• 4.2.1. Бродильное производство растворителей

О бродильном производстве глицерола шла речь в гл. 1, а о по­лучении этанола — растворителя, пищевого продукта, промежу­точного вещества в реакциях химического синтеза и горючего — в гл. 2. К числу других важных бродильных производств отно­сится получение ацетона и бутанола. Впервые в промышленном масштабе они были осуществлены в Манчестере Вейсманном в ходе первой мировой войны. Ацетон был необходим для произ­водства кордита и как метательное взрывчатое вещество в тя­желой артиллерии. До начала военных действий его импорти­ровали из Германии. Ацетон низкого качества получали путем сухой перегонки древесины, но для упомянутых целей нужен был высококачественный растворитель.

Таблица 4.1. Биотехнология и химическая промышленность

Бродильный процесс (ферментация) был основан на перера­ботке крахмала, концентрация которого составляла до 3,8% (вес/объем), анаэробными спорообразующими бактериями Clostridium acetobutyIicum. Превращению подвергалось до 30% субстрата, в результате чего получалась смесь растворителей (60% бутанола, 30% ацетона, 5—10% этанола, изопропанола и мезитилоксида). Остальная часть субстрата в ходе процесса, представленного на рис. 4.1, превращалась в водород и угле­кислый газ.

Рис. 4.1. Схема реакций ацетон-бутанольного брожения.

Поскольку образовывались большие объемы газов, при круп­номасштабном производстве перемешивания не требовалось, а главная сложность заключалась в гашении пены. В зависи­мости от штаммов отношение ацетон: спирт несколько варьиро­вало. Многие микробы, разрушающие крахмал и способные образовывать растворители, могут также сбраживать мелассу при содержании сахара в среде до 6% (вес/объем). Фактором, определяющим количество использованного субстрата, оказа­лась чувствительность организмов, участвующих в процессе, к н-бутанолу (верхний предел — около 1,2%, по объему) и аце­тону (0,4%). Заражения бродильных емкостей аэробными бак­териями обычно не происходило, и главной проблемой была инфекция бактериофагами. Впоследствии выяснилось, что уча­ствующие в процессе микроорганизмы можно «иммунизировать» путем нескольких пересевов в присутствии бактериофага. Было установлено, что фаговая инфекция является штамм-специфичной.

Растворители отделяли от среды отгонкой. В конце первой мировой войны главную роль стало играть производство бута­нола: он нашел применение при получении широкого круга веществ, включая мочевиноформ альдегидные пластмассы, пла­стификаторы и тормозные жидкости. Побочный продукт, водо­род, стал использоваться в производстве синтетического метано­ла и для гидрогенизации пищевых масел; углекислый газ либо сжижали, либо превращали в сухой лед. Твердые вещества отходов содержали большое количество рибофлавина (витами­на B₂), и их можно было использовать как богатую белком добавку к кормам.

После второй мировой войны бродильное производство этих растворителей, однако, сильно сократилось, так как относитель­ная стоимость нефтехимических продуктов по сравнению с по­лимерами сахаров уменьшилась. Производство н-бутанола путем ферментации продолжалось лишь в ЮАР. Однако в на­стоящее время получение бутанола с помощью ферментации становится все более выгодным, и очень может быть, что мето­дами генетической инженерии удастся создать такие микроор­ганизмы-продуценты, применение которых перетянет чашу весов в сторону этого способа. Главный недостаток существующих штаммов — низкая устойчивость к конечным продуктам и отно­сительно низкий выход растворителей.

В ходе второй мировой войны активно исследовалась воз­можность получения бутилен-2,3-гликоля; в последнее время к этому процессу микробиологической конверсии также прояв­ляется интерес. Одной из проблем молочной промышленности является использование сыворотки. Между тем она может быть источником углерода при образовании бутиленгликоля бакте­риями Klebsiella pneumoniae или Enterobacter aerogenes, кото­рый превращают затем в сырье для производства синтетическо­го каучука.

• 4.2.2.  Производство органических кислот

Среди органических кислот самая важная — уксусная. На ры­нок США ее ежегодно поступает около 1,4 млн. т общей стои­мостью до 500 млн. долл, (без учета уксуса). В прошлом ос­новную часть уксусной кислоты получали путем микробиологи­ческого окисления этанола, но сегодня, за исключением производства уксуса, этот процесс по экономическим соображе­ниям не применяется. Впрочем, в результате ведущихся иссле­дований термофильных бактерий, способных превращать цел­люлозу в уксусную кислоту, а также штаммов Acetobacter и Clostridium, способных синтезировать ее из водорода и угле­кислого газа, этот метод, может быть, восстановит свои позиции. Техническая уксусная кислота используется при выработке многих химических веществ, включая каучук, пластмассы, во­локна и инсектициды. При обычном способе производства микробиологическая конверсия этанола в уксусную кислоту при участии штаммов  Acetobacter и Gluconobacter идет в аэробних условиях и поэтому, строго говоря, не является процессом брожения. Уксус по праву считается важнейшим продуктом микробиологической промышленности (см. гл. 3).

В конце XIX в. началось промышленное производство мо­лочной кислоты при участии молочнокислых бактерий Lactoba­cillus delbrueckii, L. Ieichmannii и L. bulgaricus. Это был один из первых процессов, где применялась частичная стерилизация среды нагреванием. Этот микроаэрофильный процесс осуществ­ляется при высокой температуре (45—50°). В нем используют содержащее крахмал сырье, которое предварительно обраба­тывают ферментами или подвергают кислотному гидролизу (разд. 4.2.6). L. bulgaricus активно сбраживает лактозу и может поэтому использовать молочную сыворотку в качестве питатель­ного субстрата. В других случаях конверсии подвергается саха­роза (концентрация 12—18%, вес/объем). Процесс идет 3— 4 суток; при этом в больших количествах выделяется углекис­лый газ, что облегчает создание в среде оптимальных полуаэроб- ных условий. Описаны также способы конверсии 1,2-пропандио­ла в молочную кислоту при помощи Arthrobacter oxydans, Alca- Ugenes faecalis или Fusarium solani. Эти микроорганизмы в основном образуют L ( + )-изомер молочной кислоты, но некото­рые штаммы L. Ieichmanii синтезируют D(—)-изомер. Было изучено образование молочной кислоты при непрерывном куль­тивировании. В одностадийном процессе выход в случае L. del­brueckii составлял 89 г/л в сутки. При использовании препара­тов молочнокислых бактерий, иммобилизованных в альгинатных гелях, степень конверсии достигала 97%. Доля L ( + )-изомера составляла 90%, а время полужизни—100 суток. В этих про­цессах молочную кислоту получают в форме кальциевой соли; чтобы выделить конечный продукт, ее обрабатывают серной кислотой. Молочную кислоту используют в качестве добавки к безалкогольным напиткам, эссенциям, фруктовым сокам, дже­мам и сиропам, для декальцификации кож в дубильной про­мышленности, а также при производстве пластмасс, когда Ь( + )-форму полимеризуют в полилактат, применяемый для производства пластиковых оберток. Соли молочной кислоты ис­пользуются в медицине.

Производство лимонной кислоты методом ферментации при участии грибов (рис. 4.2) также принадлежит к числу давних биотехнологических процессов; оно было налажено в 1893 г.

Рис. 4.2. Производство лимонной кислоты.

Его развитие шло в тесной связи с разработкой многих фунда­ментальных аспектов микробиологии. Вначале основные проб­лемы были связаны с микробным загрязнением. В поисках их решения было найдено, что процесс можно вести при очень низких pH, и это почти не сказывается на образовании кислоты грибами. В таких условиях создавать и поддерживать стериль­ность гораздо проще. За 1—2 недели ферментации при высоких концентрациях сахара в сырье выход достигал 60%. Наиболь­ший выход получали, когда тем или иным способом ограничи­вали рост мицелия. Первоначальный вариант процесса основы­вался на поверхностной ферментации, но в 1950 г. было внесено важное изменение — освоено глубинное культивирование. Было показано, что стабильный процесс глубинной ферментации воз­можен только в том случае, если он осуществляется в две стадии: на первой идет рост мицелия, а на второй (в несодер­жащей фосфор среде)—образование лимонной кислоты. За ко­роткий срок были разработаны схемы, основанные на исполь­зовании дешевого углеводного сырья: мелассы, крахмала и глюкозного сиропа. Наличие ионов металлов в исходном сырье приводит к резкому падению выхода; их нужно удалять либо путем осаждения гексацианоферратом, либо пропусканием через ионообменные смолы, либо применением солей четвертичного аммония. Для устранения вредного влияния этих примесей ши­роко используется также метанол и другие низшие спирты. Механизм их действия неизвестен. Возможно, они как-то влия­ют на цитоплазматическую мембрану. В 60-х годах для произ­водства лимонной кислоты был предложен новый процесс на основе н-парафинов (Сэ—зо) и штаммов Corynebacterium, Arthro- bacter и Brevibacterium, но рыночной продукции с его помощью получено не было. Изучалось также образование лимонной кис­лоты дрожжами Candida. Они синтезируют смесь лимонной и изолимонной кислот в соотношении, зависящем как от генети­ческих факторов, так и от условий ферментации. Было найдено, что ключевую роль здесь играет аконитат-гидролаза: мутанты с малой активностью этого фермента продуцировали больше лимонной кислоты. Растущие на углеводородах дрожжи также способны синтезировать лимонную кислоту из глюкозы. Гриб Trichoderma viride образует большое количество цитрата из глюкозы; это позволяет вырабатывать лимонную кислоту из целлюлозы. C помощью некоторых видов Penicillium можно вести ферментацию с образованием Бэ-алло-изолимонной кис­лоты, диастереомера изолимонной кислоты.

В промышленном производстве лимонной кислоты в основ­ном используется Aspergillus niger, но применяется также и A. wentii. Процесс ферментации очень сложен, так как лимон­ная кислота является продуктом первичного метаболизма этих грибов, и любое сколько-нибудь существенное выделение этого промежуточного соединения обмена веществ в окружающую среду свидетельствует о сильном нарушении метаболизма, воз­никающем вследствие его дисбаланса или генетических нару­шений. Рост грибов обычно регулируют путем изменения соста­ва среды (P, Mn, Fe, Zn). Субстрат должен легко усваиваться; негидролизованные полимеры обычно не используют, так как в этом случае внеклеточный гидролиз будет лимитировать ско­рость всего процесса.

Сверхпродукция лимонной кислоты является ответной реак­цией на недостаток фосфата, но при выраженной нехватке ме­таллов лимитирующим фактором не обязательно является фос­фат. Роль металлов при этом до конца еще не понята. Оптимум pH составляет 1,7—2,0; в более щелочной среде происходит об­разование заметных количеств щавелевой и глюконовой кислот. Таким образом, тщательный контроль за культуральной средой позволяет обойти регуляторные системы обмена и создает оп­тимальный фон для образования лимонной кислоты. Видимо, в этих условиях стимулируется гликолиз и обеспечивается не­ограниченное поступление углерода в реакции промежуточного метаболизма. Уровень накопления цитрата зависит при этом от поступления оксалоацетата.

При недостатке марганца активность ферментов цикла три­карбоновых кислот уменьшается, что в свою очередь подавляет анаболизм. Такое нарушение обмена приводит к повышению концентрации аммонийных ионов внутри клеток, и они могут смягчать ингибирующее влияние цитрата на фосфофруктокина­зу. Кроме того, марганец, видимо, как-то влияет на биохимиче­ские свойства поверхности клеток и морфологию гиф. Посколь­ку в процессе потребляется много кислорода, возможно повтор­ное окисление цитоплазматического NADH без образования ATP. В нем участвует альтернативная, а не основная цепь ды­хательных реакций. В результате без сколько-нибудь выражен­ного изменения обмена возникает метаболическая «утечка» (flux) через гликолиз. Эта утечка, происходящая при участии конститутивной пируваткарбоксилазы и некоторых ферментов цикла трикарбоновых кислот, а также необычная кинетика действия ферментов, участвующих в метаболизме оксалоацета­та, приводят к увеличению внутриклеточной концентрации цит­рата. Последний способствует дальнейшему накоплению цитра­та путем ингибирования изоцитратдегидрогеназы.

В промышленном производстве лимонной кислоты применя­ется несколько вариантов процесса. Традиционным твердофаз­ным вариантом является процесс Коджи; он имеет много обще­го с процессом поверхностной ферментации. Глубинная фермен­тация с технической точки зрения сложнее, чем поверхностная, но возможна в разных вариантах: периодическом с подпиткой и непрерывном. Периодическая ферментация используется при работе с глюкозосодержащими субстратами, а ее вариант с подпиткой чаще применяется при переработке мелассы. Непре­рывное культивирование, дающее наибольший выход продукта, также возможно, но применение этого способа в промышленно­сти в обозримом будущем маловероятно. Для процесса харак­терно два максимума скорости: роста и образования продукта. На первом этапе образуется значительное количество продукта, зависящее от скорости роста. На втором этапе рост отсутствует, а предельное количество образующегося продукта определяется концентрацией биомассы. В конце ферментации массу мицелия отделяют фильтрованием и промывают. Затем при pH<3,∙0 осаждают щавелевую кислоту в форме оксалата кальция. Бо­гатый белком мицелий можно использовать на корм скоту. Лимонную кислоту осаждают из жидкой фазы в форме каль­циевой трехзамещенной соли в комплексе с четырьмя молеку­лами воды. Осадок отфильтровывают, промывают и свободную кислоту получают путем обработки сульфатом кальция. Далее ее очищают при помощи активированного угля и ионообменных смол. Можно также экстрагировать кислоту растворителем.

У лимонной кислоты приятный кислый вкус, она хорошо растворима в воде. Ее широко используют в пищевой, фарма­цевтической и косметической промышленности. Эфиры лимон­ной кислоты применяются в производстве пластмасс. Поскольку лимонная кислота связывает (хелатирует) металлы, ее исполь­зуют для их очистки. В составе детергентов она легко разруша­ется живыми организмами, и ею заменяют фосфаты.

• 4.2.3. Другие органические кислоты

Процессы, основанные на микробиологической ферментации, разработаны и для получения ряда других органических кислот. Среди них — глюконовая кислота и ее производные, яблочная, виннокаменная, салициловая, янтарная, пировиноградная и кое- вая кислоты. Хотя некоторые из них и поступают на рынок, в нынешних условиях в большинстве случаев такое производст­во экономически невыгодно.

D-глюконовая кислота и ее б-лактон представляют собой простые продукты окисления (дегидрогенизации) глюкозы (рис. 4.3). Еще в начале 20-х годов было налажено промышлен­ное производство этой кислоты из глюкозы при участии Asper­gillus niger. Нейтрализация кислоты позволяла получать боль­шой выход продукта. В погруженных культурах за 48 ч конверсия субстрата составляла 90%. Исследования на полу­промышленных установках показали, что если ферментацию вести при повышенном давлении, то выход кислоты за 24 ч составляет 95% от теоретического при использовании раствора глюкозы с концентрацией 150—200 г/л. Процесс можно вести в полунепрерывном режиме, заново используя мицелий (до де­вяти раз подряд). Более того, концентрацию глюкозы можно довести до 350 г/л, если для удаления кислоты использовать комплексообразование с соединениями бора и получать боро- глюконат кальция. Однако для осуществления этого процесса нужны особые, устойчивые штаммы. От него отказались после того, как было выяснено, что эта соль неблагоприятно влияет на кровеносные сосуды животных. Контроль за pH осуществля­ли путем добавления углекислого кальция либо едкого натра.

Рис. 4.3. Органические кислоты, получаемые из глюкозы.

Было найдено, что образование глюконата прямо связано с ко­личеством глюкозооксидазы в среде. Этот фермент в промыш­ленном масштабе получают методом ферментации.

Натриевая соль глюконовой кислоты используется для из­влечения металлов. Когда pH процесса контролируют с по­мощью едкого натра, получают именно эту соль. Был разрабо­тан непрерывный процесс ее производства, при котором выход натриевой соли из 35%-ного (вес/объем) раствора глюкозы составляет 95%. Предпринимались попытки применить при бро­жении иммобилизованные системы (как целые клетки, так и глюкозооксидазу). Натриевая соль глюконовой кислоты в при­сутствии едкого натра играет роль ловушки кальция и поэтому используется в составе щелочных средств для мытья бутылок. Она также способна связывать ионы железа в широком диапа­зоне pH и как препятствующий отложению железа агент при­меняется в составе щелочных препаратов для борьбы со ржав­чиной. Кальциевые и железные соли глюконсвой кислоты применяются как пероральные и внутривенные препараты в ме­дицине, а чистая кислота — как моющее средство в молочной промышленности. Глюконолактон находит применение как мед­ленно действующий подкислитель в составе пекарских порош­ков, при переработке мяса и в других отраслях пищевой про­мышленности.

Процесс образования глюконовой кислоты при участии бак­терий нашел ограниченное применение лишь в некоторых стра­нах Востока. Например, так называемый «чайный гриб» (ассо­циация дрожжей, уксуснокислых и глюконовокислых бактерий) превращает подслащенный заваренный чай в напиток, содер­жащий смесь этих кислот. Малая эффективность реакций окис­ления глюкозы, идущих при участии бактерий, определяется тем, что одновременно с главным процессом идет образование 2-оксоглюконовой, 5-оксоглюконовой и диоксоглюконовой кис­лот. Для выработки этих кислот, которые могут служить субст­ратами для дальнейшей биологической или химической перера­ботки, были разработаны специальные процессы. Так, 5-оксо- глюконовую кислоту можно гидрогенизировать в ходе химиче­ской реакции и получить L-идоновую кислоту, которая в свою очередь служит субстратом в ферментативной реакции синтеза 2-оксогулоновой кислоты (рис. 4.3). Такие превращения можно осуществить и чисто биологическим путем: при помощи видов Acetobacter глюкозу переводят в 2,5-диоксоглюконовую кисло­ту, которая превращается в 2-оксогулоновую кислоту при уча­стии Corynebacterium или Brevibacterium в ходе двух- или одностадийного процесса на основе смешанных культур этих бактерий. Выход продукта, правда, невелик. 2-Оксогулоновая кислота — весьма ценный продукт, так как ее метиловый эфир в щелочных условиях легко превращается в аскорбиновую кис­лоту.

Виннокаменная кислота является обычным побочным про­дуктом виноделия. Однако ее можно получать и путем микроб­ной трансформации 5-оксоглюконовой кислоты. Штаммы, спо­собные превращать глюкозу в 5-оксоглюконат через глюконат, могут путем дальнейшей ферментации образовывать тартрат. Для этой цели обычно используют мутанты Acetobacter и Glu- Conobaeter. Виннокаменную кислоту можно вырабатывать так­же из транс- или цис-эпоксиянтарной кислоты. Соли ее (тартра­ты) находят широкое применение в пищевой промышленности, но методы биотехнологии в ее производстве обычно не исполь­зуются.

Яблочную кислоту, которая применяется в качестве подкис­лителя в пищевой промышленности, можно получать из фума­ровой либо путем ферментации при участии видов Paracolo- bactrum, либо с помощью иммобилизованной фумаразы. Описа­ны также способы ее получения из н-парафинов при помощи дрожжей и из этанола при участии Schizophyllum commune.

Итаконовую кислоту, идущую на производство пластмасс и красителей, получают с высоким выходом путем ферментации глюкозы с участием грибов из рода Aspergillus. Совсем недавно на основе биотехнологии из углеводных субстратов, а также С12-14-парафинов при участии Candida Iiydrocarbofurmarica по­лучали 2-оксоглутаровую кислоту, но на смену этому способу пришло каталитическое окисление бензола.

Большинство органических кислот, вырабатываемых с по­мощью микробов, является продуктом переработки пищевого сырья; исключение составляют кислоты, производимые из н-парафинов. О возможности использования других видов углеводо­родного сырья как потенциального источника более ценных органических соединений говорится уже давно, но лишь немно­гие процессы используются сегодня для получения промышлен­ной продукции. Так, из нафталина при помощи микробов вы­рабатывают салициловую кислоту и другие окисленные его производные. Об этом в последние двадцать лет писали не раз (Cain, 1980; Tangnu, Ghose, 1980, 1981).

К числу бактерий, способных вырабатывать салициловую кислоту (рис. 4.4) при росте в средах с нафталином, принадле­жат многие виды Pseudomonas, Achromobacter и Corynebacte- rium. Запатентован способ выработки о-гидроксибензальпиро- виноградной кислоты и 1,2-дигидро-1,2-дигидроксинафталина при участии видов Nocardia. Большинство диких штаммов бак­терий, расщепляющих нафталин, при хорошей аэрации в про­стых солевых средах редко образует салицилат в концентрации, превышающей 1%, но путем изменения сред и отбора подходя­щих штаммов могут быть получены и более высокие выходы.

Одним из основных факторов, влияющих на выход, является доступность субстрата, и накопление салицилата происходит лишь при постоянном присутствии нафталина: это угнетает дальнейшие окислительные превращения. Механизм деградации зависит от относительной концентрации нафталина и салицило­вой кислоты. Сложность заключается в том, что полиароматический нафталин плохо растворим в воде, в среде ферментации он обычно присутствует в виде тонкой взвеси.

Рис. 4.4. Микробиологическая конверсия нафталина в полезные органические вещества.

Добавление эмульгаторов типа Span 80, Span 20, лецитина, кефалина и дру­гих поливиниловых спиртов существенно увеличивает накопления салицилата, так как при этом повышается доступность субстрата. Обычно используют чистый нафталин, но салицилат можно получать и из неочищенных нафтафракций. Примеси (алкилнафталины, тиофен, бензотиофен и крезолы) этому не мешают.

В ходе ферментации pH быстро падает, так что нужно ис­пользовать сильно забуференные среды с высокой концентраци­ей фосфата либо добавлять мочевину или углекислый кальций. Для максимального накопления салицилата необходимы ионы  различных металлов. Сообщалось, что выход можно еще более повысить, если внести в среду особые добавки: органические и  неорганические производные алюминия или бора, пантотеновую кислоту и ряд других веществ. Ферментация регулируется на­капливающимся продуктом, а не субстратом; удаление салицилата из среды снимает его ингибирующее влияние на рост и приводит к дальнейшему образованию салициловой кислоты. Продукт отделяют двумя способами. Для этого используют ани­онообменную смолу (типа амберлит IRA-400), которую либо  вносят прямо в среду, либо помещают в диализный мешок; при этом салициловая кислота адсорбируется смолой. Культураль­ную жидкость можно пропускать через колонку с ионообменной смолой, смонтированную около ферментера. При этом концентрация продукта в ферментере все время поддерживается на низком уровне, что многократно увеличивает выход (до 6 раз); возрастает полнота извлечения продукта. Альтернативный спо­соб удаления продукта — диализная ферментация. Применение этого процесса на небольшой опытной установке позволило уве­личить выход салицилата от 10 до 206 г/л. Преимущество ме­тода состоит в том, что удается избежать неблагоприятного воздействия ионообменных смол; с другой стороны, приходится использовать большие объемы жидкой среды, что снижает кон­центрацию в ней продукта. Применяются и другие, более тра­диционные способы отделения продукта, например экстракция растворителем. Производство салицилата путем ферментации  также страдает от фаговой инфекции, и приходится вести рабо­ту по селекции устойчивых к фагам мутантов.

Показано, что деградация нафталина и салицилата микро­организмами нескольких родов детерминируется плазмидами. Так, за превращение нафталина в салицилат ответственна плаз­мида NAH: она несет гены ферментов, осуществляющих этот процесс (нафталиноксигеназы, 1,2-диоксинафталиноксигеназы, дегидрогеназы салицилового альдегида). Таким образом, у мно­гих микроорганизмов, использующих нафталин, генетическая информация для осуществления этого процесса закодирована в плазмиде, но это бывает не всегда. В ходе использования та­ких плазмид создаются предпосылки для встраивания соответ­ствующего генетического материала в хромосомы клеток хо­зяина, что превращает штаммы в продуценты салицилата. Способность использовать или окислять нафталин обычно за­крепляется при росте на нафталине, салицилате или его анало­гах, таких как бензоат или аминобензоат. Описаны интересные процессы сопутствующего окисления: мутантные штаммы Pseu­domonas putida, выращенные на среде с глюкозой, которая слу­жит единственным источником углерода и энергии, способны окислять нафталин до дигидрокси-1,2-дигидронафталина и 1,2-гидроксинафталина на основе индукции ферментов нафталином или другими соединениями-индукторами, происходящей после завершения роста. Первое из этих соединений после кислотной дегидратации превращается в а-нафтол — важное моноокисленное производное нафталина (рис. 4.4).

• 4.2.4.  Аминокислоты (см. также гл. 3)

Производство аминокислот при помощи бактерий
и их мутантов

Все аминокислоты, из которых состоят белки, являются L-cc-амино- (или имино-) кислотами. Они находят применение как пищевые добавки, приправы, усилители вкуса, как сырье в парфюмерной и фармацевтической промышленности и при про­изводстве других веществ. Их можно получать как из природ­ных продуктов (главным образом при гидролизе белков рас­тений), так и путем химического, микробиологического или ферментативного синтеза. Если химический синтез дает продуктрацемат, который требует дальнейшей обработки (разд. 4.2.6), то последние два метода позволяют получить оптические чистые аминокислоты.

Секретом большинства производственных процессов с уча­стием микроорганизмов, о которых говорится в этой главе, яв­ляется изменение условий среды: именно за счет этого достига­ется синтез избыточных количеств желаемого продукта. Необ­ходимого дисбаланса метаболизма можно добиться путем эмпирического изменения таких факторов, как концентрация субстрата, pH, концентрация продукта, или же путем установ­ления критических уровней содержания других веществ (ионов металлов, органических добавок) в среде. При переводе биоло­гических процессов образования аминокислот на коммерческую основу были выработаны новые способы желаемых изменений метаболизма у организмов-продуцентов, направленных на уве­личение выхода промежуточных продуктов, образование кото­рых в иных условиях находится под строгим метаболическим контролем.

Для производства аминокислот бактерии стали использо­ваться с начала 50-х годов. Штаммы их постоянно улучшали генетическими методами, выделяя ауксотрофные мутанты и му­танты с измененными регуляторными свойствами. Чтобы обес­печить образование аминокислот в больших количествах, в лю­бом случае необходимо изменить систему регуляции обмена. Для этого можно либо стимулировать потребление субстрата в некоторых путях биосинтеза и выделение аминокислот в среду, либо подавить побочные реакции и процессы деградации амино­кислот.

Производство таких аминокислот, как L-глутамат, L-валин, DL-аланин, L-глутамин и L-пролин, при участии диких штам­мов бактерий основано либо на использовании присущих этим бактериям особенностей метаболизма, либо на стимуляции об­разования аминокислот в ответ на изменение условий внешней среды. Образовывать аминокислоты способны бактерии многих родов (например, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Aerobacter, Microbacterium, Escherichia), причем они настолько продуктивны, что производство становится рентабельным. Так, виды Corynebacterium или Brevibacterium, выращиваемые на углеводном сырье (гидролизат крахмала, мелассы из сахарного тростника и свеклы), на этаноле или ацетате при наличии до­статочного количества биотина в среде способны синтезировать до 30 г/л глутамата. Для накопления этой аминокислоты важ­ным условием является полное или частичное подавление ак­тивности а-кетоглутаратдегидрогеназы. Образование продукта увеличивается при добавлении ^-лактамных антибиотиков (пе­нициллина, цефалоспорина С), поверхностно-активных веществ и жирных кислот. Влияние двух последних агентов обусловлено увеличением проницаемости клеточных мембран для глутамата, которая зависит от внутриклеточной концентрации жирных кис­лот и липидов. Путем изменения условий среды процесс фер­ментации, в ходе которого образуется L-глутамат, может быть переключен на синтез L-глутамина или L-пролина. При высокой концентрации биотина и ионов аммония создаются благоприят­ные условия для образования L-пролина, а при больших кон­центрациях аммония и ионов цинка в слабо кислой среде уси­ливается синтез L-глутамина. DL-аланин, видимо, образуется в реакции трансаминирования при участии пирувата; затем он подвергается рацемизации ферментом аланинрацемазой.

Ауксотрофные мутанты не могут образовывать ингибиторы соответствующего метаболического пути, работающие по прин­ципу отрицательной обратной связи, так как у них отсутствует определенная ключевая ферментативная реакция. Поэтому при выращивании мутантного штамма в среде с минимальной кон­центрацией необходимого питательного ингредиента они способ­ны образовывать избыточные количества вещества-предшест­венника или близких к нему метаболитов блокированной реак­ции. Так, первые реакции в цепи биосинтеза L-аргинина (рис. 4.5) у Corynebacterium glutamicum ингибируются по ме­ханизму обратной связи самим конечным продуктом, и образо­вание соответствующих ферментов подавляется L-аргинином.

Рис. 4.5. Биосинтез L-аргинина.

У цитруллинового ауксотрофа этой бактерии отсутствует фер­мент, называемый орнитин-карбамоилтрансферазой, который катализирует превращение орнитина в цитруллин на одном из промежуточных этапов биосинтеза L-аргинина. Синтез аргинина не идет, что приводит к снятию ингибирования по принципу обратной связи со всех ферментов этого пути и накоплению избытка орнитина. Ауксотрофные мутанты находят применение и в тех случаях, когда необходимо синтезировать соединения, являющиеся конечными продуктами разветвленных цепей мета­болических реакций. Так, L-acπapτaτ является общим предшест­венником для L-лизина, L-треонина, L-метионина и L-изолейцина. Первая реакция в процессе образования всех этих амино­кислот катализируется аспартокиназой, активность которой может быть ингибирована по механизму обратней связи при совместном действии L-лизина и L-треонина. У мутантов, ауксотрофных по гомосерину или треонину/метионину, существен­но снижается внутриклеточная концентрация L-треонина, что снимает блокаду с аспартокиназы и позволяет клеткам накап­ливать L-лизин.

Получить ауксотрофные мутанты, способные накапливать конечные продукты неразветвленных цепей биосинтеза, напри­мер L-аргинин, невозможно. В таких случаях приходится отби­рать мутанты с частично нарушенной регуляцией биосинтеза, что позволяет получить повышенный выход конечного продукта. Такие мутанты известны под названием регуляторных; их отби­рают по устойчивости к аналогам аминокислот или же среди ревертантов ауксотрофов. В основе использования аналогов аминокислот лежит их сходство с природными аминокислотами. Они ингибируют рост бактерий, но этот эффект может быть уменьшен путем добавления соответствующей природной ами­нокислоты. Таким образом, аналоги выступают в роли искусст­венных, работающих по принципу обратной связи, ингибиторов ферментов, обеспечивающих биосинтез природных аминокислот, и одновременно подавляют процесс их включения в белки. Появление мутантов, устойчивых к этим ложным ингибиторам, означает, что регуляторные ферменты соответствующего пути обмена становятся у них нечувствительными к аналогу. Так, серусодержащий аналог лизина 5-(2-аминоэтил)-Ь-цистеин яв­ляется у Brevibacterium flavum ложным, действующим по прин­ципу обратной связи ингибитором аспартокиназы. Устойчивые к его действию мутанты вырабатывают фермент, который в 150 раз менее чувствителен к ингибированию по механизму обрат­ной связи, чем фермент исходного штамма, и в результате про­дуцируют до 33 г/л лизина. Для увеличения выхода можно воспользоваться как ауксотрофией, так и дефектами регуляции одновременно. Так, у Corynebacterium glutamicum и Brevibac- terium flavum сверхпродукции L-треонина не наблюдается, по­скольку происходит сочетанное ингибирование по механизму обратной связи аспартокиназы и L-треонином, и L-лизином, а L-треонин ингибирует и гомосериндегидрогеназу. Мутант, ус­тойчивый к аналогу треонина, а-аминоф-оксивалериановой кис­лоте, синтезирует в избыточном количестве треонин, так как ферменты его, ингибированные этой аминокислотой, десенсиби­лизированы. Принимающие участие в синтезе треонина гомо­сериндегидрогеназа и киназа также «выключаются» L-метиони- ном, и поэтому ауксотрофы по метионину образуют L-треонин с еще большим выходом.

Регуляторные мутанты можно получить путем трансдукции, проводя при этом отбор отдельных мутаций, вызывающих пол­ное рассогласование регуляторных механизмов, а затем объединяя эти признаки путем котрансдукции. Таким способом у од­ного штамма последовательно может быть закреплена устойчи­вость к нескольким аналогам (гл. 7).

Производство аминокислот из биосинтетических
предшественников

Использование предшественников при производстве аминокис­лот позволяет успешно «обходить» метаболический контроль,  осуществляющийся по механизму обратной связи и репрессии. Рассмотрим процесс синтеза L-лейцина из L-треонина через а-кетобутират. Первый фермент в этом пути биосинтеза, гидра­таза, у Serratia marcescens ингибируется L-изолейцином по ме­ханизму обратной связи. При добавлении в среду D-треонина происходит индукция D-треонингидратазы, которая L-изолейци­ном не ингибируется, и поэтому синтез L-изолейцпна из D-трео­нина может миновать метаболический контроль. C другой сто­роны, для того чтобы обойти контроль, можно использовать предшественники, превращаемые в ходе обмена в кетобутират (например, а-амино-, а-бром- и а-гидроксибутират); точно так же при участии гидроксиметилтрансферазы и в присутствии до­статочного количества метилентетрагидрофолата из предшест­венников глицина можно получать L-серин. В качестве постав­щиков C-I могут выступать глицин, формальдегид, формиат, саркозин, холин или метионин. При наличии в среде глицина, глюкозы и метанола метиониновый ауксотроф Artrobacter glo- biformis образует до 5,2 г/л L-серина. Для такой конверсии, а также для образования L-глутамата, L-метионина и аромати­ческих аминокислот могут использоваться и другие штаммы растущих на метаноле бактерий.

Синтез аминокислот с помощью ферментов

Об использовании чистых ферментов для нужд химии подробно будет говориться в разд. 4.2.6, а здесь мы остановимся на том, какова роль и ожидаемые преимущества применения ферментов при синтезе аминокислот. Эти процессы бывают одно- и много­стадийными, а используемые в них методы весьма разнообраз­ными от применения in situ интактных, но не растущих орга­низмов до иммобилизованных препаратов. В этой связи целе­сообразно рассмотреть пять классов ферментов.

1. Гидролитические ферменты (или гидролазы), например Е-а-амино-е-капролактам-лиаза (синтез L-лизина) или 2-амино- тиазолин-4-карбоксилатгидролаза (синтез L-цистеина) (рис. 4.6).

Рис. 4.6. Применение гидролитических ферментов при производстве аминокис­лот.

Чтобы можно было использовать неочищенные ферменты, целые клетки обрабатывают поверхностно-активными веществами, вызывающими изменение проницаемости. Кроме того, могут быть получены мутанты, у которых искомый продукт не вовлекается более в обмен веществ.

2. Лиазы. Эти ферменты часто используются в реакциях дезаминирования. Так, для образования L-acπapτa из фумарата аммония может использоваться (в обратной реакции) аспарта­за, или L-acπapτaτ — аммиак-лиаза. В качестве доноров аммо­ния могут, кроме того, выступать гидразин или гидроксиламин. Сходным образом L-фенилаланин — аммиак-лиаза может ката­лизировать распад L-фенилаланина с образованием транс-коричной кислоты и аммиака. Хотя обычно равновесие в этих реакциях сдвинуто в сторону реакций распада, при высоких концентрациях аммонийных ионов начинают преобладать про­цессы синтеза.

3. Ферменты, содержащие пиридоксальфосфат. Это обычные коферменты, участвующие в метаболизме аминокислот. Они ка­тализируют множество реакций: рацемизацию, трансаминирова­ние, декарбоксилирование, реакции замещения и элиминации и являются своего рода универсальными. По-видимому, роль этих коферментов состоит в активации аминокислот, что облег­чает их взаимодействие с апоферментом. Мы рассмотрим здесь лишь несколько ферментов из этой группы. Так, L-тирозин — фенол-лиаза ^-тирозиназа) катализирует реакцию р-элимина- ции, в которой тирозин распадается с образованием пирувата, фенола и аммиака. При оптимальных условиях Erwinia herbicola может синтезировать очень много этого фермента (до 10% растворимого белка). Его используют для синтеза тирозина: в иммобилизованной форме он применялся для непрерывного его производства. Субстратная специфичность этого фермента такова, что он может также осуществлять реакцию р-замещения между DL-серином и пирокатехолом, в результате которой об­разуется L-ДОФА (рис. 4.7). 

 Рис. 4.7. Реакции синтеза, катализируемые пиридоксалевыми ферментами.

Примером широкого распростра­ненного в природе фермента, осуществляющего дезаминирова­ние, может служить L-триптофан — индол-лиаза (триптофаназа). Она катализирует реакции аф-элиминации и ^-замещения и. ∣ также характеризуется широкой субстратной специфичностью (L-триптофан, L-цистеин, Б-метил-Ь-цистеин, р-хлор-Ь-аланин,. L-серин). Действие ее может быть обращено, и тогда она будет способствовать синтезу L-триптофана из индола, пирувата и аммиака. Примером индуцибельного фермента является L-ме- тионин — у-лиаза: она катализирует реакцию элиминации, где субстратами могут быть разнообразные аминокислоты, включая производные L-метионина и L-цистеина. L-метионин расщепля­ется с образованием метантиола, а-кетобутирата и аммиака. Когда фермент «работает на синтез», его можно применять для производства новых серусодержащих аминокислот на основе алкантиолов и арилтиоспиртов. Фермент может также расщеп­лять селенметионин. Использование селенолов в обратных ре­акциях замещения, идущих с образованием гомоцистеинов,, содержащих селен вместо серы, — это первый случай, когда, селен удалось включить в состав аминокислот (рис. 4.7).

Эту лиазу можно применять для синтеза меченых аминокис­лот.

1. Дегидрогеназы аминокислот, например лейцин- и аланин­дегидрогеназы. Эти ферменты катализируют обратимые реак­ции дезаминирования. Их применяют в непрерывных процессах синтеза аминокислот из соответствующих кето-аналогов.. В мембранном реакторе дегидрогеназы аминокислот удержива­ются ультрафильтрующей мембраной и используют в своей ра­боте один и тот же пул NADH₁ который сохраняется в реакторе,, так как ковалентно связан с полиэтиленгликолем. Регенерация: его в ходе процесса осуществляется с помощью формиатдегид­рогеназы (разд. 4.2).
2. Глутаминсинтаза. Этот фермент катализирует АТР-зави- симую реакцию аминирования глутамата, которая была сопря­жена со сбраживанием сахара дрожжами. Высвобождающаяся' при брожении энергия используется для синтеза глутамина. ¹ При распаде фруктозо-1,6-дифосфата, образовавшегося пр® сбраживании глюкозы, продуцируется ATP, которая необходи­ма для энергоснабжения эндергонической реакции, катализи­руемой синтазой. При использовании бесклеточного экстракта пекарских дрожжей и глутаминсинтазы Gluconobacter suboxy- dans из глюкозы, глутамата и ионов аммония в качестве суб­стратов с высоким выходом (92 мол. %) был получен глутамин.

Применение аминокислот

Аминокислоты находят применение во многих сферах.

1.  Их используют в качестве пищевых добавок. Так, лизи­ном, триптофаном и треонином обогащают растительные белки„ а метионин включают в блюда из сои.
2. При выработке пищевых продуктов аминокислоты находят (Применение в роли усилителей вкуса и добавок. Благодаря вы­раженному мясному вкусу широко используется L-энантиомер мононатриевой соли глутаминовой кислоты. Глицин добавляют как подсластитель, бактериостатическое вещество и антиокси­дант.
3. Аминокислоты применяются в медицине (вливания), .а некоторые их аналоги используются для лечения психических заболеваний.
4. В химической и фармацевтической промышленности ами­нокислоты широко используются как предшественники в произ­водстве детергентов, полиаминокислот (из них делают синтети­ческие волокна и пленки), полиуретана и химикатов для сельского хозяйства.

• 4.2.5. Антибиотики и стероиды

.Антибиотики (группа веществ микробного происхождения) играют большую роль в нашей жизни. В медицине и ветерина­рии они с успехом применяются как противомикробные и про­тивоопухолевые препараты; с их помощью контролируется рост .растений и ведется борьба с болезнями. Все антибиотики были выделены в ходе систематического скрининга микроорганизмов; число их было существенно увеличено путем химической моди­фикации, цель которой состоит в 1) расширении спектра дейст­вия и повышении эффективности; 2) снижении токсичности и устранении нежелательных побочных эффектов; 3) создании аналогов, устойчивых к разрушению микробами и обладающих поэтому большим не менем полужизни; 4) усовершенствовании способов их введения.

Со времени открытия и описания первых антибиотиков полу­чили путевку в жизнь целое поколение полусинтетических пенициллинов, цефалоспоринов, аминогликозидов, тетрациклинов, рифамицинов, макролидов и линкозаминидов. Эти соединения очень сложны, и метод полного химического синтеза не может конкурировать с их производством методом ферментации. По­скольку микробы могут разрушать антибиотики, возникла мысль модифицировать природные антибиотики ферментами микроорганизмов (вспомним о превращениях стероидов), но лишь немногие из таких веществ оказались экономически приемлемыми (6-аминопенициллановая кислота, 6-диметилтет-фациклины). Существует три основных способа получения но­вых антибиотиков.

1. Прямая ферментация. В этом случае используются обра­зующие антибиотик микроорганизмы, которые синтезируют но­вые биологически активные соединения в присутствии подходящих предшественников или ингибиторов метаболизма. Так, Penicillium Chrysogenum не только синтезирует пенициллин, но и включает фенилуксусную кислоту в бензилпенициллин, а дру­гие предшественники — в аналоги пенициллина. Этот принцип находит широкое применение, например, при получении новых блеомицинов путем добавления аминов к культуре S. Verticillus- и новых актиномицинов — путем добавления 4-метилпролина к среде для выращивания S. parυιιlus. При подавлении синтеза антибиотиков также иногда образуются полезные вещества. Так, при подавлении процесса присоединения хлора S. aureofa- ciens образует тетрациклин, а не хлортетрациклин. Если в сре­ду ферментации добавить L-метионин, то ингибируются реакции, метилирования и синтезируется 6-деметил-7-хлортетрациклин (табл. 4.2).

Таблица 4.2

2.  Мутанты организмов-продуцентов иногда образуют био­логически активные промежуточные продукты какого-то опре­деленного пути биосинтеза антибиотиков либо соединения, ко­торые могут оказаться полезными как предшественники при создании новых аналогов. «Блокированные» мутанты этого ти­па не способны образовать нужный антибиотик, если в среде отсутствует метаболитический предшественник, который в нор­ме образуется при участии фермента, действующего вслед заблокированным звеном метаболизма. 

Рис. 4.8. Структура рифамицина.

Поскольку ферменты, участвующие во вторичном метаболизме, нередко обладают от­носительно низкой субстратной специфичностью, аналоги пред­шественников антибиотиков могут быть относительно легко превращены мутантом в аналоги самого антибиотика в ходе процесса, известного как мутационный биосинтез, или мутасин- тез. Nocardia mediterranei синтезирует около двадцати разных рифамицинов (рис. 4.8). Путем добавления барбитала ход фер­ментации и как следствие спектр образуемых антибиотиков существенно меняется. Мутанты этого организма, у которого подавлена способность к ацилированию, образуют предшественник рифамицина В — рифамицин SV₁ который служит исход­ным веществом для получения многих синтетических рифамицинов (например, рифампицина, препарата для лечения туберкулеза, который действует и на возбудителя проказы). Другой мутант, с блокированным метилированием, синтезирует 27-деметилрифамицин SV₁ ценный субстрат для синтезов, кото­рый исключительно сложно получить химическими методами.

2. Особенно успешно модификация антибиотиков микроба­ми идет в следующих двух процессах.

 а. При ферментативном гидролизе пенициллина с образо­ванием 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК, рис. 9), ко­торая является ценным исходным продуктом при производстве .некоторых полусинтетических, важных для медицины аналогов пенициллина. В промышленности 6-АПК, ядро молекулы пени­циллина, получают путем гидролиза пенициллина или бензил­пенициллина при участии штаммов, с высоким выходом обра­зующих в ходе ферментации пенициллинацилазу; для этой же цели используют также иммобилизованную пенициллинацилазу.

Рис. 4.9. Гидролиз пенициллина с образованием 6-АПК (ядра молекулы пени­циллина) или пенициллиновой кислоты.

Исходя из типа пенициллина, который ацилазы предпочти­тельно гидролизуют, их подразделяют на группы. Некоторые из них способны катализировать и обратные реакции. На основе 6-АПК было получено более 40 000 полусинтетических пеницил­линов. В некоторых случаях не было необходимости выделять 6-АПК: примером может быть превращение бензилпенициллина в ампициллин. Гидролиз бензилпенициллина осуществляют при участии мутанта Kluyvera Cltrophila, после чего в ферментер
вносят мутант Pseudomonas melanogenum и метиловый эфир  DL-фенилглицина. Условия процесса изменяют таким образом, чтобы они способствовали образованию ампициллина (рис. 4.10). В роли катализатора выступает ацилаза, образуемая вторым мутантным организмом, которая не способна в этих условиях гидролизовать или синтезировать бензилпенициллин. В ходе  этого двухстадийного процесса образуется только ампициллин: [D (—) -а-аминобензилпенициллин].

Рис. 4.10. Синтез ампициллина.

 б. В клинике широко применяются аминогликозидные анти­биотики (стрептомицин, неомицин, канамицин, гентамицин). Бактерии, способные их инактивировать, были выделены не­только от больных, но и как самостоятельные, образующие ан­тибиотики штаммы. Их ферментативная активность может быть частью механизма детоксикации, при помощи которого организ­мы-продуценты защищают себя от неблагоприятного воздейст­вия образуемых ими же веществ. К числу модификаций, проис­ходящих при инактивации антибиотиков, относятся N- ацетилирование, О-фосфорилирование, О-аденилирование и О-нуклеотидилирование. Установление механизма модификации позволило планировать и осуществлять химический синтез но­вых аналогов, устойчивых к такой инактивации.

Инактивация антибиотиков по другому механизму, включая гидролиз, гидроксилирование, эпоксидирование, сульфоокисле­ние, фосфорилирование или восстановление, обычно приводит к образованию или полностью, или частично неактивных про­изводных. Их изучение позволит синтезировать новые аналоги, выявить те участки молекул, которые ответственны за антибио­тическую активность, а также создать рациональные основы «конструирования» антибиотиков и усовершенствования производства.

Пенициллиназы (р-лактамазы) гидролизуют р-лактамное кольцо молекулы субстрата и являются основой устойчивости болезнетворных бактерий к пенициллинам и цефалоспоринам. В результате гидролиза амидной связи кольца образуется пе­нициллиновая кислота (рис. 4.9), которая полностью лишена антимикробной активности. Эти ферменты синтезируются мно­гими бактериями; они могут различаться по строению и специфичности. Глубокое изучение механизмов их действия позволи­ло наладить производство устойчивых аналогов антибиотиков, таких как ампициллин и карбенициллин, а также найти при­родные ингибиторы лактамазы — клавулановую и оливановую кислоты. р-Лактамазы используются для оценки количества пенициллинов в пищевых продуктах и биологическом сырье, а также для инактивации пенициллина в молоке, что предот­вращает аллергические реакции у его потребителей.

Рис. 4.11. Гидролиз цефалоспорина С.

В некоторых случаях получить полезные предшественники с помощью микробов не удается. Так, при выработке цефало­спорина в основном образуется цефалоспорин С, который при­ходится затем химическим методом гидролизовать до 7-амино- -цефалоспорановой кислоты (рис. 4.11) и уже ее использовать как субстрат для получения новых полусинтетических цефало­споринов.

Способность микроорганизмов выступать в роли химических катализаторов впервые удалось использовать в полной мере для синтеза промышленно важных стероидов. В последние тридцать лет субстратная и стереоспецифичность ферментов нашла ши­рокое применение в производстве стероидов при осуществлении разнообразных реакций: гидроксилирования, дегидроксилирова­ния, эпоксидирования, окисления, восстановления, гидрогениза­ции, дегидрогенизации, этерификации, гидролиза эфиров и изо­меризации. Целью всеобъемлющих исследований в этой обла­сти было осуществление специфических структурных пере­строек стероидов при мягких условиях. Специфич­ность таких реакций определяется либо выбором оп­ределенного вида микроорганизмов, либо химической модифи­кацией субстрата, стереохимически исключающей другие реак­ции. Понимание зависимости между строением молекул субстрата и характером его перестройки, осуществляемой мик­роорганизмами, позволило сформулировать требования для каждой конкретной реакции, например для гидроксилирования. В определении скорости и направления реакции главную роль, как выяснилось, играют положение и ориентация замещающих групп в молекулах стероидов. История развития методов мик­робиологического преобразования стероидов представляет собой прекрасный пример сочетания химического подхода со специ­фичностью и разнообразием биологических систем. Кроме того, на этой основе может быть осуществлен синтез новых стероидов, обладающих лучшими фармакологическими свойствами.

Первый запатентованный процесс микробной трансформации стероидов был разработан в 1937 г., но внедрить его в промыш­ленность удалось лишь в 1952 г. [процесс 11-гидроксилирова­ния прогестерона некоторыми видами грибов (рис. 4.12)]. C технологической точки зрения этот процесс не потерял зна­чения и теперь. Сегодня в нем используются виды грибов с весьма высокой субстратной специфичностью относительно мес­та гидроксилирования. Дальнейшее усовершенствование процес­са может быть основано на использовании спор грибов или же на изменении состава культуральных сред. Упомянутая выше трансформация может быть выполнена с высоким выходом при концентрации субстрата 20—50 г/л. Сходным образом по поло­жению 7 и 14 может быть гидроксилирован дезоксикортикосте­рон. Если провести баметилирование ядра молекулы стероида, то нежелательного гидроксилирования по 7а-положению не произойдет. Направленное гидроксилирование путем химиче­ской модификации широко используется для повышения эффек­тивности процесса.

Рис. 4.12. Схема применяемого в промышленности метода микробной трансформации прогестерона.

Большинство поступающих в продажу стероидов, обладаю­щих противовоспалительным действием, — это производные преднизолона, и именно этим определяется важная роль про­цессов микробного гидроксилирования кортикостерона (веще­ства S Рейхштейна) и его производных. В промышленном мас­штабе производство гидрокортизона путем гидроксилирования кортикостерона осуществляется при участии некоторых видов грибов (например, Cunninghamella blakesleeana) с начала 50-х годов. За это время процесс был неоднократно усовершенство­ван. Проблемы, связанные с деградацией субстрата, которая происходит при обычных условиях производства, можно решить путем регулярного его добавления или использования других микроорганизмов, например Thieghemella orchidis. Кроме того, ход синтеза можно контролировать, применяя метод химической модификации. Так, метилирование по 16а-положению подавля­ет нежелательное восстановление кетогруппы при С-20, а обра­зование уксуснокислого эфира по С-17 стереохимически препят­ствует другим побочным реакциям. Конечное превращение гидрокортизона в коммерческие продукты со структурой пред­низолона также осуществляет­ся с помощью микробов. Хи­мические методы здесь явно проигрывают по сравнению с микробиологическими. Одной из главных реакций в этом процессе является образова­ние 1,2-двойной связи; для де­гидрогенизации по положению 1 используют главным обра­зом Mycobacterium gIobiforme и Arthrobacter simplex. Выход этой реакции зависит от того,  какой форме подается суб­страт. Если он поступает в среду в микрокристаллах, то концентрацию субстрата мож­но довести до 400 г/л и полу­чить выход 80—90%. При мо­дификации прегнана получают многие фармакологически цен­ные кортикоиды, гестагены и анестезирующие средства сте­роидной природы. Их произ­водство основано на проведе­нии широкого спектра превра­щений, осуществляемых мик­робами.

Другой важной группой со­единений, модифицируемых с помощью микробов, являются андростаны и эстраны. Их используют в промышленном синтезе половых гормонов и минералокортикоидных соеди­нений. Примером такого рода служит превращение дрожжа­ми 4-андростен-3,17-диона в тестостерон. Все возрастающее значение приобретает процесс окислительного расщепления боковой цепи С1э-стероидов: он позволяет использовать дешевые стероиды для производства предшественников, идущих на синтез стероидов, крайне нужных фармакологам. И в этом случае приходится проводить химическую модификацию, чтобы предотвратить разрушение «скелета» молекул стероидов. Она заключается в гидроксили­ровании по положению С-9 и направляет процесс микробной перестройки Структур на разрушение боковых цепей. Так, холестерол или его соли превращаются в 4-холестен-З-он и 1,4-андростадиен-3,17-дион. Для более глубокого знакомства с проб­лемой микробной трансформации стероидов мы отсылаем чи­тателя к литературе, приведенной в конце главы.

Дальнейшие успехи в области применения методов микро­биологии в химии стероидов будут основаны на применении иммобилизованных клеток и органических растворителей, что позволит расширить масштабы производства.

• 4.2.6.  Коммерческие аспекты применения ферментов

Применение ферментов в химической технологии обычно бывает обусловлено их высокой избирательностью и стереоспецифич­ностью, однако, как отмечалось ранее, эти их свойства не всегда оказываются желательны. Примером такого рода могут служить случаи использования широкой субстратной специфичности фер­мента для производства аналогов основного продукта. Второе важное преимущество технологии на основе ферментов перед химическим катализом заключается в том, что при относительно мягких условиях удается достичь более высоких скоростей пре­вращений. Об использовании отдельных ферментативных реак­ций для получения аминокислот и антибиотиков мы уже гово­рили; в этом разделе будет описано сегодняшнее положение дел в сфере использования ферментных препаратов в промышлен­ности (табл. 4.3).

Протеиназы

Протеиназы давно применяются в пищевой промышленности. Ранее ферменты для этих целей выделяли из животных и рас­тений; сегодня их частично замещают протеазы микробов. Пер­вым ферментом, нашедшим применение в промышленности, бы­ла а-амилаза (такадиастаза) из Aspergillus oryzae, производ­ство которой началось в 1890 г. Эти препараты содержали значительную примесь протеазы, и их рекомендовали исполь­зовать как средство, способствующее пищеварению. Отметим, что производство и поступление на рынок такого рода продук­тов было весьма ограниченным вплоть до начала 60-х годов, когда их стали использовать в составе детергентов. Впрочем, о такой возможности было известно за пятьдесят лет до этого; средство для замачивания белья, содержащее соду и панкреа­тические ферменты, продавалось еще в 1913 г. Крупный успех в производстве и продаже таких средств был достигнут лишь после того, как стали использоваться протеазы Bacillus subtilis, в особенности субтилизин Carlsberg. В конце 60-х годов при­близительно 50% всех детергентов, выпускавшихся в Европе и США, уже содержали протеазы. Постоянно ведется работа по увеличению активности ферментов (особенно их способности удалять пятна) и стабильности их в моющих растворах. Еще одна отрасль, где наблюдалось бурное развитие технологий на основе протеаз, — это производство сыра. Здесь все усилия бы­ли направлены на поиск микробных заменителей сычуга телят. Для выработки протеаз в промышленном масштабе нужны штаммы микроорганизмов, синтезирующие внеклеточные про­теазы с высоким выходом. Эти ферменты подразделяют сегодня на три группы: сериновые, кислые и металлопротеазы.

Таблица 4.3

Среди сериновых протеаз на первом месте стоит субтилизин Carlsberg. При участии Bacillus Ucheniformis ежегодно произ­водится около 500 т очищенного фермента. Накопление про­теазы начинается в конце логарифмической фазы роста микро­бов, и выход фермента увеличивается при использовании аспо­рогенных штаммов (они удобны еще и тем, что при этом удается исключить технически сложную операцию по отделению спор от фермента). Сериновые протеазы не гидролизуют белки до аминокислот. В стиральные порошки обычно добавляют 0,5% (по весу) препарата, содержащего 3% активного фермента. Хотя содержание фермента в них и мало, при стирке он кон­центрируется на пятнах белковой природы из-за сродства к субстрату. В меньшей степени применяются протеазы алкало- фильных видов Bacillus-, они активны при pH 9—12 и темпера­туре выше 50 °C.

В состав металлопротеаз входит атом металла, обычно цин­ка, без которого фермент не активен. В промышленности металлопротеазы получают с помощью Bacillus amyloliquefaciens и В. Ihermoproteolyticus. Специфичность действия этих фермен­тов выше, чем у сериновых протеаз, но их нельзя использовать как «микробный сычуг», так как уровень неспецифического про­теолиза у них все же весьма высок. Они применяются в пиво­варении, при гидролизе белков ячменя, так как сериновые про­теазы ингибируются веществами солода. Удаление с их помощью белков позволяет избежать помутнения пива при охлаждении, которое происходит в результате взаимодействия белков с тан- нинами при хранении пива на холоде. C той же целью часто используются протеазы растений папаин и бромелаин.

Кислые протеазы синтезируются грибами. По свойствам они похожи на пищеварительные ферменты животных пепсин и рен­нин. Применяют их для гидролиза соевого белка при производ­стве соевого соуса, в хлебопекарной промышленности (здесь с их помощью видоизменяют свойства клейковины муки так, чтобы получить мягкое, пластичное тесто, из которого делают бисквиты), как средства, способствующие пищеварению или же предотвращающие помутнение пива при охлаждении. Большин­ство протеаз вызывает свертывание молока, но творог получа­ется невкусным, из-за глубокого гидролиза казеина. Субстрат­ная специфичность кислых протеаз термофильных грибов Mucor pusillus и Mucor miehei уже. Они похожи на ферменты сычуга и широко применяются для створаживания молока. Менее ши­роко используются протеазы Enthothia parasitica, так как они обладают большей, чем «сычужные» ферменты Mucor, протео­литической активностью; они применяются, например, при вы­делке эмментальского сыра. Разрабатывается и другой подход: на основе технологии рекомбинантных ДНК проведено клониро­вание и получена экспрессия гена реннина телят в микроорга­низмах (например, E. coli). Синтезированный таким способом фермент успешно прошел испытания при опытном производстве сыра (гл. 3).

Протеазы находят применение и в кожевенной промышлен­ности, при удалении шерсти и умягчении кож. Такая обработка делает кожи мягкими и эластичными.

Глюкозоизомераза

«Королевой» иммобилизованных ферментов в промышленности можно считать глюкозоизомеразу, которая катализирует пре­вращение глюкозы во фруктозу. Коммерческие препараты ее известны под фирменным названием «Sweetzyme» или «Маха- zyme». Их появление послужило толчком для развития круп­ного производства фруктозного сиропа. При высоких концент­рациях субстрата и нейтральных pH несладкая глюкоза с вы­ходом 42—47% изомеризуется ферментом в более сладкую фруктозу. Такие фруктозные сиропы (Isomerose, Isosyrup, Corn­sweet, Isosweet) сегодня широко потребляются пищевой про­мышленностью. Запатентовано множество способов иммобили­зации и использования как самой изомеразы, так и содержащих ее клеток. Процесс идет при 60—65 ⁰C при pH 7,0—8,5 в при­сутствии ионов магния. При производстве насыщенного фрук­тозного сиропа из кукурузы в качестве субстрата используется либо глюкоза, либо продукт комплексной ферментативной пе­реработки, заключающейся в ожижении и осахаривании крах­мала.

Амилазы и амилоглюкозидазы

Использование ферментов в производстве крахмала позволяет контролировать глубину его гидролиза и получать продукцию с желаемыми свойствами: вязкостью, сладостью, осмотическим давлением и устойчивостью к кристаллизации. Гидролиз ката­лизируется ферментами трех разновидностей: эндоамилазами, экзоамилазами и а-1,6-глюкозидазами.

Эндоамилазы — это а-амилазы, они расщепляют а-1,4-глю- козидные связи в амилозе и амилопектине с образованием оли­госахаридов с разной длиной цепи и a-конфигурацией при Ci-атоме глюкозы, способной служить восстановителем. Для ожижения крахмала при высокой температуре используют тер­мостабильные а-амилазы. Так, температурный оптимум у фер­мента из Bacillus amyloliquefaciens лежит при 70 °C, а у амила­зы В. Iicheniformis — при 92 °C. Непродолжительное время по­следняя может работать при температуре до HO⁰C. В этих условиях активность фермента стабилизируется ионами каль­ция и высокой концентрацией субстрата в среде. Для ожиже­ния крахмал диспергируют в воде при нагревании; для умень­шения вязкости и во избежание оседания крахмала при охлаж­дении проводят частичный его гидролиз. При одностадийном ожижении фермент добавляют в самом начале, до приготовле­ния суспензии, которое проводят при 150 ⁰C в течение 5 мин, после чего гидролиз ферментом ведут 2 ч при 95 ⁰C .При кислотно-ферментном ожижении фермент вносят после желирования крахмала, вызванного нагреванием.

При осахаривании используются термостабильные а-амилазы, особенно мальтогенные ферменты из грибов. Лучше всего они работают при 55^oC и концентрации субстрата 30—40%. Процесс обычно продолжается более 48 ч. Получаемые из крах­мала сиропы содержат много мальтозы (40—50%); они находят применение при производстве карамели и замороженных десерт­ных блюд. Для получения сиропов с очень высоким содержани­ем мальтозы (80%) мальтогенные экзоамилазы используются вместе с а-1,6-глюкозидазами.

Экзоамилазы расщепляют а-1,4-глюкозидные связи, а глю- когенные экзоамилазы гидролизуют а-1,6-глюкозидные связи в разветвленных молекулах олигосахаридов, в то время как маль­тогенные экзоамилазы (например, З-амилаза злаков) не спо­собны проходить эти точки ветвления. Последовательное уда­ление низкомолекулярных компонент (глюкозы или мальтозы) с нередуцирующего конца полимерной молекулы крахмала при­водит к постепенному уменьшению вязкости; образующийся продукт имеет р-конфигурацию при Ci-атоме восстанавливаю­щей молекулы глюкозы. Для промышленных целей глюкоами­лазы получают из Aspergillus niger или Rhizopus spp. Это низ­коспецифичные ферменты, которые гидролизуют связи а-1,3 и а-1,6 медленнее, чем а-1,4. Они стабильны в широком диапазо­не pH и более активны при 75 °C, хотя обычно им приходится функционировать при 65 °C. Эти ферменты могут также ката­лизировать полимеризацию глюкозы с образованием мальтозы и изомальтозы, но осахаривание никогда не достигает равно­весия, и эта реакция особого значения не имеет. В препаратах этих ферментов присутствует загрязняющая примесь трансглю­козилаза, катализирующая образование несбраживаемых олиго­меров глюкозы за счет реакции переноса молекул глюкозы при осахаривании. Это может существенно снижать выход глюкозы. Глюкоамилазы применяются в основном в производстве кон­центрированного сиропа (90—97% D-глюкозы), из которого вы­рабатывают кристаллическую глюкозу или же концентрирован­ные фруктозные сиропы (см. предыдущий раздел). Для полу­чения максимального выхода продукта при осахаривании клю­чевое значение имеет процесс ожижения; при ферментативном ожижении выход продукта больше, чем при кислотном, так как в этом случае образуется меньше побочных продуктов. Глюко­амилазы применяются также при выработке сиропов с высоким декстрозным эквивалентом или с высокой степенью конверсии (35—43% глюкозы, 30—37% мальтозы и 8—13% мальтотриозы) для пищевой промышленности. Сиропы, полученные кислотным гидролизом, обрабатывают мальтогенными и глюкогенными ами­лазами. Состав продукта при этом зависит от соотношения ис­пользованных в производстве ферментов.

Большинство разновидностей крахмала, важных в промыш­ленном отношении, содержит 80% амилопектина, который лишь частично расщепляется в ходе ферментативного гидролиза. Под действием а-амилаз из него образуются производные декстри­нов, которые далее уже гидролизоваться не могут. Так как по точкам ветвления гидролиз под действием глюкоамилаз идет медленно, используют а-1,6-глюкозидазы, из них в промышлен­ном масштабе — пуллуланазу (пуллулан-6-глюканогидролазу).

Ферментативная переработка крахмала проводится сегодня в широком диапазоне pH. Задачей будущего является выделе­ние термостабильных ацидофильных ферментов, что позволит вести переработку при одном и том же pH (4-5).

Другие ферменты, имеющие коммерческое значение
(см. также гл. 3)

Сегодня ферменты применяются наиболее широко для превра­щения углеводов, играющих особую роль в пищевой и молоч­ной промышленности. Так, р-галактозидазу (лактазу) применя­ют для гидролиза лактозы в снятом молоке. Получаемый без­лактозный продукт используется теми людьми, организм кото­рых не способен синтезировать лактазу. Этот фермент приме­няется, кроме того, для переработки лактозы сыворотки в глюкозогалактозные сиропы, а также подкисленной сыворотки, образующейся при получении творога.

Под действием инвертазы из сахарозы получают глюкозу. Для определения количества глюкозы в жидкостях тела в кли­никах в последнее время стала широко использоваться глюкозо- оксидаза — как в свободной форме, так и иммобилизованная.

На коммерческий уровень поставлено ферментативное раз­деление рацемических смесей аминокислот и эфиров терпенов. Такие смеси аминокислот образуются при химическом синтезе, и разделение их по оптическим свойствам составляющих имеет важное практическое значение. Известно, что для этого можно использовать соответствующие физико-химические методы (ме­ханическое разделение, избирательная кристаллизация, хрома­тографическое разделение) и химические подходы (фракцион­ная кристаллизация солей диастереомеров), но гораздо более эффективными и удобными оказываются процессы, основанные на стереоспецифичности ферментов. Укажем некоторые из ис­пользуемых здесь приемов.

1. Получение асимметричных производных, например обра­зование амидов М-ацил-L-аминокислот, катализируемое папаи­ном, бромелином или фицином. Так, взяв анилин и папаин, мы получаем нерастворимые L-анилиды аминокислот. Их можно гидролизовать химическим способом и получить L-изомер.
2. Асимметричный гидролиз. В этом случае осуществляется стереоспецифический гидролиз производных аминокислот, в ре­зультате которого образуется лишь один энантиомер. Эфиры L-аминокислот гидролизуют протеолитическими ферментами (например, химотрипсином); нужный продукт и не вступающие в реакцию D-эфиры разделяют по растворимости.
3. Использование амидаз. Эти ферменты из почек и подже­лудочной железы млекопитающих или из микроорганизмов сте­реоспецифически гидролизуют амиды L-аминокислот, которые затем отделяют методом дифференциальной растворимости. Амиды менее склонны к спонтанному гидролизу, чем эфиры, и с помощью этого метода получают оптически более чистые препараты аминокислот.
4. Стереоспецифический гидролиз М-ацил-Ь-аминокислот. В этом случае используются аминоацилазы или карбоксипеп­тидазы, и в результате образуются L-аминокислоты. Ацилазы получают из самых разных микроорганизмов. Иммобилизован­ная аминоацилаза одного из грибов успешно использовалась в установке для непрерывного ферментативного разделения.

В конце 60-х годов в промышленности стали применять ме­тод разделения рацемических смесей эфиров терпенов при по­мощи гидролаз: было обнаружено, что ферментативный гидро­лиз этих эфиров идет только в том случае, если эфирная связь экваториальна или же легко принимает эту конформацию. Раз­деление по оптическим свойствам зависело также от положения диастереомерных центров; оно шло успешно в случае эпимеров вторичных спиртов. В качестве катализатора применяли дрож­жи, иммобилизованные в полиуретане. Опыт проводили с DL-ментолсукцинатом, для которого в водонасыщенном н-геп- тане степень конверсии составила 72,6%. В результате был по­лучен оптически чистый L-ментол. Этот метод разделения с про­изводительностью 800 кг был запатентован. Рацематы терпенов можно разделять и путем обращенного гидролиза: сначала при участии липазы получают эфиры, а затем гидролизуют их хи­мическим методом.

Будущее технологии иммобилизованных ферментов

Сегодня в промышленности реализовано всего четыре крупно­масштабные технологии на основе иммобилизованных фермен­тов (глюкозоизомеразы, аминоацилазы, пенициллинацилазы и лактазы). Последнюю иммобилизовали на частицах кремнезема и применяли для конверсии лактозы сыворотки в глюкозу и галактозу. В обозримом будущем иммобилизованные ферменты могут быть использованы для следующих целей.

1. Холинэстераза может применяться для определения пести­цидов. Степень ингибирования этого фермента в присутствии пестицидов оценивают электрохимическими или колориметриче­скими методами.
2. Аналогичным образом другие ферменты могут использо­ваться для определения токсических веществ. Так, карбоангид­раза очень чувствительна даже к малым концентрациям хлор- производных углеводородов, гексокиназа — к хлордану, линдану и токсафену.
3. Иммобилизованная диизопропилфторфосфатаза нервных клеток кальмара может найти применение для обезвреживания фосфоорганических нервных газов (зомана, зарина).
4. Иммобилизованная гепариназа может применяться для предотвращения тромбообразования в аппаратах искусственно­го кровообращения.
5. Иммобилизованная билирубиноксидаза может использо­ваться для удаления билирубина из крови новорожденных, стра­дающих желтухой.
6. Предложен новый способ применения иммобилизованного гемоглобина. Суть его состоит в том, что включенный в поли­уретановую матрицу белок образует «гемогубку», способную поглощать кислород прямо из воды с эффективностью 80%; Далее кислород высвобождается из полимера под действием слабого электрического разряда или в вакууме. Предполагается, что такая система может снабжать кислородом водолазов либо работающие под водой двигатели.
7. Возможно, вскоре удастся создать системы из нескольких иммобилизованных ферментов. Так, если заключить в микро­капсулы три фермента — уреазу, глутаматдегидрогеназу и глю­козодегидрогеназу, то их можно будет использовать для удале­ния мочевины из крови больных с почечной недостаточностью.
8. Иммобилизованные ферменты найдут дальнейшее приме­нение в молочной промышленности. При производстве сыра мо­гут использоваться иммобилизованные свертывающие молоко белки — реннин и пепсин. Для гидролиза жира в молоке можно использовать иммобилизованные липазы и эстеразы.
9. Разнообразные иммобилизованные ферменты со временем найдут применение и в датчиках для быстрого анализа. Сегодня в таком качестве используются лишь несколько ферментов, но когда будет решена проблема стабилизации, их число увеличит­ся. Особенно полезными из-за их высокой стабильности могут оказаться ферменты термофилов.