зародышевой линии, можно получить линии трансгенных мышей.

При трансфекции ES-клеток в культуре вектором, предназначенным для интеграции в специфический хромосомный сайт, в некоторых клетках ДНК встраивается случайным образом, в других встраивание происходит в нужный сайт, в большинстве же ES-клеток интеграции вообще не происходит. Для увеличения числа клеток первого типа используют так называемую позитивно-негативную селекцию. Эта стратегия состоит в позитивной селекции клеток, несущих векторную ДНК, встроившуюся в нужный сайт, и негативной селекции клеток с векторной ДНК, интегрировавшей в случайный сайт.

Сайт-мишень должен находиться в такой области геномной ДНК, которая не кодирует важных белков, чтобы интеграция чужеродной ДНК не повлияла на процессы развития или клеточные функции. Кроме того, существенно, чтобы встраивание трансгена не блокировало трансляцию соответствующего участка генома. Поиск подобных сайтов ведется непрерывно.

Вектор для позитивно-негативной селекции обычно содержит следующие элементы:

1) два блока последовательностей (НВ1 и НВ2), гомологичных отдельным участкам сайта-мишени;

2) трансген (TG), кодирующий новую функцию реципиента;

3) последовательность, кодирующую устойчивость к соединению G-418 (Neo^r);

4) два разных гена тимидинкиназы (tk1 и tk2) вируса простого герпеса типов 1 и 2 (HSV-tk1 и HSV-tk2) (рис. 19.5, А). Ключевым для позитивно-негативной селекции является взаимное расположение этих элементов. Трансген и ген устойчивости к G-418 (Neo^r) должны находиться между двумя участками ДНК, гомологичными сайту-мишени, а гены HSV-tk1 и HSV-tk2 – по бокам этой конструкции. Если встраивание происходит в случайный сайт (не в НВ1 и НВ2), то с высокой вероятностью вместе с другими последовательностями интегрируют один или оба гена HSV-tk (рис. 19.5, А). Напротив, если интеграция происходит в результате гомологичной рекомбинации путем двойного кроссинговера в нужный сайт, то в геном встроятся только трансген и ген Neo^r, а гены HSV-tk – нет (рис. 19.5, Б). При выращивании трансфицированных клеток в присутствии G-418 клетки, не несущие ген Neo^r, расти не будут. Выживут только клетки, в которых произошла интеграция – иными словами, осуществляется позитивная селекция. Если одновременно с G-418 в среду добавить ганцикловир, то рост клеток, синтезирующих тимидинкиназу, будет подавлен, поскольку этот фермент катализирует превращение ганцикловира в токсичное соединение, летальное для клетки, т. е. произойдет негативная селекция. Клетки, прошедшие через такое двойное сито, скорее всего будут содержать последовательность, встроившуюся в нужный сайт. Хоть этот метод не застрахован от ошибок, он позволяет обогатить клеточную популяцию клетками, несущими трансген в специфичном хромосомном сайте.

Рис. 19.5. Позитивно-негативная селекция. А. Неспецифическая интеграция. В хромосому встроились оба гена тимидинкиназы (tk1 и tk2), два участка ДНК, гомологичные специфичным последовательностям хромосомной ДНК реципиентных клеток (НВ1 и НВ2), ген (Neo^r), обеспечивающий устойчивость к цитотоксическому соединению G-418, и трансген (TG). После трансфекции проводят тестирование клеток на устойчивость к G-418 и ганцикловиру, который становится цититоксичным для клеток, синтезирующих тимидинкиназу. Интеграция может произойти и по-другому, со встраиванием в хромосому только гена тимидинкиназы. В присутствии G-418 и ганцикловира все такие клетки тоже погибают. Б. Специфическая интеграция с помощью гомологичной рекомбинации. В результате двойного кроссинговера между гомологичными участками (НВ1 и НВ2) векторной и хромосомной ДНК в последнюю встраивается фрагмент, не содержащий генов тимидинкиназы (tk1 и tk2). В присутствии G-418 и ганцикловира выживают только клетки, в которых прошла гомологичная рекомбинация.

Более простой способ идентификации ES-клеток, несущих трансген в нужном сайте, основан на использовании ПЦР. В этом случае ДНК-вектор содержит два участка, гомологичных сайту-мишени, по одному со стороны трансгена и со стороны клонированной бактериальной или синтетической (уникальной) последовательности, отсутствующей в геноме мыши (рис. 19.6). После трансфекции ES-клеток этим вектором проводят скрининг трансфицированных клеток методом ПЦР. Один из ПЦР-праймеров (Р1) комплементарен участку клонированной бактериальной или синтетической (уникальной) нуклеотидной последовательности интегрировавшего вектора, а второй (Р2) – участку хромосомной ДНК, прилегающему к одному из гомологичных участков ДНК. При встраивании последовательности-мишени в случайный сайт ожидаемый продукт амплификации образовываться не будет (рис. 19.6, А), а при сайт-специфической интеграции в результате ПЦР-амплификации образуется фрагмент ДНК известного размера (рис. 19.6, Б). Таким образом можно идентифицировать пулы ES-клеток, содержащих трансген в нужном сайте, а пересевая клетки из этих пулов – получить клеточные линии с сайт-специфической вставкой.

Рис. 19.6. Идентификация клеток, несущих трансген в специфическом сайте, при помощи ПЦР. А. В результате неспецифического встраивания векторной ДНК один из праймеров (Р2) не сможет гибридизоваться с участком хромосомы, находящимся на определенном расстоянии от места отжига праймера Р1, и фрагмента нужного размера при амплификации не образуется. Р1 гибридизуется с уникальным участком (US) встроенной ДНК, отсутствующим в хромосомной ДНК клетки-реципиента. Б. В результате гомологичной рекомбинации между участками НВ1 и НВ2 встраиваемой ДНК, с одной стороны, и комплементарными участками хромосомы CS1 и CS2, с другой, образуются участки, с которыми могут гибридизоваться оба праймера, Р1 и Р2, и которые находятся на определенном расстоянии друг от друга. В ходе ПЦР-амплификации синтезируются фрагменты одного размера, которые можно идентифицировать при помощи гель-электрофореза. Если ПЦР-продукт нужной длины образовался, значит трансген (TG), находящийся между гомологичными участками (НВ1 и НВ2), встроился в определенный сайт хромосомы.

ES-клетки, в геном которых в нужном сайте встроен трансген, можно культивировать и ввести в эмбрион на стадии бластоцисты, а затем имплантировать такие эмбрионы в матку псевдобеременных «суррогатных» матерей. Мышата, у которых генетически модифицированные ES-клетки участвовали в образовании клеток зародышевой линии, могут дать начало грансгенным линиям. Для этого их нужно скрестить с особями той же линии, а затем скрестить их трансгенных потомков. В результате будут получены трансгенные мыши, гомозиготные по трансгену.

В специфический хромосомный сайт ES-клеток можно не только встроить трансген, кодирующий какую-то новую функцию, но и направленно разрушить этот сайт интеграцией с его кодирующей областью специфической последовательности (обычно селективного маркерного гена) (рис. 19.7). Одна из задач направленного нарушения («нокаута») гена состоит в исследовании влияния этого процесса на развитие организма и протекающие в нем физиологические процессы. Кроме того, есть надежда, что трансгенных животных с нарушением в определенном гене можно использовать как модель для изучения болезней человека на молекулярном уровне.

Рис. 19.7. «Нокаут» гена с помощью направленной гомологичной рекомбинации. Вектор несет селективный маркерный ген (smg) и фланкирующие его последовательности, гомологичные соответствующим участкам гена-мишени. Последний содержит пять экзонов (1–5). В результате гомологичной рекомбинации (штриховые линии) ген-мишень прерывается («нокаутируется»).

Например, направленный «нокаут» гена родопсина мыши приводит к инактивации палочек сетчатки, что имитирует такую болезнь человека, как пигментный ретинит. На мышах с «нокаутированным» геном родопсина можно изучать процесс дегенерации сетчатки, а также терапевтический эффект лекарственных средств, замедляющих или вообще останавливающих генетически обусловленный патологический процесс. Уже создано более 250 линий мышей с «нокаутированными» генами, использующихся в качестве моделей для изучения различных заболеваний человека.

В принципе подходы к созданию трансгенных животных с «улучшенными функциями» и с «потерей функций» сходны. К сожалению, плюрипотентные ES-клетки, аналогичные таковым у мышей, пока не обнаружены у крупного рогатого скота, овец, свиней и цыплят, но их поиск продолжается.

Клонирование с помощью переноса ядра

Плюрипотентность можно выявить, если перенести ядро тестируемой клетки в яйцеклетку с удаленным ядром и затем исследовать способность последней к развитию и образованию жизнеспособного потомства. В нескольких лабораториях с переменным успехом исследовали плюрипотентность линий эмбриональных клеток, клеток плода и взрослой особи. Было показано, что ядра эмбриональных клеток способны – хотя и с низкой эффективностью – обеспечивать развитие. Например, с помощью переноса ядер эмбриональных клеток крупного рогатого скота, культивированных непродолжительное время, были получены жизнеспособные особи. Всем известная овца по имени Долли была клонирована с помощью переноса ядра клетки молочной железы (вымени) взрослого животного (рис. 19.8). Так впервые была доказана плюрипотентность ядра дифференцированной взрослой клетки. Впрочем, нельзя исключить, что на самом деле донорское ядро было взято из недифференцированной клетки, присутствовавшей в эпителии молочной железы организма-донора.

Рис. 19.8. Клонирование овцы методом переноса ядра. Ядро яйцеклетки удаляют с помощью микропипетки. Культивируют эпителиальные клетки молочной железы взрослой особи и индуцируют их переход в фазу G_o. Осуществляют слияние клеток в G_o-фазе и яйцеклеток, лишенных ядра, и выращивают восстановленные яйцеклетки в культуре или в яйцеводе с наложенной лигатурой до ранних стадий эмбриогенеза, а затем имплантируют их в матку «суррогатной» матери, где и происходит дальнейшее развитие. В эксперименте, описанном Уилмутом и др. (Wilmut et al., 1997), было проведено слияние 277 яйцеклеток с удаленными ядрами с клетками молочной железы в фазе G_o; из 29 эмбрионов только один развился до жизнеспособного плода.

Клонирование Долли из ядра дифференцированной клетки и трех других овец из ядер эмбриональных клеток удалось осуществить благодаря переносу ядер из клеток, находящихся в стадии покоя (G_o), и, возможно, особенностям эмбриогенеза этого животного. Дело в том, что в течение первых трех делений зиготы овцы, занимающих несколько суток, происходит только репликация ДНК, ни один из генов не экспрессируется. Предполагается, что за это время введенная ДНК освобождается от специфичных для клетки регуляторных белков, а соответствующие гены эмбрионального развития связываются с инициаторными эмбриональными белковыми факторами из цитоплазмы яйцеклетки.

Основная проблема, которую нужно решить для того, чтобы создание трансгенных животных с помощью метода переноса ядер стало реальным, – это сохранение плюрипотентности клеток в непрерывной культуре. Если это удастся, то генетическое изменение таких клеток и создание трансгенных организмов станет почти рутинной процедурой. Однако вследствие видовых различий во времени процесса деления клетки на ранних стадиях эмбриогенеза и инициации транскрипции в этот период пока не ясно, удастся ли осуществить перенос ядра в случае каких-либо других домашних животных, кроме овец, если донорское ядро будет находится на той же стадии, что и яйцеклетка.

ВАЖНАЯ ВЕХА
Генетическая трансформация эмбрионов мыши микроинъекцией очищенной ДНК
J. W. Gordon, G. A. Scangos, D. J. Plotkin, J. A. Barbosa. F. H. Ruddle Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380-7384, 1980
Экспрессия гена тимидинкиназы вируса простого герпеса в соматических клетках мыши после инъекции рекомбинантного гена в яйцеклетки
R. L. Brinster, Н. Y. Chen, М. Trumbauer, A. W. Senear, R. Warren, R. D. Palmiter
Cell 27: 223-231, 1981

Впервые возможность переноса ДНК при помощи микроинъекций в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки мыши была проиллюстрирована Дж. Гордоном и др. В этом эксперименте в несколько сотен оплодотворенных яйцеклеток инъецировали плазмидный вектор pBR322, содержащий ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV) и часть генома обезьяньего вируса 40 (SV40). Из 78 потомков, рожденных приемными матерями, два содержали плазмидную ДНК. Авторы сделали вывод, что «эти данные свидетельствуют о возможности использования рекомбинантных плазмид в качестве вектора для введения чужеродных генов непосредственно в эмбрионы мышей, которые сохраняют эти гены в ходе развития». К сожалению, плазмидная ДНК не была интактна, и ген тимидинкиназы HSV не стал трансгеном.

Бринстер и др. инъецировали ген тимидинкиназы HSV под контролем промотора гена метал лотионеина-I и обнаружили, что у одной из полученных трансгенных мышей синтезировалось больше тимидинкиназы HSV в клетках печени и почек, чем у трех других, синтезировавших этот фермент лишь в небольшом количестве. Кром: того, восемь других трансгенных животных несли ген тимидинкиназы HSV, но не синтезировали активного фермента. По данным Саузерн-блоттинга, у всех трансгенных мышей введенная ДНК присутствовала в большом числе копий.

Эти два исследования послужили основой экспериментов по трансгенозу мышей. Несмотря на техническую сложность и относительную неэффективность метода с использованием микроинъекций, эти эксперименты оказались вполне успешными. В настоящее время различные линии мышей, которые несут чужеродные гены (трансгенные мыши) или собственные гены, выведенные из строя интеграцией фрагмента чужеродной ДНК («нокаутированные» гены), используются в самых разных целях: для изучения процессов регуляции генов и развития млекопитающих, возникновения вирусных заболеваний и рака, мутагенных эффектов различных агентов и многого другого. Кроме того, трансгенные мыши и мыши с «нокаутированным» геном представляют интерес как модельные системы для исследования болезней человека.

Перенос генов с помощью искусственных дрожжевых хромосом

Большинство трансгенов представляют собой кДНК, небольшие гены (≤20 т. п. н.) или фрагменты генов. Зачастую кДНК плохо экспрессируются в клетках млекопитающих, а когда трансгеном служит геномная ДНК, важные геноспецифичные регуляторные последовательности, расположенные до и после гена-мишени, обычно не входят в состав вставки. Кроме того, полноразмерные гены и мультигенные комплексы (≥100 т. п. н.) слишком велики для встраивания в обычные векторы. Учитывая все это, для трансгеноза стали использовать искусственные дрожжевые хромосомы (YAC), вмещающие фрагменты геномной ДНК длиной от 100 до >1000 т.п.н.

Трансгенных мышей получали микроинъекцией в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки или трансфекцией ES-клеток с помощью YAC, несущих несколько родственных генов или один большой ген. Трансгенные мыши, несущие кластер из пяти функциональных генов β-глобина человека суммарной длиной примерно 250 т.п.н., экспрессировали все эти гены тканеспецифично и в нужное время – точно также, как это происходит у человека. Такое соответствне обеспечивалось фланкирующими их последовательностями, которые содержат промотор и другие важные регуляторные элементы.

Создание мышей, которые синтезировали бы только человеческие антитела, – это примечательный пример трансгеноза с помощью YAC. Как отмечалось в гл. 10, моноклональные антитела можно использовать для лечения некоторых заболеваний человека. Однако получить человеческие моноклональные антитела практически невозможно. К сожалению, и моноклональные антитела грызунов иммуногенны для человека. Чтобы «очеловечить» существующие моноклональные антитела грызунов, были разработаны сложные стратегии с использованием рекомбинантных ДНК. В результате этих трудоемких процедур удалось получить Fv- и Fab-фрагменты, зачастую обладающие каким-то сродством к специфическому антигену. Возможно, технологического прорыва удастся достичь, если использовать для получения полноразмерных человеческих антител более доступный метод с использованием гибридом.

Синтез природных антител – это настоящее чудо. Антитело – очень сложная тетрамерная конструкция, состоящая из двух пар разных цепей. Одна из них называется тяжелой (Н), а другая – легкой (λ или к). Эти термины отражают различия в молекулярных массах субъединиц антитела. Генетические особенности каждой тяжелой цепи определяются комбинацией вариабельного (V_H), дивергентного (D_H), шарнирного (J_H) и константного (С_H) участков (доменов) соматической ДНК в В-клетке. Известны два типа легких цепей, λ и к, которые образуются в результате перестройки их собственных вариабельных (Vλ, Vk), шарнирных (Jλ., Jк) и константных (Сλ, Ск) доменов. Данная В-клетка синтезирует один вид антител, с уникальной комбинацией участков, ci ютавляющих Н-цепь, и либо перестроенной λ-, лиоо к-цепью.

Набор генетических элементов, обеспечивающих образование множества разных Н-цепей антител человека, включает около 95 Vн-доменов, 30 D_H-доменов, 6 J_H-доменов и 5 основных константных (Сα, Сγ, Сδ, Сε, Сμ) доменов. Лoкус к-генов содержит примерно 76 Vк-доменов, 5 Jк-доменов и один константный (Ск) участок (рис. 19.9). Размер Н-локусов и к-генов – от 1 до 1,5 т.п.н. Для создания трансгенных мышей, способных синтезировать множество различных человеческих антител, необходимо инактивировать мышиные гены Н- и L-цепей, а затем встроить в хромосомную ДНК мыши YAC, содержащую гены Н- и L-цепей каждого человеческого гена иммуноглобулина.

Рис. 19.9. Схематичное изображение генов к- и Н-цепей иммуноглобулинов человека. А. Строение гена к-цепи иммуноглобулина в клетках зародышевой линии. Штриховая линия – промежуточные домены, здесь не показанные. Ген функциональной к-цепи, например Vк8-Jк4-Cк, образуется в В-клетках в результате нескольких перестроек соответствующих ДНК-доменов. Представленная здесь комбинация – лишь одна из 500 возможных. Б. Строение гена Н-цепи иммуноглобулина в клетках зародышевой линии. Штриховая линия – промежуточные домены, здесь не показанные. Ген функциональной Н-цепи, например V_H33-D_H26-J_H4-Cα, образуется в В-клетках в результате ряда перестроек соответствующих доменов. Представленная здесь комбинация – лишь одна из 140 000 возможных. На рисунке показан только один Сγ-домен, хотя на самом деле их четыре (Cγ1, Сγ2а, Сγ2Ь и СγЗ).

Чтобы решить эту задачу, мышиные гены Н- и к-цепей были заменены («нокаутированы») небольшим участком кластера генов Н-цепи человека (который включал 4 V_H-домена, 16 D_H-доменов, 6 J_H-доменов, Сγ и Сμ) и кластера генов к-цепи человека (содержащего 4 Vк-домена, 5 Jк-доменов и Ск). Трансгенные мыши с таким набором генов антител человека синтезировали человеческие антитела к некоторым антигенам; кроме того, были созданы гибридомы, продуцирующие человеческие моноклональные антитела. Однако разнообразие человеческих антител, продуцируемых такими трансгенными мышами, было невелико вследствие ограниченности набора вариабельных сегментов Н- и к-цепей. Чтобы решить эту проблему, создали YAC с большим числом генов вариабельных участков Н- и к-цепей гемоглобина человека.

Объединив четыре разные YAC с генами Н-цепей гемоглобина человека, создали YAC длиной 1000 т.п.н., несущую 66 V_H-доменов, около 30 D_H-сегментов, 6 J_H-доменов, Сμ, Сδ, и Сγ. Аналогично, из трех YAC, несущих различные домены Vк, создали YAC длиной 800 т. п. н. с 32 Vк-доменами, 5 Jк-доменами и Ск. ES-клетки трансфицировали по отдельности YAC с генами Н- и к-цепей методом слияния клеток, отобрали клетки, в которых произошла интеграция YAC, с помощью селективного маркера и проверили целостность каждой вставки методом ПЦР. Инъецировали клетки, несущие встроенные гены Н- либо к-цепи, в бластоцисты и идентифицировали особь-основателя с помощью ПЦР. Трансгенных мышей со вставками генов Н- и к-цепей скрещивали по отдельности с мышами с инактивированными локусами этих цепей. Затем потомство скрещивали между собой, чтобы получить мышей, лишенных функциональных мышиных генов Н- и к-цепей, но несущих обе вставки генов Н- и к-цепей гемоглобина человека.

Трансгенные мыши с увеличенным числом человеческих V_H- и Vк-доменов синтезировали человеческие антитела. Их иммунизировали тремя разными антигенами, и в каждом случае гибридомы секретировали человеческие моноклональные антитела, обладающие высоким сродством к антигену, которым животные были иммунизированы. Весьма вероятно, что с помощью такой трансгенной системы удастся получать человеческие моноклональные антитела для использования их в медицине.

ТРАНСГЕННЫЕ МЫШИ: ПРИМЕНЕНИЕ

Трансгенные мыши могут служить модельными системами для изучения болезней человека и тест-системами для исследования возможности синтеза продуктов, представляющих интерес для медицины. Используя целых животных, можно моделировать и возникновение патологии, и ее развитие. Однако мышь – не человек, хотя она тоже относится к классу млекопитающих, поэтому данные, полученные на трансгенных моделях, не всегда можно экстраполировать на человека в том, что касается медицинских аспектов. Тем не менее в некоторых случаях они позволяют выявить ключевые моменты этиологии сложной болезни. Принимая во внимание все это, ученые разработали «мышиные» модели таких генетических болезней человека, как болезнь Альцгеймера, артрит, мышечная дистрофия, образование опухолей, гипертония, нейродегенеративные нарушения, дисфункция эндокринной системы, сердечно-сосудистые заболевания и многие другие.

Болезнь Альцгеймера – это дегенеративный процесс, приводящий к утрате клеток различных отделов головного мозга. Наиболее ранним проявлением служит ухудшение памяти. Этот процесс прогрессирует, к нему присоединяются утрата способности к абстрактному мышлению, изменение личности, нарушения речи, снижение физического статуса. Патология наблюдается у 1% людей возрастной группы от 60 до 65 лет и у 30% людей старше 80 лет. При патоморфологическом исследовании в теле нейронов обнаруживаются нейрофибриллярные клубочки, а у синаптических окончаний – плотные агрегаты. называемые сенильными бляшками (рис. 19.10). Кроме того, в кровеносных сосудах мозга обнаруживаются конгломераты – амилоидные бляшки.

Рис. 19.10. Схематическое изображение нейрона коры головного мозга человека с указанием некоторых гистологических особенностей, характерных для болезни Алыдгеймера. У синапсов образуются сенильные бляшки, содержащие амилоидные скопления и обломки клеток, В теле нейрона накапливаются нейрофибриллы, включающие агрегаты из белков цитоскелета и других белков. Происходят и другие изменения, здесь не показанные.

Основным компонентом сенильных и амилоидных бляшек является белок Аβ (амилоид β, β-белок, β-амилоидный белок, β/А4) мол. массой 4 кДа. Существуют βр-белки с разным числом аминокислотных остатков, например Аβ40 и Аβ42. Все они образуются в результате протеолитического расщепления белка-предшественника (АРР). Причины аккумуляции Аβ-белка не установлены. Члены некоторых семей, в которых с высокой частотой встречается болезнь Альцгеймера, несут мутации в гене АРР, что наводит на мысль об участии этого гена в возникновении данной патологии. К сожалению, проследить в деталях за возникновением и развитием болезни Альцгеймера на человеке не удается. Неоценимую помощь в этом могла бы оказать какая-нибудь «животная» модель.

Было получено множество трансгенных мышей, несущих полноразмерный ген АРР или его часть под контролем нейроспецифичного промотора. При этом у большинства животных образование амилоидных бляшек, нейрофибриллярных клубочков, гибель нейронов или нарушение поведения не отмечались. Однако у животных, несущих трансген, кодирующий участок из 100 последних аминокислот АРР, который включал и Аβ-белок, обнаруживалась дегенерация нервных тканей, аналогичная таковой при болезни Альцгеймера.

Более адекватные «животные» модели, позволяющие изучать болезнь Альцгеймера, были созданы с использованием трансгенов, содержащих мутации в гене АРР, характерные для некоторых семей с высокой частотой встречаемости болезни Альцгеймера в раннем возрасте (≤50 лет). У одной группы таких семей в положении 717 АРР (АРР-717) вместо валина присутствовал фенилаланин, в другой группе в положениях 670 и 671 АРР (АРР-670/671) лизин и метионин были заменены на аспарагин и лейцин соответственно.

Трансген с мутацией АРР-717 был создан на основе кДНК АРР встраиванием между экзонами 6и7, 7и 8, 8 и 9 модифицированных интронов. Интроны вводились потому, что, согласно данным эксперимента, содержащие их трансгены транскрибируются более эффективно, чем трансгены без интронов. Конструкция «кДНК АРР–интроны» находилась под контролем промотора гена β-фактора роста из тромбоцитов, jkciфсссирующсгося в тканях мозга (рис. 19.11). Вся она была названа мини-геном PDAPP. У стареющих трансгенных мышей (старше 6 месяцев), несущих около 40 копий PDAPP, образовывались амилоидные бляшки, отмечались гибель нейронов и дефекты памяти. Конструкция АРР-670/671 под контролем нейроспецифичного промотора вызывала у трансгенных мышей симптомы, подобные симптомам болезни Альцгеймера, в том числе образование избыточных количеств Аβ42. Интересно, что ни у стареющих мышей, несущих PDAPP-мини-ген, ни у трансгенных мышей АРР-670/671 нейрофибриллярные клубочки не обнаруживались. Возможно, эти структуры возникают у человека как следствие сверхпродукции Аβ42.

Рис. 19.11. Генетическая конструкция, называемая мини-геном PDAPP, с помощью которой можно моделировать развитие болезни Альцгеймера у трансгенных мышей. 1–10 – экзоны кДНК белка-предшественника амилоида, А–С – введенные интроны. Регуляторными элементами являются промотор гена β-фактора роста из тромбоцитов и сигнал полиаденилирования вируса SV40.

В развитии болезни Альцгеймера у человека участвуют еще три гена – АроЕ4, гены пресенилина 1 (PS1) и пресенилина 2 (PS2). Наличие аллеля АроЕ4 локуса АроЕ, который ответствен затранспорт липидов, коррелирует с увеличением вероятности возникновения болезни Альцгеймера у людей старше 60 лет. В семьях, где отмечается развитие этой болезни в молодом возрасте, обнаруживаются мутации в генах пресенилинов, однако роль каждого из них в развитии данной патологии не выяснена. По данным разных авторов, мутации в генах пресенилинов приводят к увеличению аккумуляции Аβ42. Например, у дважды трансгенных мышей, полученных скрещиванием трансгенных мышей, которые несли полноразмерный человеческий ген АРР, с мышами, несущими мутантный ген пресенилина 1, отмечалась сверхпродукция Ар42. Пока о патогенезе болезни Альцгеймера мало что известно, но есть надежда, что животные модели'помогут ответить на некоторые важные вопросы о ее молекулярных основах. В США эта болезнь поражает ежегодно около 4 млн. человек, и наносимый ею ушерб составляет порядка 100 млрд. долларов.

Трансгенных мышей использовали также в качестве модельных систем для изучения экспрессии генов, кодирующих трансгенные продукты, которые секретируются в молоко. Так, для изучения функций белка, нарушения в котором приводят к муковисцидозу (CFTR), и для разработки подходов к лечению муковисцидоза (CF) необходимы большие количества аутентичного CFTR-белка.

Муковисцидоз – распространенная генетическая болезнь, поражающая в странах Европы одного из 2500 новорожденных. Первичный эффект дефектного CF-гена – это изменение функции CFTR, который в норме служит каналом для ионов хлора. В результате блокирования потока этих ионов в клетку и из клетки в протоках некоторых органов, особенно в легких и поджелудочной железе, скапливается слизь. Она становится источником бактериальной инфекции, которая с трудом поддается лечению антибиотиками. ДНК, высвобождающаяся из лизировавших бактерий, делает слизь очень густой. Загустевшая слизь забивает протоки, нарушается нормальная работа органа и симптомы муковисцидоза еще более усиливаются. Продолжительность жизни больных муковисцидозом составляет в настоящее время 25–30 лет.

Для того чтобы лучше изучить механизм действия CFTR, необходимо иметь этот белок в достаточном количестве. Все известные клеточные системы экспрессии in vitro не обеспечивали его эффективного синтеза. Возможно, это связано с аккумуляцией CFTR в мембранах трансфицированных клеток. Решить эту проблему можно было бы постоянным удалением плазматических мембран из хозяйских клеток. В такой системе гетерологичный трансмембранный белок связывался бы с отдельными фрагментами плазматической мембраны, что значительно облегчало бы его концентрирование и очистку. Аналогичный механизм используется клетками молочной железы для образования глобул жира в период вскармливания. Жировые капельки инкапсулируются в плазматической мембране и в таком виде секретируются в молоко.

Чтобы проверить действенность этой системы, полноразмерную кДНК CFTR встроили в середину дефектного гена β-казеина козы, из которого был удален участок от конца экзона 2 до начала экзона 7 (рис. 19.12). Получившаяся конструкция содержала промотор и сигнал терминации транскрипции гена Р-казеина козы. При этом кДНК CFTR была встроена в структурный ген с интронами, благодаря которым повышалась эффективность транскрипции трансгена. Ген р-казеина активно экспрессируется в клетках молочных желез в период вскармливания, и этот белок является основным белком молока.

Рис. 19.12. Генетическая конструкция «кДНК CFTG – ген β-казеина козы». Полноразмерная кДНК CFTR встроена между экзонами 2 (ЕХ2) и 7 (ЕХ7) гена β-казеина козы. Сохранены промотор, терминатор и экзоны 1, 8 и 9 (ЕХ1, ЕХ8 и ЕХ9) гена казеина.

Были получены линии трансгенных мышей, несущих кДНК CFTR под контролем регуляторных последовательностей гена β-казеина. Как и ожидалось, в молоке трансгенных самок содержался CFTR-белок, связанный с мембранами глобул жира. Никаких отрицательных побочных эффектов у кормящих CFTR-трансгенных самок или у мышат, вскормленных их молоком, не наблюдалось. CFTR был гликолизирован и легко экстрагировался из жировой фракции молока. Остается только выяснить, является ли он аутентичным белком. Исследовалась также возможность получения других мембраносвязанных белков с молоком. В клетках молочных желез транс генных мышей в период лактации синтезируется множество белков, представляющих интерес для медицины. Но чтобы иметь возможность получать CFTR, другие трансмембранные белки и различные белки человека в больших количествах, соответствующие трансгенные конструкции необходимо встраивать в геном более крупных млекопитающих – коровы, овцы или козы.

 ТРАНСГЕННЫЙ КРУПНЫЙ РОГАТЫЙ СКОТ

Если предполагается использовать молочную железу в качестве «биореактора», то наиболее предпочтительным животным для трансгеноза является крупный рогатый скот, который ежегодно дает до 10 ООО л молока, содержащего примерно 35 г белка на 1 л. Если в молоке будет содержаться такое количество рекомбинантного белка и эффективность его очистки составит 50%, то от 20 трансгенных коров можно будет получать примерно 100 кг такого белка в год. По случайному совпадению, именно столько белка С, использующегося для предотвращения тромбообразования, требуется ежегодно. С другой стороны, одной трансгенной коровы будет более чем достаточно для получения требуемого ежегодно количества фактора IX (фактора Кристмаса) каскадного механизма свертывания крови, который вводят больным гемофилией для повышения свертываемости крови.

Для создания трансгенных коров использовали модифицированную схему трансгеноза мышей методом микроинъекций ДНК (рис. 19.13). Процедура включала следующие основные этапы.

1. Сбор ооцитов коров, забитых на скотобойне.

2. Созревание ооцитов in vitro.

3. Оплодотворение бычьей спермой in vitro.

4. Центрифугирование оплодотворенных яйцеклеток для концентрирования желтка, который в нормальных яйцеклетках мешает визуализации мужского нронуклеуса с помощью секционного микроскопа.

5. Микроинъекция ДНК в мужской пронуклеус.

6. Развитие эмбрионов in vitro.

7. Нехирургическая имплантация одного эмбриона реципиентной самке во время течки.

8. Скрининг ДНК потомков на наличие трансгена.

Рис. 19.13. Получение трансгенных коров.

В тестовых экспериментах из пула в 2470 ооцитов были получены два трансгенных теленка. Этот результат указывает на результативность описанного подхода, но также и на его низкую эффективность. Исследования в этой области продолжаются, и есть надежда на усовершенствование методики трансгеноза. Например, скоро появится возможность отбирать небольшое число клеток у развивающегося эмбриона in vitro и тестировать их на наличие трансгена; такая потеря клеток эмбрионом не помешает его нормальному развитию. Этот тест позволит имплантировать только эмбрионы, несущие трансген.

Одна из целей трансгеноза крупного рогатого скота – изменение содержания в молоке различных компонентов. Так, количество сыра, получаемого из молока, прямо пропорционально содержанию в нем к-казеина, поэтому весьма перспективным представляется увеличение количества синтезируемого к-казеина с помощью гиперэкспрессии трансгена этого белка. Далее, если обеспечить экспрессию гена лактазы в клетках молочной железы, то можно будет получать молоко, не содержащее лактозы. Такое молоко незаменимо для многих людей, не переносящих лактозу; после приема молока или молочных продуктов у них возникает серьезное желудочное расстройство. Трансгеноз крупного рогатого скота – это весьма перспективный подход, но создание большого числа трансгенных животных потребует времени, ведь для того чтобы вырастить половозрелое животное из оплодотворенной яйцеклетки, нужно примерно 2 года.

Весьма актуально создание домашних животных с наследственной устойчивостью к бактериальным и вирусным инфекциям и паразитарным инвазиям. Известно о существовании пород с наследственной устойчивостью к бактериальным инфекционным заболеваниям – маститу (коровы), дизентерии (новорожденные поросята), холере (домашняя птица). Если в основе устойчивости к каждой из этих болезней лежит один ген, можно попытаться создать несущих его трансгенных животных. В настоящее время для борьбы с инфекционными заболеваниями домашних животных используют прививки и лекарственные препараты. Заболевших животных изолируют, за здоровыми ведут тщательное наблюдение. Стоимость всех этих мероприятий может достигать 20% обшей стоимости конечной продукции.

Для выведения линий животных, устойчивых к возбудителям инфекций, можно использовать другой подход, заключающийся в создании путем трансгеноза наследуемых иммунологических механизмов. С этой точки зрения рассматривают самые разные гены, ответственные за работу иммунной системы: гены основного комплекса гистосовместимости, Т-клеточных рецепторов, лимфокинов. Наиболее обнадеживающими на настоящее время являются предварительные результаты, полученные при введении мышам, кроликам и свиньям генов, кодирующих Н- и L-цепи какого-либо моно-клонального антитела. Идея этого подхода заключается в том, чтобы снабдить трансгенное животное наследуемым механизмом защиты, позволяющим обойтись без иммунизации с помощью прививок. Введение в организм реципиента генов антител, которые связываются со специфическими антигенами, было названо иммунизацией in vivo. Для этого гены Н- и L-цепей иммуноглобулинов моноклонального мышиного антитела к антителу, связывающемуся с 4-гидрокси-З-нитрофенилацетатом, вводили с помощью микроинъекций в оплодотворенные яйцеклетки мыши, кролика и свиньи. Во всех случаях в сыворотке трансгенных животных обнаруживалась соответствующая активность моноклонального антитела. Однако количество моноклональных антител, содержащих цепи Н и L, было невелико. Чтобы установить, можно ли решить эту проблему, необходимо протестировать различные трансгенные конструкции.

ТРАНСГЕННЫЕ ОВЦЫ, КОЗЫ И СВИНЬИ

Опыты по трансгенозу в случае овец и коз в основном были направлены на превращение молочных желез этих животных в своеобразные биореакторы для получения белковых продуктов, использующихся в медицине. Несмотря на то, что надои у овец и коз меньше, чем у коров, за год они дают сотни литров молока. С помощью метода, аналогичного используемому для создания трансгенных мышей и трансгенных конструкций, содержащих гены человека под контролем промоторов, специфичных для молочных желез (табл. 19.2), были созданы трансгенные овца и коза, в молоко которых секретировались белки человека. Они были гликозилированы и обладали активностью, близкой к таковой соответствующих белков, получаемых от человека. Однако, для того чтобы убедиться в полной эквивалентности этих белков, нужны дополнительные исследования. Экспрессия трансгенов в клетках молочных желез овец и коз не оказывала никаких побочных действий ни на самок в период лактации, ни на вскармливаемое потомство. В отличие от этого при введении свиньям трансгена бычего гормона роста под контролем промотора металлотионеина неблагоприятные эффекты наблюдались. Количество гормона у разных особей в группе трансгенных свиней различалось, однако в целом вся эта группа быстрее прибавляла в весе. К сожалению, этот положительный результат частично обесценивался различными патологиями: у животных отмечались язва желудка, почечная недостаточность, хромота, воспаление перикарда, уменьшение подвижности суставов, предрасположенность к пневмонии. Причины этих симптомов неизвестны. Возможно, они связаны с долговременным присутствием в организме избытка гормона роста. В этих экспериментах трансген синтезировался более или менее непрерывно. Были созданы также трансгенные овцы с повышенной скоростью роста шерсти. Для этого кДНК овечьего инсулиноподобного фактора роста 1 была помещена под контроль мышиного промотора гена кератина с высоким содержанием серы, что обеспечивало гиперэкспрессию кДНК. При этом у трансгенных овец в отличие от свиней никаких нежелательных побочных эффектов не наблюдалось.

Таблица 19.2. Трансгенные конструкции, содержащие гены человека под контролем промоторов,
специфичных для молочных желез, и реципиентные организмы

Положительные результаты были получены и в ходе экспериментов с трансгенными свиньями. Например, были созданы здоровые трансгенные свиньи, в геноме которых присутствовала следующая генетическая конструкция: регуляторная область гена β-глобина человека, два гена α₁-глобина человека и один ген β^А-глобина человека. В результате ее экспрессии в клетках крови свиней синтезировался человеческий гемоглобин, при этом в результате замены человеческого промотора гена β-глобина свиным человеческий гемоглобин синтезировался в значительно большем количестве. Человеческий гемоглобин, продуцируемый трансгенными сзичьями, обладал такими же химическими свойствами, что и природный человеческий. Его можно было очистить от гемоглобина свиней обычной хроматографией.

Эти результаты указывают на принципиальную возможность замены цельной крови, используемой при трансфузии, человеческим гемоглобином, полученным методом трансгеноза. Однако изолированный гемоглобин переносит кислород не так эффективно, как гемоглобин в составе эритроцитов. Более того, он быстро разрушается в организме животного, которому был введен, а продукты его распада токсичны для почек. Таким образом, получение заменителя человеческой крови с помощью трансгеноза – это дело далекого будущего.

В последнее время большое внимание уделяется вопросу об использовании органов животных для трансплантации человеку. Основная проблема межвидовой трансплантации – это гиперострое отторжение. Гиперострое отторжение влечет за собой связывание антител организма-хозяина с углеводной антигенной детерминантой на поверхности клеток пересаженного органа. Связавшиеся антитела вызывают острую воспалительную реакцию (активацию каскада комплемента), происходит массовая гибель несущих антитела клеток и быстрая потеря пересаженного органа.

В естественных условиях воспалительная реакция блокируется особыми белками на поверхности клеток, выстилающих стенки кровеносных сосудов. Эти белки – ингибиторы комплемента видоспецифичны. Было высказано предположение, что если бы животное-донор несло один или несколько генов человеческого белка, ингибирующего комплемент, то пересаженный орган был бы защищен от первичной воспалительной реакции. С этой целью были получены трансгенные свиньи, несущие различные человеческие гены ингибитора комплемента. Клетки одного из этих животных оказались совершенно нечувствительными к компонентам системы каскада комплемента. Предварительные эксперименты по пересадке органов трансгенных свиней приматам показали, что ткани пересаженного органа повреждаются славее, а сам орган не отторгается немного дольше. Возможно, трансгенные свиньи, несущие человеческий ген ингибитора комплемента и лишенные основного поверхностного белка клеток свиней, который вызывает острейшее отторжение, будут служить источником органов для трансплантации человеку.

ТРАНСГЕННЫЕ ПТИЦЫ

Микроинъекция ДНК в оплодотворенные яйцеклетки птиц с целью получения трансгенных линий – непростая процедура. Это связано с некоторыми особенностями воспроизводства и развития птиц. Так, при оплодотворении у птиц в яйцеклетку могут проникнуть сразу несколько сперматозоидов, а не один, как это обычно бывает у млекопитающих, и идентифицировать тот мужской пронуклеус, который соединится с женским, становится невозможно. Метод микроинъекции ДНК в цитоплазму тоже не подходит, поскольку в этом случае ДНК не интегрируется в геном оплодотворенной яйцеклетки. Наконец, даже если удастся осуществить микроинъекцию ДНК в ядро, дальнейшие операции будет трудно осуществить, поскольку у птиц яйцеклетка после оплодотворения достаточно быстро обволакивается прочной мембраной, покрывается слоем альбумина и внутренней и наружной известковыми оболочками.

Однако трансген можно вводить в область желтка (зародышевый диск), который содержит и женский, и мужской пронуклеусы и образуется раньше, чем скорлупа. После введения ДНК каждую яйцеклетку культивируют in vitro, и когда образуется зародыш, его помещают в суррогатное яйцо, чтобы имитировать вылупление. При помощи такой стратегии была получена одна линия трансгенных цыплят. Однако в настоящее время этот метод неэффективен и технически трудновыполним в обычных условиях.

К тому времени, когда наружная известковая оболочка яйцеклетки птиц затвердевает, зародыш, находящийся на стадии бластодермы, состоит из двух слоев по 40 000 и 80 000 клеток. Проведены эксперименты по инокуляции такого зародыша ретровирусными векторами с нарушенной репликацией, несущими бактериальные маркерные гены. В результате были получены трансгенные цыплята и обыкновенные перепела, несущие чужеродные гены в клетках зародышевой линии. Обычно такие птицы не продуцируют свободных вирусных частиц, и тем не менее применение ретровирусных векторов в качестве «поставщиков» чужеродных генов животным, которые затем могут использоваться в пищу, неизбежно вызывает вопросы относительно безопасности такого подхода. Кроме того, размер трансгена, который может быть введен в организм реципиента в составе ретровирусного вектора, не превышает ~8 т.п.н., а в некоторых случаях интеграция в исходный сайт нестабильна. Все это заставило исследователей искать альтернативные способы трансгеноза.

Никаких специфичных для птиц ES-клеток не обнаружено, поэтому подход, основанный на их использовании, для птиц неприменим. Более перспективным представляется метод с использованием рекомбинантных эмбриональных клеток. Он состоит в следующем. Выделяют клетки бластодермы из куриного эмбриона, трансфицируют их с помощью катионных липидов (липосом), связанных с трансгенной ДНК (липосомная трансфекция), и повторно вводят в подзародышевую область свежеотложенных яиц (рис. 19.14). Часть потомков будет нести в каком-то небольшом количестве клетки донора: таких животных называют химерами. У некоторых химер клетки, произошедшие от трансфицированных клеток, могут образовывать линии зародышевых клеток, и после нескольких раундов скрещиваний таких химер можно получить линии трансгенных животных. Чтобы увеличить вероятность создания химер, несущих чужеродные гены в клетках зародышевой линии, число донорских клеток в химерах можно увеличить облучением эмбрионов реципиента перед введением в них трансфицированных клеток (540–660 рад в течение 1 ч). Под действием облучения некоторые (но не все) клетки бластодермы погибнут, и соотношение между трансфицированными клетками и клетками реципиента увеличится в пользу первых. По-видимому, таким образом можно получать трансгенных цыплят, хотя и с малой эффективностью.

Рис. 19.14. Получение трансгенных цыплят трансфекцией изолированных клеток бластодермы. Выделенные клетки трансфицируют трансгеном с помощью липосом и вводят в подзародышевую область облученной бластодермы реципиента. Часть полученных потомков являются химерами, а некоторые из них, несущие трансген в клетках зародышевой линии, при скрещивании могут дать начало трансгенным линиям.

Трансгенных цыплят можно использовать для улучшения генотипа уже существующих пород – для придания им (in vivo) устойчивости к вирусным инфекциям и заболеваниям, вызываемым кокцидиями, повышения эффективности усвоения пищи, снижения уровня жира и холестерола в яйцах, повышения качества мяса. Было предложено также использовать яйцо с его высоким содержанием белка в качестве источника белковых продуктов, использующихся в фармацевтической промышленности. Экспрессия трансгена в клетках репродуктивного пути курицы, где обычно секретируется большое количество овальбумина, может способствовать накоплению соответствующего белкового продукта в яйце, откуда его можно затем выделить.

 ТРАНСГЕННЫЕ РЫБЫ

По мере истощения природных рыбных запасов все большую роль будет приобретать разведение рыбы в искусственных условиях. Основная цель исследований в этой области – создание рекомбинантных рыб путем трансгеноза. До настоящего времени трансгены вводили микроинъекцией ДНК или электропорацией оплодотворенных яйцеклеток различных видов рыб – карпа, зубатки, форели, лосося и т.д. Поскольку у рыб пронуклеус в оплодотворенной яйцеклетке плохо различим в обычный микроскоп, линеаризованную трансгенную ДНК вводят в цитоплазму оплодотворенных яйцеклеток или клеток эмбрионов, достигших стадии четырех бластомеров. Эмбриогенез у рыб протекает в водной среде вне организма, поэтому в имплантации нет необходимости. Все дальнейшие процессы могут протекать в резервуарах с регулируемой температурой. Выживаемость эмбрионов рыб после микроинъекций довольно высока, от 35 до 80%, а доля трансгенных потомков колеблется от 10 до 70%. Трансген можно обнаружить с помощью ПЦР с использованием либо препаратов эритроцитов зародышей, либо суммарной ДНК. Скрещивая трансгенных рыб, можно вывести трансгенные линии.

Большинство первых исследований в этой области было направлено на исследование влияния трансгена гормона роста на скорость роста. В одном из экспериментов в яйцеклетки атлантического лосося был введен трансген, состоящий из следующих элементов: промотора гена антифризного белка американской бельдюги, кДНК гормона роста лосося, сигналов терминации/полиаденилирования 3'-конца гена антифризного белка американской бельдюги. Как правило, трансгенные лососи были крупнее и быстрее прибавляли в весе, чем контрольные нетрансформированные особи. В этом случае была выбрана система экспрессии с ускоренной транскрипцией гена гормона роста в холодной воде и пригодная для «всех рыб», что позволяло избежать биологической несовместимости, которая могла бы возникнуть, если бы ген гормона роста происходил не из рыб. Годовалые трансгенные особи, полученные в результате введения в яйцеклетки нерки генетической конструкции гормона роста, подходящей для «всех лососей», весили примерно в 11 раз больше, чем нетрансгенные. Физиологическая активность линий таких трансгенных лососей в естественных условиях вызывает значительный интерес. Предполагается, что в будущем гены устойчивости к болезням и стрессовым воздействием, а также гены, обуславливающие другие биологические особенности, будут введены как рыбам умеренных широт, так и тропическим рыбам.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Генетическая модификация животных при помощи технологии рекомбинантных ДНК (грансгеноза) основана на введении клонированного гена(ов) в геном клетки, которая могла бы дать начало клеткам зародышевой линии. Скрещивая трансгенных потомков, появившихся в результате такой операции, можно получить гомозиготные линии трансгенных животных. Большинство исследований в этой области проводилось на мышах. Обычно для этого вводили клонированный ген в оплодотворенную яйцеклетку мыши с помощью микроинъекции, имплантировали ее в ренипиентную самку и проверяли потомство на наличие введенного гена. Чужеродный ген можно вводить в оплодотворенную яйцеклетку мыши и с помощью ретровирусного вектора. Альтернативный подход заключается в выделении мышиных эмбриональных стволовых клеток и трансфекции их клонированным геном. При этом вводимая конструкция должна интегрироваться в геном стволовых клеток. Клетки, несушие ген-мишень в определенном хромосомном сайте, отбирают и культивируют, а затем вводят их в мышиные эмбрионы на ранних стадиях развития. Мышиные эмбриональные стволовые клетки плюрипотентны (тотипотентны), т. е. могут дать начало клеткам любого типа, в том числе и клеткам зародышевой линии. Для трансгеноза используют также искусственные дрожжевые хромосомы (YAC), несущие множество генов. Таким образом были получены мыши, синтезирующие только человеческие антитела. Их использовали в качестве модельных систем для изучения генетических болезней человека (например, болезни Альцгеймера).

С помощью аналогичных экспериментальных подходов были получены трансгенные коровы, овцы, свиньи, птицы и рыбы. Есть надежда, что трансгеноз позволит улучшать генотип существующих пород домашнего скота и выводить породы животных с новыми признаками. Кроме того, возможно, таких домашних животных, как коровы, овцы и козы, удастся использовать в качестве своеобразных «биологических фабрик» для получения продуктов клонированных генов, секретируемых в молоко.