• 5.4.1.   Введение

Термин «биополимеры» относится ко многим высокомолекуляр­ным соединениям (например, к нуклеиновым кислотам, полиса­харидам и липидам), синтезируемым самыми разными организ­мами. В этом разделе мы особенно подробно рассмотрим обра­зование микроорганизмами полисахаридов и полиф-гидрокси- бутирата. Эти биополимеры часто синтезируются в ответ на специфические условия среды в тех случаях, когда соединения углерода не являются фактором, лимитирующим рост, и, следо- звательно, могут служить резервным источником углерода и/или энергии (разд. 5.4.7).

'Рис. 5.11. Электронная микрофотография Saccharomyces Cerevisiae NRRLY2574, .демонстрирующая накопление урана на поверхности клеток (увеличение 35 000), фотография любезно предоставлена Дж. У. Страндбергом (G. W. Strand- berg, Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN).

• 5.4.2. Полисахариды

Полисахариды служат источником энергии и структурными компонентами клеточных стенок и внеклеточных капсул. Мно­гие из этих полимеров, имеющие коммерческую ценность как ’промышленные клеи, были получены из растительных тканей (экстракты семян и морских водорослей, древесные экссудаты и т. п.). Способность таких полисахаридов изменять реологиче­ские свойства воды, вызывая образование геля и влияя на свойства водных растворов в потоке, привели к их широкому промышленному использованию в самых различных ситуациях. Полисахаридные гидроколлоиды часто применяются в пищевой, фармацевтической, парфюмерно-косметической, нефтяной, бу­мажной и текстильной промышленности. Например, из красных водорослей производят в промышленных масштабах карраге- нан и агар, а из бурых — альгинаты. Однако получение полиса­харидов из растений и водорослей обладает своими недостат­ками.

1. Химический состав полисахаридов зависит от метаболи­ческих потребностей синтезирующих их организмов, связанных в свою очередь с изменениями внешних условий (например, се­зонные изменения, разные циклы развития растений, время их сбора и т. д.). Поэтому при производстве сырья невозможно обеспечить контроль за его качеством.
2. При переработке происходят изменение и разрушение продукта, поскольку такая переработка нередко включает гру­бые воздействия (щелочная экстракция, приводящая к р-эли- минации и разрушению; выщелачивание горячей водой; отбели­вание). При этом конечный продукт может приобрести неже­лательный запах или цвет.
3. Количество получаемого растительного продукта зависит от урожайности, погодных условий, заболеваний растений или загрязнения окружающей среды.

При получении полисахаридов из микроорганизмов обеспе­чивается контролируемый синтез полимеров и постоянство про­дукции. Кроме того, микробные полисахариды часто обладают уникальными физическими и химическими свойствами, улуч­шенными функциональными характеристиками; биологическая потребность в кислороде при их образовании невелика. Микро­организмы синтезируют множество полисахаридов в форме внеклеточных капсул или слизей, не связанных с клеточной стенкой. Как правило, в их состав входит небольшой набор мо­носахаридов (нейтральные гексозы, метилпентозы, кетосахара, аминосахара, уроновые кислоты), однако разное их сочетание дает полимеры с разнообразными физическими свойствами. Отметим, что получение микробных полисахаридов — относи­тельно дорогой процесс: для его осуществления требуются большие капиталовложения и энергетические затраты и необ­ходим квалифицированный персонал. Видимо, микробные поли­меры не вытеснят окончательно крахмал и его производные из всех сфер их использования. Оценивая целесообразность про­мышленного производства того или иного полисахарида, сле­дует учитывать следующие факторы: 1) потенциальный объем годового производства продукта и спрос на него как в настоя­щее время, так и в будущем; 2) уникальность свойств данного-

продукта по сравнению с другими микробными и растительны­ми полисахаридами; 3) экономичность производства и предпо­лагаемую длительность применения продукта.

Микроорганизмы, образующие полисахариды, найдены в самых разных средах, но вряд ли существует определенная стратегия их выделения. Было показано, что синтез полимеров идет как в аэробных, так и в анаэробных культурах. Установ­лено, что психрофильные микроорганизмы синтезируют полиса­хариды, относительно же активности такого рода у термофилов мало что известно.

• 5.4 3. Образование полисахаридов при брожении

Для образования большого количества полимера требуется легкодоступный и дешевый источник углерода. Ферментация позволяет культивировать организм-продуцент в строго опреде­ленных условиях среды, контролируя, таким образом, процесс биосинтеза и влияя на тип продукта и его свойства. Специфи­чески изменяя условия роста, можно менять молекулярную массу и структуру образующегося полимера. В ряде случаев максимальная скорость синтеза полисахарида достигается в логарифмической стадии роста, в других — в поздней логариф­мической или в начале стационарной. Обычно углеводными субстратами служат глюкоза и сахароза, хотя полисахариды могут образовываться и при росте микроорганизмов на н-алка- иах( C∣₂-6i), керосине, метаноле, метане, этаноле, глицероле и этиленгликоле. Недостатком проведения процесса в ферменте­рах является то, что среда часто становится очень вязкой, по­этому культура быстро начинает испытывать недостаток кис­лорода; мы все еще не умеем рассчитывать соотношение меж­ду скоростью перемешивания неньютоновских жидкостей и по­дачей кислорода. Необходимо также контролировать быстрые изменения pH среды. И все же упомянутый метод позволяет быстро синтезировать полимер для того, чтобы определить его физические свойства, а также дает возможность оптимизиро­вать состав среды, главным образом в отношении эффективно­сти различных углеводных субстратов. Часто в качестве лими­тирующего фактора применяют азот (соотношение углерод: -азот—10:1), хотя можно использовать и другие (серу, маг­ний, калий и фосфор). Природа лимитирующего фактора спо­собна определять свойства полисахарида, например его вяз­костные характеристики и степень ацилирования. Так, многие полисахариды, синтезируемые грибами, фосфорилированы. При недостатке фосфора степень фосфорилирования может умень­шаться или становиться равной нулю; в этих условиях может даже измениться соотношение моносахаридов в конечном по­лимере. Недостаток калия приводит к снижению синтеза поли­сахарида из-за уменьшения поступления питательных веществ.

После удаления микробных клеток центрифугированием продукт извлекают из культуральной жидкости относительно мягким и простым способом, который включает осаждение ор­ганическими растворителями (спиртами, ацетоном). Таким обра­зом уменьшается вероятность разрушения или модификации полимера. Крупные клетки грибов лучше всего удалять центри­фугированием. При крупномасштабном производстве эффектив­ное удаление продуцента часто бывает затруднено, и культу­ральную жидкость пастеризуют нагреванием или гомогениза­цией. Чтобы при отделении не возникало лишних сложностей, нужно разумно сбалансировать степень конверсии углеводного= сырья и вязкость среды при завершении процесса. Нередко осаждению полимера в присутствии смешивающихся с водой органических растворителей способствует добавление какого- либо электролита. Другой вариант этого метода предусматри­вает добавление растворителя в меньшем количестве, чем требуется для осаждения полимера. После удаления твердых компонентов фильтрованием при IOO⁰C добавляют еще одну порцию растворителя для осаждения полисахарида. Можно также высушивать отфильтрованную культуральную жидкость распылением, осаждать полимер путем добавления поливалент­ных катионов или с помощью четвертичных аммониевых соеди­нений (цетилтриметиламмонийхлорида) в сочетании с метано­лом. Последний метод используется нечасто.

Недостатки, присущие культивированию в ферментерах, для которого характерны постоянные изменения концентрации пи­тательных веществ, микроорганизмов и синтезируемых про­дуктов, можно устранить, применяя непрерывные культуры. Исходно такие культуры использовались при изучении физио­логии синтеза полисахаридов, однако они оказались весьма перспективными для получения стабильно высокой продуктив­ности. Рост микроорганизмов можно регулировать с помощью только одного лимитирующего компонента и непрерывно кон­тролировать остальные параметры. Таким образом можно  изучать влияние разных лимитирующих питательных веществ- и разных скоростей роста при постоянных прочих условиях среды (например, регулировать количество растворенного кис­лорода путем изменения скорости вращения мешалки и интен­сивности аэрации). У некоторых микроорганизмов, например у Xanthomonas Campestris и Azotobacter Vinelandii, скорость об­разования полисахарида зависит от разведения, причем при  более низком разведении наблюдается увеличение выхода по­лимера. У других организмов синтез не зависит от разведения. В случае непрерывных культур возникает проблема стабиль ности штаммов, т. е. появления вариантов, не образующих по­лисахарид. Все здесь определяется природой используемого организма и условиями его культивирования. Так, Xanthomo- nas juglandis, специфичный по отношению к хозяину вариант X. Campestris, в культурах с ограниченным содержанием азота не меняется на протяжении более чем 900-часового непрерыв­ного синтеза полисахарида; при этом наблюдается высокий выход полимера. Параметром, способствующим возникновению мутантов с измененной способностью к синтезу полисахаридов иногда служит ограничение по углероду в непрерывных куль­турах. Ферментацию с образованием полисахаридов удается контролировать многими способами, но постоянного выхода продукта можно достичь путем регуляции вязкости культуры. Однако при культивировании в ферментерах с перегородками иногда образуются области с повышенной вязкостью из-за при­стеночного роста или накопления полисахарида в других участ­ках. При таких неоднородных условиях роста контроль за вяз­костью среды осуществлять не удается.

К нерешенным биоинженерным проблемам относятся: боль­шой расход энергии на перемешивание вязких сред, недостаток кислорода из-за неидеального перемешивания и необходимость постоянной обработки культуральной среды, включающей уда­ление клеток и использование больших количеств растворите­лей для осаждения. В связи с низкой концентрацией продукта (часто ниже 5%, вес/объем) требуются большие ферментеры (50—200 м³). Для оценки реологических характеристик куль­туральных сред проводят исследования на опытных установках.. Полученные данные используют для изменения конструкции ферментеров и мешалок с целью увеличения их эффективности при работе с псевдопластичными культуральными средами.

Проблемы последующей обработки конечного продукта при синтезе полисахаридов связаны прежде всего с удалением ми­кроорганизмов, что крайне важно, если этот продукт приме­няется в пищевой промышленности. Для разрушения бактерий используют литические и протеолитические ферменты, что в свою очередь приводит к дальнейшему загрязнению среды, поскольку при этом добавляется потенциальный субстрат для роста микробов. При удалении бактериальных остатков фильт­рованием применяют обработку полимера протеолитическими ферментами при щелочном pH с последующим добавлением' кремниевого адсорбента. Во избежание деградации полимера при щелочном pH можно при необходимости подкислять среду. Для осветления растворов полисахаридов их пропускают через иммобилизованные эндоглюканазы, что приводит к незначи­тельному уменьшению вязкости вследствие гидролиза глико­зидных связей.

В настоящее время осуществляется промышленное произ­водство ряда микробных полисахаридов [декстран, ксантан, геллановая смола, занфло (Zanflo) и политран (Polytran)]. Получение многих других находится на стадии разработки. В следующем разделе описаны основные свойства полисахари­дов микробного происхождения и перспективы их применения.

• 5.4.4. Микробные полисахариды: свойства, применение и коммерческая ценность

Ксантан [келтрол (Keltrol), келзан (Kelzan), Родогель (Rhodogel)]

Ксантан синтезируется Xanthomonas Campestris при росте на глюкозе, сахарозе, крахмале, кукурузной декстрозе и барде. В качестве источников углерода могут использоваться промыш­ленные отходы, например сыворотка, образующаяся при выра­ботке творога. Этот полимер, имеющий аллюлозный остов, по­строен из повторяющихся пятичленных блоков, содержащих D-глюкозу, D-маннозу, D-глюкуроновую кислоту; к некоторым из них присоединены остатки уксусной и пировиноградной кис­лот. Мол. масса его варьирует от 2∙ IO⁶ до 15∙ IO⁶. Точная тре­тичная структура ксантана еще не определена, однако резуль­таты конформационного анализа позволяют предположить, что полимер имеет форму спирали. Остается выяснить, одиночная она или двойная. Ксантан был первым микробным полисаха­ридом, который начали производить в промышленном масшта­бе (1967 г.). Он нашел широкое применение в промышленности. Это вещество обладает высокой вязкостью при малых концен­трациях и низкой скоростью сдвига. Вязкость его остается постоянной в широком диапазоне pH, не зависит от темпера­туры и присутствия солей, например хлористого калия. В соче­тании с растительным полисахаридом из семян лжеакации вод­ные растворы ксантана образуют стабильные гели. Ксантан получают обычным способом в ферментере с использованием коммерческой D-глюкозы в качестве источника углерода. Пе­ред осаждением полимера метанолом или изопропанолом в при­сутствии хлористого калия клетки обычно не удаляют. Изуча­лась возможность непрерывного получения ксантана, но про­мышленное внедрение этого метода осуществлено не было.

Уникальные свойства ксантана предопределили его широкое применение в самых разных отраслях промышленности в каче­стве стабилизатора и средства для контроля за состоянием суспензий, гелеобразованием и вязкостью. Псевдопластические текучие свойства этого полимера в сочетании с устойчивостью ж нагреванию, кислотам, щелочам и присутствию катионов обеспечивают ему преимущества над другими смазками в со­ставе бентонитовых шламов, и ксантан широко используется при добыче нефти. Он применяется также для повышения вы­хода нефти, где в сочетании с поверхностно-активными веще­ствами и углеводородами служит в качестве агента, контроли­рующего вязкость жидкости, закачиваемой в нефтеносные пласты. Молекулы полимера, использующегося для повышения, выхода нефти, должны быть достаточно малого размера, что­бы они могли проникать в поры породы, образуя растворы с высокой вязкостью, которая не изменяется при высоких кон­центрациях солей, высоких температурах и давлении, а также под действием сдвиговых напряжений, создаваемых при работе насосов. Ксантан, очищенный от бактериальных остатков, об­ладает более низкой степенью удержания, чем широко ис­пользуемый полиакриламид. При добыче нефти применяются водные растворы сульфатированного полисахарида, так как они подвержены меньшему разжижению под действием сдвиго­вых напряжений. В комплексах с бурой ксантан применяют в качестве гелеобразующего агента при производстве взрывча­тых веществ.

В 1969 г. было разрешено использовать ксантан в пищевой промышленности для улучшения вкусовых свойств консерви­рованных и замороженных продуктов, приправ, соусов, быст­ро приготовляемых продуктов, заправок, кремов и фруктовых напитков. Благодаря синергическому взаимодействию между ксантаном и растительными галактоманнанами вместе с ка­медью из семян лжеакации он нашел применение в производст­ве кормов, например консервированного корма для домашних животных, где он конкурирует с агаром; в качестве суспенди­рующего агента он используется также в производстве кормов с низким содержанием твердых компонентов. Простые и слож­ные эфиры ксантана применяют в косметике и в текстильной промышленности.

Декстран

Декстран — это a-D-глюкан, синтезируемый самыми разными грамположительными и грамотрицательными бактериями, та­кими как Aerobacter spp., Streptococcus bovis и S. viridans, а также Leuconostoc mesenteroides. В промышленности этот полимер получают выращиванием последнего из перечисленных микроорганизмов на сахарозе. Большинство полисахаридов яв­ляются продуктами внутриклеточного синтеза, однако при об­разовании декстрана субстрат не проникает в клетку. Декстра­ны классифицируют в зависимости от относительного содержа­ния каждого из трех имеющихся типов связей (α-l→3,. <x-l→4 и α-l→6), а также по растворимости в воде. Высокомо­лекулярный полимер осаждают органическими растворителями, а затем разрушают ферментативным путем (используя экзо- и эндодекстраназы) с помощью гидролиза слабой кислотой либо нагреванием, до получения продукта с нужной молекуляр­ной массой. Степень такой деградации контролируется по изме­нению вязкости. В качестве альтернативы можно использовать низкомолекулярные полисахариды как затравку для получения декстранов с желаемой степенью полимеризации. Бактериаль­ные инокуляты часто неоднократно промывают солевым раст­вором для удаления примесей высокомолекулярных полиме­ров, которые в противном случае смогли бы послужить затрав­ками при полимеризации. Помимо природы акцептора глюко­зы, молекулярная масса декстрана определяется также кон­центрацией сахарозы и температурой реакции. При высокой концентрации сахарозы (70% по весу) образуется в основном однородный набор низкомолекулярных декстранов. При ис­пользовании низкомолекулярной декстрановой затравки (10 000—25 000) и небольших концентраций сахарозы (10% по весу, pH 5, 15 °C) значительная часть получаемого продукта (50%) имеет мол. массу в пределах 50 000—100 000; при этом отпадает необходимость в его дальнейшем фракционировании для применения в медицине.

Внеклеточный фермент, катализирующий синтез декстрана, декстрансахараза (а-1,6-глюкан : П-фруктозо-2-глюкозил- трансфераза, К.Ф.2.4.1.5), является индуцибельным у Leuconos- toc mesenteroid.es-, у Streptococcus mutans или S. sanquis он син­тезируется в течение логарифмической фазы роста. Этот фер­мент освобождает фруктозу и переносит глюкозные остатки на связанную с ферментом молекулу акцептора. Растущая цепь декстрана остается прочно связанной с ферментом. Исследова­ния иммобилизованной декстрансахаразы показали, что она образует продукты с узким спектром молекулярных масс, тогда как в растворимой системе синтезируются очень высокомолеку­лярные декстраны. Синтезирующие декстран организмы проду­цируют большие количества этого фермента в растворимой форме или в связанном с клеткой состоянии. Производство дек­странов микробной природы остается, однако, ограниченным, несмотря на успехи в разработке бесклеточных систем.

Прежде всего декстраны используют в качестве замените­лей плазмы (для увеличения объема крови); кроме того, они применяются в медицине для создания гидрофильного слоя на •обожженных поверхностях в целях поглощения жидких экссу­датов. Для разделения и очистки биологических молекул на­ходят широкое применение производные декстранов с попереч­ными сшивками, в которых функциональные группы (например,

карбоксиметильные или диаминогруппы) соединены с глюкоз­ными остатками эфирными связями. Сульфатированные декст­раны используют в качестве полиэлектролитов.

Микробный альгинат

Источником альгинатов издавна служили морские водоросли (например, Laminaria spp.), однако по природе своей этот ис­точник непостоянен. Среди бактерий близкие к альгинату гете­рополисахариды образуют из D-маннуроновой и L-глюкуроно- вой кислот Pseudomonas aeruginosa и Azotobacter Vinelandii. Этот процесс осуществляют в промышленном масштабе, выра­щивая Azotobacter в условиях избытка углерода. Микробный альгинат отличается от соответствующего продукта из водорос­лей наличием О-ацетильных групп, связанных с остатками D- маннуроновой кислоты. Тип получаемого альгината можно из­менять, варьируя различные параметры. Например, при низком содержании фосфата образуется в основном высокомолекуляр­ный полимер с хорошим выходом, а при разной концентрации ионов кальция можно получать разное соотношение между маннуроновой и галактуроновой кислотами; это соотношение в свою очередь влияет на эпимеризацию одной кислоты в дру­гую. Было изучено также образование микробного альгината в непрерывной культуре, где его выход при выращивании на сахарозе увеличивается до 50% по сравнению с 25% в фермен­тере. При высокой интенсивности дыхания могут происходить большие потери углеродного субстрата вследствие его превра­щения в углекислый газ. Максимальная скорость синтеза поли­сахарида в непрерывной культуре была достигнута при недо­статке в среде молибдена. При ограниченном содержании фос­фора и низкой плотности клеток в культурах Azotobacter vine- Iandii происходит дополнительная потеря углерода из-за синтеза поли-Р-гидроксибутирата.

В настоящее время альгинаты из растительных источников используются в основном в пищевой промышленности в каче­стве загустителей или гелеобразующих агентов. Их применяют для стабилизации йогурта, для предотвращения образования кристаллов льда при получении мороженого; подобно производ­ным пропиленгликоля, их добавляют в содержащие кислоту продукты, например в приправы для салатов, поскольку эти соединения образуют гели только при pH ниже 3. Альгинатные полисахариды превращаются в гель в присутствии поливалент­ных катионов (Ca+², Sr+²) и поэтому применяются для мягкой иммобилизации микроорганизмов. В других условиях подобное гелеобразование может быть нежелательным и его пытаются предотвратить, получая соответствующие производные поли­мера.

Геллановая камедь

Геллан— полисахарид, состоящий из остатков глюкозы, рамно­зы, глюкуроновой кислоты и содержащий О-ацетильные группы (3—4,5%), — получают методом аэробной ферментации при участии Pseudomonas elodea ATCC 31461 на каком-либо угле­водном источнике углерода. Этот продукт существует в трех формах: нативной, низкоацетильной и низкоацетильной/освет- ленной. Низкоацетильная форма, легко получаемая из натив­ной нагреванием при pH 10, образует при нагревании и охлаж­дении твердые хрупкие гели. Прочность геля зависит от кон­центрации камеди и солей, а также от природы присутствующих катионов. Наиболее прочный гель образуется при более низких концентрациях двухвалентных катионов (Ca²+, Mg²+) по срав­нению с одновалентными. Хотя этот полимер еще не был ре­комендован для применения в пищевой промышленности, воз­можно, в будущем он заменит каррагенан и агар. Его уже ис­пользуют в микробиологии в качестве компонента различных сред, где он известен под коммерческим названием гелрит (Gelrite). Здесь его преимуществами перед агаром являются более высокая прозрачность, та же прочность геля при вдвое меньшей концентрации полимера, меньшая токсичность и вы­сокая устойчивость к действию ферментов.

3анфло (Zanflo)

Полисахарид занфло, получаемый из Erwinia Iahitica, облада­ет сходными с ксантаном свойствами; единственное отличие со­стоит в том, что его вязкость претерпевает обратимые термиче­ские изменения (при температуре выше 60 ⁰C). Этот полисаха­рид, растворы которого обладают высокой вязкостью, состоит из остатков фукозы, галактозы, глюкозы и уроновой кислоты и содержит некоторое количество этерифицированных О-ацетильных групп. В качестве источника углеводов при его выра­ботке применяют лактозу, гидролизованный крахмал или их смеси. Этот полимер был создан специально для разметки до­рожных покрытий, поскольку он устойчив к замораживанию — оттаиванию и действию ферментов, а также обладает хорошей текучестью и наносится ровным слоем на поверхность. Благо­даря этим качествам он может найти применение в лакокра­сочной промышленности. Erwinia tahitica синтезирует также целлюлазу; это налагает ограничения на использование занф­ло при производстве красок, содержащих целлюлозные загус­тители.

Политран (склероглюкан)

Политран представляет собой линейный р-1,3-глюкан, выделяе­мый грибом Sclerotium glucanicum и близкими к нему видами при выращивании в глубинной культуре на среде с кукурузным экстрактом. К каждому третьему остатку в цепи связью β-l→-6 присоединена одна D-глюкопиранозильная группа. Политран обладает псевдопластическими свойствами в широком диапазо­не pH и температуры и нечувствителен к различным солям. JEro применяют для стабилизации бентонитовых шламов при бурении и для повышения нефтедобычи; он используется также в керамических глазурях, латексных и типографских красках и при дражировании семян. Этот нейтральный полисахарид разрушается экзоглюканазами до глюкозы и гентобиозы.

В настоящее время намечается возможность промышленного получения и многих других микробных полисахаридов. За по­следние пять лет в выделении и производстве различных поли­меров наблюдается быстрый прогресс.

Микробные полисахариды, синтезируемые Alcaligenes spp.

Компанией Kelco в США за последнее время доведено до про­мышленных масштабов получение нескольких полисахаридов при участии различных видов Alcaligenes.

В глубинных культурах образуется с большим выходом по­лимер S130 неизвестной структуры. Он обладает высокой вяз­костью при низкой концентрации, прекрасной растворимостью, большой вязкостью в морской воде и в солевых растворах и не утрачивает этих свойств при высоких температурах (~ 149 ⁰C). Большинство растворов полисахаридов теряют свою вязкость при температурах свыше 93 ⁰C, а вязкость растворов полимера S130 при 149 ⁰C остается такой же, как при комнатной темпе­ратуре. Кроме того, при таких высоких температурах он не разрушается в течение длительного времени, особенно в при­сутствии малых количеств кислорода. Будучи очень вязкими при низких скоростях сдвига, его растворы при высоких скоро­стях сдвига становятся жидкими почти как вода. Благодаря таким свойствам данный полимер может найти широкое при­менение в нефтяной промышленности в качестве хорошего су­спендирующего агента и вяжущего компонента буровых раство­ров с низким содержанием твердых частиц.

Сходными с S130 свойствами обладает полимер S194, кото­рый, кроме того, нечувствителен к сдвиговым напряжениям. В сочетании с высокой устойчивостью к солям эти качества обусловливают его применение в роли суспендирующего агента в суспензиях пестицидов (концентрированные суспензии нерастворимого в воде материала), а также в суспензиях удобре­ний, используемых в сельском хозяйстве.

Полисахарид S198 содержит О-ацетильные и О-сукцинильные остатки; его получают при аэробной ферментации с ис­пользованием глюкозы в качестве источника углерода. Его ра­створы тоже обладают высокой вязкостью при низкой концен­трации и достаточно стабильны в широком интервале pH и температур. Кроме того, благодаря устойчивости к сдвиговым напряжениям он является прекрасным суспендирующим аген­том. S198 остается стабильным в среде, загрязненной тяжелы­ми металлами. Все это позволяет думать, что водорастворимые смеси на основе этого полисахарида могут быть использованы вместо смазочных материалов для гидравлических систем, из­готавливаемых на основе нефти.

Курдлан

Курдлан — это а-1,3-глюкан, синтезируемый Alcaligenes faeca- lis, var. myxogenes, штамм 10СЗ. При нагревании до темпера­туры выше 54 ⁰C происходит необратимое гелеобразование это­го полимера; прочность геля зависит от температуры: она по­стоянна в интервале 60—80 ⁰C и возрастает в интервале 80— IOO⁰C. При температуре выше 120⁰C молекулярная структура этого полисахарида изменяется: одиночная спираль переходит в тройную. Курдлан нерастворим в холодной воде, и его гели можно получать также путем диализа щелочных растворов против воды. Этот полисахарид может найти применение в ка­честве гелеобразователя в кулинарии, он может использоваться как молекулярное сито, как подложка при иммобилизации фер­ментов и как связующий агент.

Пуллулан

Пуллулан представляет собой a-D-глюкановый полисахарид, состоящий из а-1-»-6-мальтотриозных и небольшого числа маль- тотетраозных единиц. Он синтезируется Aureobacidium pullulans и образует прочные, упругие пленки и волокна, которые можно формовать. По сравнению с целлофаном и полипропиленом эти пленки мало проницаемы для кислорода. Пуллулан, возможно, найдет применение в качестве упаковочного материала или флюккулирующего агента в суспензиях глин в горной промыш­ленности. Он устойчив к амилазам, но разрушается ферментом пуллуланазой.

Было описано также образование полисахаридов видами Arthrobacter, Beijerinckia и бактериями, использующими метан и метанол.

• 5.4.5. Биосинтез полисахаридов

Хотя у некоторых бактерий синтез полисахаридов (например, декстранов) осуществляется вне клетки, в большинстве случа­ев полисахариды синтезируются внутри нее, а для этого необ­ходимо, чтобы соответствующий субстрат проник через клеточ­ную мембрану. Почти во всех работах, касающихся биосинтеза полисахаридов, изучались организмы, имеющие небольшое про­мышленное значение или не имеющие его вовсе. Эти результа­ты можно, видимо, экстраполировать и на промышленные организмы.

Поглощение субстрата осуществляется путем облегченной диффузии, активного транспорта (при этом субстрат проникает в клетку в неизмененном состоянии) или групповой транслока­ции (при этом субстрат подвергается фосфорилированию). Скорость синтеза полисахарида, по-видимому, зависит от ско­рости поступления субстрата, которая, таким образом, может быть первым из факторов, лимитирующих синтез полисахари­да. В то же время скорость конверсии углерода обычно очень высока, поэтому она, видимо, не может быть фактором, лими­тирующим синтез. Специфические потребности в углероде для образования полисахарида иногда связаны со специфическими механизмами поглощения субстрата.

Субстрат, поступающий в клетку, подвергается превраще­ниям в ходе анаболических или катаболических процессов; пер­вые включают его превращение в полисахариды, липополиса­хариды или гликоген. Гликоген редко синтезируется в проли­ферирующих бактериях, но он является возможным источником утечки углерода в условиях, неблагоприятных для роста мик­роорганизма. Примером такого рода может служить двуста­дийный процесс, при котором вслед за стадией роста микробов наблюдается синтез полисахарида. Контроль за синтезом гли­когена осуществляется путем аллостерической регуляции обра­зования ADP-глюкозы без участия изопреноидных липидов. Синтез экзополисахаридов зависит от наличия нуклеотидди­фосфатмоносахаридов, например UDP-глюкозы. Ключевую роль в этом процессе играет UDP-глюкозо — пирофосфорилаза, ка­тализирующая образование предшественников для синтеза по­лимеров клеточной стенки, например тейхоевых кислот и липополисахаридов, а также экзополисахаридов. Направление предшественников на синтез того или иного полимера осуще­ствляется путем строгой регуляции активности таких активи­рующих ферментов. Одни нуклеотиддифосфатмоносахара (UDP-галактуроновая и GDP-маннуроновая кислоты) являются предшественниками в синтезе только экзополисахаридов, дру­гие служат также активированными предшественниками при образовании моносахаридов (например, UDP-глюкоза являет­ся предшественником D-галактозы и D-глюкуроновой кисло­ты). Чтобы какой-либо моносахарид включился в полисахарид, организм должен синтезировать активированный нуклеотидный предшественник. Единственным исключением является L-гулуроновая кислота, присутствующая в бактериальном альгинате. Она образуется из GDP-маннозы и GDP-маннуроновой кисло­ты, но сама по себе не активирована. Альгинат синтезируется с использованием активированных маннуронозильных остатков, которые затем подвергаются действию эпимеразы in situ. Сте­пень специфичности этой эпимеразы точно не известна, но она действует только на неацилированные остатки. L-гулуроновая кислота была найдена также в некоторых полисахаридах, не содержащих остатков маннуроновой кислоты. Отметим, что в полисахаридах были обнаружены моносахариды (например, амино- и метилуроновые кислоты, а также метилгексозы), для которых вообще не идентифицировано соответствующее активи­рованное углеводное производное.

Дальнейший контроль за пулом активированных моносаха­ридов может осуществляться с помощью гидролаз UDP-caxa- ров, хотя эти ферменты и являются периплазматическими. Кро­ме того, некоторые ферменты, участвующие в синтезе нуклео- тиддифосфатуглеводов, связаны с мембраной и неизвестно, могут ли продукты этих реакций находиться в свободном со­стоянии в цитоплазме.

Затем углеводные остатки последовательно переходят от нуклеотида на липидный переносчик, которым обычно служит изопреноидный алкогольфосфат (Cso—Cso), активированный при переносе сахарофосфата. Так образуются олигосахаридные блоки (от тетра- до октасахаридов), из которых путем после­довательного их присоединения к редуцирующему концу цепи и образуется полисахарид. Точный механизм удлинения цепи и высвобождения полимера неизвестен. Однако участие изо­преноидных липидов не является обязательным: например, они не обнаружены у Azotobacter, синтезирующего альгинат. В тех организмах, где эти липиды присутствуют, контроль за синтезом экзополисахаридов может осуществляться за счет из­менения доступности таких липидных переносчиков, которая в свою очередь может регулироваться изменением соотношения между свободным спиртом и фосфатом. Регуляция путем де­фосфорилирования требует наличия ATP-зависимой киназы для реактивации свободного спирта. Css-изопреноид-алкоголь-киназа ингибируется антибиотиком моеномицином. По-видимому, большинство клеток обладает достаточным количеством изопре­ноидных липидов для одновременного осуществления всех не­обходимых реакций синтеза, но если их не хватает, то полиса­хариды будут синтезироваться только в позднюю логарифмиче­скую фазу или при низкой температуре. Антибиотик бацитра­цин эффективно связывается с изопреноидными липидами, так что они не могут участвовать в биосинтезе. У мутантов с повы­шенной резистентностью к этому антибиотику часто наблюда­ется более интенсивный синтез полисахаридов. Отмечено, что у мутантов, неспособных синтезировать пептидогликаны, обра­зуется больше липидов, нужных для синтеза экзополисахаридов. По-видимому, потребность в изопреноидных липидах при биосинтезе полисахаридов можно представить в виде следую­щего ряда: пептидогликан>липополисахарид>экзополисахарид.

В синтезе экзополисахаридов могут участвовать различные типы липидных переносчиков, а для синтеза гетерополисахари­дов иногда требуется не один вид переносчиков. Модификации полимера, например О-ацетилирование или присоединение пи- руваткеталей, возможны до тех пор, пока он еще связан с ли­пидным переносчиком. Ацетилирование не является обязатель­ным этапом; его отсутствие может быть связано с тем, что в системе нет соответствующих ацетилаз либо достаточного ко­личества предшественника, предположительно ацетил-СоА. При синтезе бактериального альгината ацетильные остатки, связанные в его молекулах с остатками D-маннуроновой кис­лоты, должны вводиться до эпимеризации; было высказано предположение, что эти ацетильные группы способны предот­вращать эпимеризацию. Соотношение пируват/ацетат в ксанта- новых камедях сильно различается, и процесс модификации по­лимера должен включать механизм, обеспечивающий эти раз­личия. Неизвестно, является ли присоединение пирувата одно- или многоступенчатым процессом; неизвестно также, за­висит ли этот процесс от внутриклеточной концентрации фосфоенолпирувата. Полимер ксантан может к тому же состоять из содержащих и не содержащих остатки пирувата цепей в раз­личных соотношениях.

Механизм высвобождения полимера из комплекса с липид­ным переносчиком до сих пор подробно не изучен. Видимо, ка­кую-то роль здесь играет лигазная реакция, в ходе которой полимер освобождается и связывается с клеточной поверх­ностью. Обычно после экскреции полисахариды остаются свя­занными с клеточной стенкой; местом присоединения может служить какой-либо наружный мембранный белок. Очевидно, существует определенное число мест связывания, после насы­щения которых избыток полисахарида выделяется уже в виде слизи. Возможно также, что места связывания «приспособле­ны» к полимеру определенного размера. По-видимому, слизи­стые мутанты образующих капсулы бактерий либо не имеют фермента киназы, либо лишены самих мест связывания. Точ-, иая локализация мест связывания неизвестна, однако процесс экскреции должен включать перемещение полимера от места его синтеза — цитоплазматической мембраны — к месту его конечной внеклеточной локализации; для этого гидрофильная молекула должна пройти сквозь гидрофобную мембрану. Вы­сказывалось предположение, что у грамотрицательных организ­мов местом выхода полисахаридов могут быть участки адгезии (сайты Байера), где внутренняя и наружная мембраны соеди­няются друг с другом. Однако ни механизм этого явления, ни способы его регуляции до сих пор не известны.

• 5.4.6. Подходы к усовершенствованию производства микробных полисахаридов

Использование микроорганизмов для получения промышленно ценных полисахаридов можно сделать более эффективным с помощью следующих усовершенствований: 1) увеличения ско­рости образования полисахаридов и повышения их выхода; 2) модификации получаемых полисахаридов; 3) изменения по­верхностных свойств микроорганизмов-продуцентов для об­легчения отделения клеток на последующих этапах переработ­ки; 4) устранения ферментативных активностей, способных вы­звать нежелательные модификации полисахаридов; 5) переноса генетических детерминант синтеза полисахаридов в технологи­чески более удобные организмы-продуценты.

Скорость или степень превращения углеводного субстрата в полимерный продукт можно увеличить путем повышения удельной активности участвующих в синтезе ферментов, изме­нения механизмов регуляции синтетического процесса или уве­личения доступности предшественников полисахарида. Число ферментативных стадий биосинтетического процесса зависит от сложности данного полимера, и любая попытка увеличить вы­ход полимера должна быть основана на ясном представлении о данном биосинтетическом пути и механизмах его метаболиче­ского контроля. В настоящее время выход увеличивают путем отбора случайных мутантов. Скорость потребления субстрата можно повысить путем дупликации генов, продукты которых участвуют в формировании механизмов поглощения, но такой способ не обязателен, если у данного организма имеется не­сколько путей транспорта для каждого субстрата.

Для модификации полисахарида в целях улучшения того или иного его свойства также необходимо располагать некото­рыми сведениями об особенностях данного пути синтеза. Ксантан в водных растворах образует микрогели за счет взаимо­действия пируваткеталей полимера с катионами. Эти группы можно удалить путем обработки полимера щавелевой или трифторуксусной кислотой. Существуют также мутанты, обра­зующие ксантаны, лишенные остатков пирувата или ацетиль­ных групп, а в остальном имеющие неизмененную углеводную структуру и более низкую вязкость. Однако отбор таких му­тантов затруднен тем, что модифицированные продукты часто неотличимы от исходных полисахаридов, хотя колонии и могут различаться по внешнему виду и иметь тенденцию к прикреп­лению к поверхности культуральной среды. Другие способы решения данной проблемы предусматривают выращивание бактерий дикого типа в присутствии ингибиторов ацилирования или при недостатке калия либо магния. Можно также выде­лить мутанты, образующие полисахариды с большей молеку­лярной массой и, следовательно, с большей вязкостью, но в ос­тальном не отличающиеся от обычных по химическому составу. Длина полимерных цепей иногда зависит от условий роста. Например, в непрерывных культурах Xanthomonas juglandis при малом разведении образуются более длинные неразветв- ленные молекулы.

Процесс выделения полисахаридов можно облегчить путем изменения поверхностных свойств микроорганизма-продуцента (например, за счет удаления поверхностного полимерного ма­териала типа липополисахаридов). В подобных мутантных культурах происходит аутоагглютинация и спонтанная флоку­ляция, что уменьшает число необходимых операций центрифу­гирования. Однако нужно внимательно следить за тем, чтобы У таких мутантов клеточный материал, например белки, не  «утекал» из периплазматического пространства или не проис­ходил лизис с загрязнением конечного продукта. К другим из­менениям относятся мутации капсулообразующих организмов, приводящие к появлению стабильных, образующих слизи бак­терий, а также получение устойчивых к фагам мутантов, что уменьшает риск заражения фагом в процессе производства.

Некоторые микроорганизмы образуют экзополисахариды, впоследствии разрушаемые гидролитическими ферментами. На­пример, Azotobacter Vinelandii синтезирует альгинат и альгиназу (альгинат — лиазу). Продуценты ксантана часто выделяют активную целлюлазу, которая способна вызвать деградацию при последующем добавлении ксантана к продуктам, содержа­щим целлюлозу. Устранить такую нежелательную фермента­тивную активность можно либо путем умелого подбора условий культивирования, либо за счет использования мутантов, неспо­собных к образованию подобных гидролитических ферментов.

Штаммы, продуцирующие полисахариды, синтезируют так­же другие полимерные продукты, например другие полисахари­ды, поли-р-гидроксибутират или гликоген. При этом из нужного биосинтетического процесса может изыматься значительное ко­личество углерода. Следует заняться поисками мутантов, ли­шенных подобного рода альтернативных синтетических путей. Образование гликогена у прокариот отличается от других пу­тей синтеза полисахаридов, и получение мутантов, дефектных по ключевым ферментам этого пути (ADP-глюкозопирофосфо- рилазе и гликоген-синтетазе), является эффективным решением данной проблемы. Однако для реализации этого подхода необ­ходимо иметь представление о регуляторных механизмах обоих путей. Некоторые виды продуцентов курдлана синтезируют также значительные количества сукциноглюкана. Были полу­чены мутанты Alcaligenes spp., Agrobacterium radiobacter и Rhizobium trifolii, не обладающие этой активностью. Выделены четыре типа мутантов: продуценты сукциноглюкана, продуцен­ты курдлана, продуценты обоих полимеров и мутанты, не син­тезирующие курдлан и образующие небольшие количества сук­циноглюкана. Сукциноглюкан является гетерополисахаридом глюкозы и галактозы. Оба полимера содержат ацетильные группы и остатки пировиноградной кислоты. Механизм этих изменений в синтезе полимеров неизвестен.

В некоторых случаях предпочтительным является перенос генетических детерминант синтеза полисахаридов. Например, перенос детерминант синтеза альгината из штамма Pseudomo­nas aeruginosa, выделенного исходно от больного цистофибро- зом, в непатогенные виды Pseudomonas создает предпосылки для промышленного использования этого процесса. Положение генов, ответственных за синтез альгината, уже установлено. Представляет интерес и перенос генов, детерминирующих син­тез ксантана, в хозяина, непатогенного для растений. Детерми­нанты синтеза полисахаридов можно ввести и в более быстро­растущие бактериальные штаммы. Выявлена также возмож­ность превращения штаммов, не способных к синтезу экзополисахаридов, в штаммы — продуценты этих полимеров при помощи отбора на резистентность к карбенициллину. Эта методика с успехом применялась в опытах с некоторыми вида­ми Pseudomonas с целью получения mwc-мутантов, синтезиру­ющих полисахариды. По всей вероятности, в подобных случаях у организмов дикого типа синтез альгината был супрессирован, а мутация по соответствующим генам создала условия для экспрессии.

• 5.4.7. Поли-р-гидроксибутират

Поли-р-гидроксибутират (ПГБ) — это термопластичный по­лиэфир, состоящий из повторяющихся блоков —CH (CH₃)—CH₂—СО—О— и, как было установлено более 50 лет назад, являющийся резервным энергозапасающим со­единением. Он накапливается самыми разнообразными микро­организмами (например, видами Alcaligenes, Azotobacter, Ba­cillus, Nocardia, Pseudomonas и Rhizobium). В некоторых ус­ловиях отдельные виды, в частности Alcaligenes eutrophus и Azo- tobacter beijerinckii, способны аккумулировать этот полимерный материал в таком количестве, что он составляет до 70% их су­хой массы. Накоплению ПГБ внутри клеток при росте на уг­леводах или на других источниках углерода, например на ме­таноле, способствует недостаток фосфора или азота. Поэтому образование данного полимера может быть одностадийным процессом, при котором лимитирующим фактором является с самого начала роста определенное питательное вещество. Процесс может быть и двухстадийным, когда микроорганизмы сначала растят в среде, содержащей достаточное количество питательных веществ, для накопления биомассы, а затем пере­водят в условия, где лимитирующим рост фактором служит какой-либо компонент среды, кроме углерода, что вызывает значительное повышение уровня внутриклеточного ПГБ. К на­коплению ПГБ способны многие виды, но выход продукта и молекулярная масса синтезируемого полимера у них обычно недостаточны для использования этих организмов в промыш­ленном производстве данного полимера. Необходимо, чтобы содержание ПГБ в биомассе составляло не менее 30—40% (по весу), а мол. масса полимера была порядка 200 000—300 000. Поскольку ПГБ образуется в виде внутриклеточных гранул, его экстрагируют из микроорганизмов после разрушения кле­ток. Предпочтительным методом его очистки служит экстрак­ция растворителями типа галогенированных углеводородов, на­пример 1,2-дихлорэтаном. Альтернативный подход к получе­нию полимера в пригодном к использованию виде состоит в прессовании в формах или экструзии высушенных клеток са­мого микроорганизма с содержанием ПГБ по весу не менее 50%. Для получения композиции, пригодной к созданию пред­метов определенной формы, клетки разрушают и при необхо­димости смешивают с нужным количеством экстрагированного полимера. Один из технологических подходов к изменению по­лимерных свойств ПГБ предусматривает изменение состава го­мополимера in situ. Всегда считалось, что этот резервный энер­гетический материал является простым полиэфиром мономера Р-гидроксибутирата. Однако сейчас установлено, что во многих случаях он представляет собой более сложный гетерополимер разных жирных p-гидроксикислот. Следовательно, состав этого полимера можно менять в процессе роста микроорганизма, на­пример добавлением пропионовой кислоты к культуральной среде: таким способом в образующийся сополимер вводятся остатки р-гидроксивалерата. Это в свою очередь изменяет рео­логические свойства полимера.

Появление на рынке синтезируемых микробами гетерополи­меров ПГБ вряд ли окажет существенное влияние на процве­тающую индустрию пластмасс; однако полезные свойства этого полимера, особенно его подверженность биодеградации, могут способствовать его применению в ряде областей.

• 5.4.8. Другие полимеры, образуемые микроорганизмами

Все описанные до сих пор биополимеры полностью синтезиру­ются определенными микроорганизмами в процессе роста на том или ином источнике углерода. Существуют и иные способы получения новых полимерных материалов, предусматривающие использование микроорганизма лишь на отдельных этапах син­теза. При этом микроорганизм служит только микробиологиче­ским катализатором для проведения химического превращения, которое в иных условиях затруднено. В гл. 4 уже упоминалось о реакциях гидроксилирования с участием микробов для полу­чения фенолов и дигидродиолов в целях последующей химиче­ской полимеризации. Речь идет о биотехнологическом процес­се, предложенном для получения нового полимера, полифени­лена, который представляет интерес для специалистов по материаловедению благодаря своей термостабильности и высо­кой электропроводности. Этот полимер можно синтезировать из бензола и кислорода, используя генетический вариант Pseu­domonas putida для осуществления начального превращения бензола в дигидродиол. Этот дважды окисленный продукт вы­деляется клетками в окружающую среду; его экстрагируют растворителями, а затем получают производные, необходимые для химического синтеза полифенилена. Существуют и иные возможности использования подобной технологии для получе­ния полимеров нафталина и бифенила.