• 4.3.1. Биотехнология на основе растительных клеток

Растения издавна являются поставщиками химических соедине­ний для самых разных отраслей химической промышленности. Это не только такое сырье, как сахара, но и целый набор слож­ных вторичных метаболитов, например каучук, кокаин, вещест­ва, использующиеся в качестве красителей, вкусовых добавок и пряностей. Получить такие вещества методом химического син­теза часто бывает невозможно из-за сложности их строения. Сегодня, воодушевленные успехами биотехнологии, ученые вновь обращаются к царству растений. Они не только пытаются отыс­кать пути к улучшению способов выработки уже освоенной про­дукции (например, аймалина и кодеина), но и разработать новые принципы биотрансформации и получить новые продук­ты. Нам предстоит в ближайшие годы заставить гены растений работать в бактериальных клетках; сложность этой задачи со­стоит в том, что мы плохо знаем, как они работают даже в соб­ственных клетках. Кроме того, вторичные метаболиты образу­ются в результате многоступенчатых процессов, о регуляции которых нам тоже почти ничего не известно. Можно думать, что путем использования культур растительных тканей мы сможем разработать новые подходы к получению ценных химических продуктов, особенно лекарственных веществ, а также улучшить сорта растений. Работая с культурами тканей растений, мы сможем контролировать образование таких веществ и при этом не зависеть от капризов погоды и не думать о вредителях рас­тений, которые так сильно влияют на образование нужных нам веществ.

Культуры растительных тканей можно получить из любого вида растений. При этом используются разнообразные среды. Познание особенностей физиологии и биохимии таких культур позволили значительно повысить их урожайность и выход био­массы. Однако многие такие культуры не могут считаться истин­ными автотрофами, так как для роста им необходимы внешние источники углерода (в форме глюкозы или сахарозы), азот, ми­неральные вещества и факторы роста. Сегодня мы умеем полу­чать большое количество биомассы (20—30 г/л), но повысить выход интересующих нас веществ обычно удается лишь за счет снижения выхода биомассы и подавления роста. Выход различ­ных веществ в культуре может быть в 10 раз выше, чем в слу­чае растения, но для этого необходимо разработать новые стра­тегии скрининга и селекции, особенно если искомый продукт образуется в малых количествах.

C проблемами биотехнологии растительных клеток можно познакомиться на примере организации промышленного произ­водства первого вещества, полученного из культуры тканей рас­тения. Известно, что корни растения Lithospermum erytrorhizon содержат шиконин и его производные. Это растение издавна .используется в Японии как лекарственное, поскольку оно обла­дает антибактериальной и противовоспалительной активностью. Шиконин, ярко-красное вещество, производное нафтохонина, применяли и как краситель. Для того чтобы концентрация ши- конина в корнях достигла 1—2%, возраст растения должен со­ставлять 5—7 лет. Так как выращивать Lithospermum erythror- hizon в промышленном масштабе в Японии невозможно, его приходилось ввозить из Корси и Китая, а поэтому стоимость чистого природного вещества составляла 4500 долл, за 1 кг. Представлялось заманчивым наладить его промышленное про­изводство на основе культуры тканей растений. Клетки растений не выделяют вторичные продукты в среду, а запасают их в ва­куолях и органеллах, что затрудняет их получение. Однако на­копление шиконина облегчает отбор наиболее продуктивных линий, поскольку содержащие этот краситель клетки имеют яр­ко-красный цвет. Удалось выделить линию, накапливающую до 15% шиконина на сухую массу клеток. Последующая оптими­зация среды позволила достичь тринадцатикратного увеличения продуктивности. Был разработан двухступенчатый процесс куль­тивирования, в котором на первой стадии создавались оптималь­ные условия для наращивания биомассы, а на втором — для образования вторичных продуктов. Клетки растят в суспензион­ной культуре; для этого лучше всего подходят эрлифтные фер­ментеры, так как в них осуществляются одновременно как ин­тенсивное перемешивание, так и разделение клеток, а вероят­ность повреждения относительно хрупких клеток минимальна. Процесс производства шиконина начинается с наращивания кле­ток в ферментере объемом 200 л. Затем его содержимое пере­носят в аппарат объемом 750 л и проводят экстракцию обыч­ными химическими методами. Выход продукта за один цикл составляет 5 кг, поэтому стоимость его гораздо ниже, чем при получении упомянутым выше способом.

Шиконин можно выделять и иным способом — путем изме­нения pH среды или же добавления некоторых влияющих на проницаемость клеток веществ, например диметилсульфоксида. Такой подход может оказаться полезным при работе с иммоби­лизованными клетками: в этом случае благодаря селективной проницаемости можно будет постоянно удалять вторичные мета­болиты из внутриклеточных вакуолей без глубокого нарушения первичного обмена веществ. Необходимо отметить, что иммо­билизация, осуществленная наиболее мягким, щадящим мето­дом, может способствовать внутриклеточному накоплению со­единения в ответ на создание микроокружения, имитирующего условия в продуктивных частях растения. Рост можно замед­лить, направив питательные вещества на образование вторич­ных продуктов метаболизма. Так, клетки Catharanthus, иммо­билизованные в альгинат-акриламидной матрице, в больших, количествах выделяют в среду аймалин и серпентин. Для полу­чения ряда алкалоидов, производных индола [аймалина, вин­бластина и винкристина (два последних соединения применя­ются при лечении рака)], можно, по-видимому, использовать барвинок Catharanthus roseus. Необходимо отметить, что кон­центрация этих алкалоидов обычно крайне мала, и их прихо­дится выделять из смеси других образуемых растением алка­лоидов. Кроме того, в культурах тканей винбластин и винкри- стин не образуются, но разработан альтернативный способ их производства. Эти алкалоиды представляют собой асимметрич­ные димеры катарантина и виндилина, причем катарантин мож­но получать методом культивирования в большом количестве с относительно небольшой примесью других алкалоидов. Диме­ры затем можно синтезировать химическим путем.

Культивируемые ткани растений применяются также для проведения биотрансформации. Примером такого рода может служить образование стимулирующего работу сердца дигоксина путем 12-р-гидроксилирования дигитоксина в суспензионных, культурах или в иммобилизованных клетках наперстянки Digi­talis Ianata. На основе этих систем, а также иммобилизованных клеток моркови удалось осуществить и синтез ряда новых кар- денолидов.

Методы культивирования тканей растений применялись и для улучшения сортов сельскохозяйственных культур: повышения их устойчивости к болезням и неблагоприятным условиям среды,, увеличения содержания сахарозы и крахмала, повышения уро­жайности. Эти методы используют для выведения более продук­тивных древесных пород — источников лигноцеллюлозы, а так­же растений — продуцентов эластомеров (гваюла, молочай) или масла (масличная пальма, соя).

Таким образом, перспективы развития биотехнологии на ос­нове растительных клеток представляются весьма многообещаю­щими. Будет налажено производство новых лекарственных пре­паратов, подсластителей, средств защиты растений, веществ для косметической и парфюмерной промышленности. Возможности этой быстро развивающейся технологии будут еще более рас­ширены в результате дальнейшей разработки способов получе­ния гибридов путем слияния протопластов.

• 4.3.2. Химические вещества, получаемые из биомассы

Известно, что после окончания второй мировой войны химическая промышленность получала из природного газа и нефти разнообразные виды сырья высокой чистоты в большом коли­честве и по относительно стабильным ценам. Сегодня многое в этой сфере изменилось, кроме того, за последние пятнадцать лет больших успехов достигла биотехнология. Все это побудило переоценить возможности использования биомассы для произ­водства химических веществ. До развития нефтехимии из био­массы получали многие виды сырья для химической индустрии, например жиры и масла (для производства мыла и детергентов), метанол (путем сухой перегонки древесины) и растворители (за счет сбраживания крахмала и сахаров). Цены и доступность этого сырья (биомассы) существенно менялись. Как уже гово­рилось в этой главе и в гл. 5, большую роль в производстве химических веществ и полимеров, которые находят применение во многих отраслях промышленности, играет биомасса в виде сбраживаемых сахаров. Но в этом разделе мы уделим особое внимание использованию главных запасов биомассы — лигно­целлюлозы. Утилизация биомассы основана на процессе ее кон­версии в сбраживаемые субстраты, которые в свою очередь служат сырьем для многих отраслей микробиологической про­мышленности, производящих химические вещества, горючее и продукты питания. При этом необходимо эффективно исполь­зовать все компоненты биомассы: целлюлозу, гемицеллюлозу и лигнин. Лигнин защищает полиглюкан от действия ферментов, так что для успешного использования полимерной целлюлозы необходимо прежде всего удалить гемицеллюлозы, далее раз­рушить комплекс лигнина с целлюлозой, а затем — и кристал­лическую структуру самой целлюлозы. Эти задачи могут быть решены с применением разнообразных химических, физических и микробиологических методов.

Гемицеллюлозы легко удаляются путем растворения в сла­бой кислоте в ходе первичной обработки биомассы. При произ­водстве глюкозы из древесины довольно успешно применяется гидролиз слабым раствором кислоты при высоких давлении и температуре. Этот способ нашел применение в ряде стран. Го­раздо эффективнее гидролиз концентрированной кислотой, но для осуществления этого процесса требуются большие капита­ловложения. Особенно успешно применяется плавиковая кисло­та, причем безводную кислоту можно регенерировать. Лигноцел­люлозу можно также размалывать и затем подвергать радиа­ционному облучению в больших дозах. Получаемый такими способами лигнин различается по своим свойствам. Очищенные лигнины используются при выработке клеев, смол, адгезивов, типографской краски, для диспергирования красителей; они применяются как адсорбенты, изоляторы, используются при до­быче нефти, в асфальтовых смесях и при нанесении полимеров. После удаления лигнина экстракцией растворителями получают кристаллическую целлюлозу, которая идет на нужды бумажной промышленности. Рентабельность этого процесса определяется главным образом стоимостью регенерации растворителя. При­мером одностадийного процесса, протекающего в мягких усло­виях, является экстракция фенолом при 100^oC, когда лигнин и гемицеллюлозы растворяют в феноле, а высвободившуюся после фильтрования целлюлозу используют для выделки бумаж­ной массы. По мере остывания фенольного экстракта гемицел­люлоза концентрируется главным образом в водной фазе, от­деляясь от масел и лигнина, которые можно использовать для производства новых порций фенола методом гидрокрекинга. Таким образом, в отношении фенола и энергетических потреб­ностей— это самообеспечивающийся процесс. При «паровом взрыве» лигноцеллюлоза претерпевает превращения, в резуль­тате которых она становится более чувствительной к фермен­тативному гидролизу (как в рубце животных, так и вне его). При этом увеличивается и выход реакционноспособных лигни­нов, высвобождаемых под действием слабой щелочи. При раз­рушении замораживанием используется жидкий аммиак. В слу­чае умеренно твердой древесины метод автогидролиза на основе парового взрыва дает отходы, пригодные для дальнейшей пере­работки микробами; древесина хвойных и тропических пород, более богатая лигнином, плохо поддается такой обработке.

Для ферментативного превращения целлюлозы в глюкозу необходимы дорогостоящие целлюлазы и, возможно, для их по­лучения придется провести отбор мутантов с повышенной цел­люлолитической активностью. Достигнутая на сегодня скорость гидролиза целлюлозы все еще низка, но такую переработку можно объединить с процессом брожения при участии дрожжей, так что глюкоза будет и образовываться, и потребляться в од­ном и том же ферментере. Достоинства и недостатки такого процесса были изучены на опытных установках. Проведены ис­следования по клонированию генов целлюлаз и включению их в геном подходящих организмов-хозяев, которые тем самым приобретают способность к деградации содержащих целлюлозу субстратов. Такой прием позволяет осуществлять более широ­комасштабное и эффективное производство химических веществ из биомассы с помощью ферментов. Альтернативой прямой мик­робной конверсии является применение высокотемпературных анаэробных процессов при участии Clostridium thermocellum„ когда одновременно идут и гидролиз, и ферментация.

При помощи ферментов ксиланаз гемицеллюлозы могут быть разрушены с образованием пентозных сахаров. Найдены виды дрожжей, способные осуществлять ферментацию пентоз, но они чувствительны к спирту. Порог этой чувствительности может быть изменен генетическими методами; кроме того, путем кло­нирования гена ксилоизомеразы дрожжам Saccharomyces может быть передана способность потреблять ксилозу. Это позволит им осуществлять конверсию ксилозы (субстрата, на котором они не растут) в ксилулозу (субстрат, который они сбражи­вают) .

Биодеградация лигнина-—это окислительный процесс, осуще­ствляемый в первую очередь грибами. Высвобождающейся при этом энергии, по-видимому, недостаточно для обеспечения роста микроорганизмов. Сегодня изучению микробиологических и био­химических аспектов деградации лигнина уделяется все больше внимания. Показано, что в эксперименте внеклеточные фермен­ты гриба Phanerochaete Chrysosporium могут осуществлять де­градацию лигниновых модельных субстратов, при этом в про­цессе окислительного расщепления пропильных боковых цепей лигнина участвует перекись водорода.

Обнаружено, что Acetobacter xylinum может синтезировать целлюлозу из сахаров и крахмала. Это создает предпосылки для получения чистого полимера, необходимого для производ­ства вискозы, целлофана и других целлюлозных полимеров, вы­рабатываемых сегодня на основе лигноцеллюлозы, из которой удален лигнин.

Дискутируется вопрос о том, смогут ли конкурировать с та­ким сырьем, как целлюлоза, хитин (высокомолекулярный по­лимер N-ацетилглюкозамина) или же хитозан (сходный полимер с небольшим числом ацетилированных N-rpyππ), особенно если иметь в виду, что запасы их ограничены. Хитин можно получать из антарктического криля (рачков), отходов при переработке водных животных, имеющих панцирь, или же из грибного ми­целия— отхода бродильной промышленности. Оба полимера мо­гут иметь разнообразное применение: как адгезивы, коагулянты, переносчики лекарственных веществ, а также как добавки при. выделке бумаги и тканей.