7.2.1.  Мутагенез и отбор

В прошлом для увеличения продуктивности штаммов обычно использовали мутагенез и отбор: именно таким путем удалось повысить выход антибиотиков, синтезируемых грибами и акти- номицетами. Рис. 7.1 иллюстрирует применение этих методов для повышения выхода пенициллина. Было последовательно отобрано свыше двадцати штаммов, продуцирующих все боль­ше пенициллина, и в конечном счете продуктивность увеличи­лась в 55 раз. Как в этом случае, так и во многих других пря­мого отбора не происходило, поскольку не удавалось создать условия, при которых росли бы только искомые штаммы. Вме­сто этого пришлось применять метод скрининга: клетки, выжив­шие после воздействия больших доз мутагенов, размножали в колбах на качалках, после чего в фильтратах культуральной среды определяли количество антибиотика.

Скрининг требует много времени и напряженного труда. Ча­сто штаммы, для которых был получен большой выход при выращивании в колбах, оказывались непродуктивными в усло­виях роста в ферментере большого объема. Нередко успеху способствовало знание «секретов мастерства»: так, оказывает­ся, что большая продуктивность обычно свойственна особым: морфологическим вариантам.

Скрининг с использованием чашек с агаром вместо колб на качалках позволяет обследовать гораздо больше мутантов. Об­разование антибиотиков или метаболитов нередко оценивается методом биопроб, когда в агар вводят индикаторные организ­мы. Разработаны устройства для автоматического скрининга чашек. В них используются механические приспособления для инокуляции и производится периодическое фотографирование и последующий компьютерный анализ изображений.

Можно создать особые условия, при которых мутанты с нужными свойствами не растут. В этом случае применяется так называемый метод обогащения, когда активно растущие клетки дикого типа погибают, а нерастущие мутантные выжи­вают. Так, например, пенициллин или нистатин вызывает ги­бель растущих клеток бактерий или грибов соответственно. При работе с грибами недостаток в среде инозитола приводит к автолизу растущих, но не покоящихся клеток.

Наиболее подходящим способом является, конечно, прямой отбор, когда создаются условия для роста только мутантных клеток. Этот подход применялся для выделения штаммов — еверхпродуцентов некоторых метаболитов, например аминокис­лот или цитрата. Обработанную мутагеном культуру выращивают в присутствии ингибитора (например, аналога аминокис­лоты), в результате чего отбираются мутанты, преодолевающие нарушение обмена за счет образования избытка желаемого со­единения.

Рис. 7.1. А. Последовательный отбор штаммов, образующих все большее коли­чество пенициллина, с помощью генетических методов (Impacts of Applied Genetics, Office of Technology Assessment, US Government Printing Office, Wa­shington DC, USA). Б. Иллюстрация тех изменений, которые произошли в про­изводстве пенициллина. Показано, как росла конечная концентрация пеницил­лина в культуральной среде при его промышленном производстве в период с 1940 по 1975 г.

Отбор на чашках с агаром основан на том, что часть орга­низмов отвечает на воздействие по принципу «все или ничего». Колонии мутантов растут, а диких клеток — нет. Однако при получении промышленных штаммов, особенно предназначенных для использования в длительных процессах ферментации, не­редко стремятся получить для конкретных условий относитель­но небольшие различия в скорости роста. В этом случае отбор происходит при непрерывном культивировании. В хемостатах при длительном выращивании культура все время находится в экспоненциальной фазе роста, и это позволяет выделять да­же те мутанты, у которых сродство к субстрату, удельная ско­рость роста или устойчивость к токсическому действию высо­ких концентраций субстрата или продукта лишь немного пре­вышает исходный уровень.

• 7.2.2. Гибридизация путем скрещивания

Наиболее простой путь создания организмов с желаемым комп­лексом генетически обусловленных признаков — это скрещива­ние штаммов, принадлежащих к противоположным половым типам. Как про-, так и эукариотические микроорганизмы скре­щиваются при контакте клеток, и этот процесс используется для получения рекомбинантов.

Конъюгация у бактерий

У бактерий половой процесс называют конъюгацией. Контакт между двумя клетками осуществляется за счет образования длинного конъюгационного мостика, который служит для пере­носа ДНК из одной клетки в другую. Способность к формиро­ванию мостика закодирована во многих плазмидах (см. далее); по нему они переносят свои гены, а в некоторых случаях и гены клетки-хозяина в клетку-реципиент. Плазмиды, осуществляю­щие перенос генов клетки-хозяина, обладают, таким образом, способностью к мобилизации хромосом. У Escherichia coli та­кие F-плазмиды выступают в роли фактора пола. Они способ­ны мобилизовать хромосому не только Е. coli, но и родствен­ных энтеробактерий (Shigella, Klebsiella, Salmonella, Erwinia) и поэтому могут использоваться для переноса генов между бактериями разных родов. Некоторые плазмиды, выделенные из Pseudomonas aeruginosa, еще более «неразборчивы». Так, плазмида R68.45 может переносить хромосомные гены между видами Pseudomonas, в том числе и Pseudomonas putida, но кроме этого, обладает способностью к мобилизации хромосом и таких родов, как Rhizobium, Rhodopseudomonas, Azospiril­lum, Agrobacterium и Escherichia.

К числу наиболее широко используемых в промышленности микроорганизмов относятся разнообразные виды Streptomy- ces: с их помощью получают более 60% разновидностей при­меняющихся сегодня антибиотиков. У этих организмов хорошо развиты системы скрещивания, которые обнаружены и у их близких родственников, видов Nocardia (они синтезируют ан­тибиотики рифамицины). Способность к конъюгации была от­крыта при изучении Streptomyces coelicolor (этот вид примене­ния в промышленности не нашел и используется в лабораториях). В клетках этого организма было найдено два типа плазмид, SCPl и SCP2, несущих фактор пола. SCP2 продуцирует ре­комбинантные формы с очень высокой частотой. SCPl по сво­им свойствам близка к F-плазмиде Е. coli. Она может встраи­ваться в хромосому Streptomyces, а также включать фрагмен­ты хромосомной ДНК. Это довольно крупная плазмида (M_r = 18∙ IO⁶), несущая все шестнадцать генов, нужных для обра­зования антибиотика метиленомицина.

Многие используемые в промышленности виды Streptomy- ces, видимо, не обладают собственной системой скрещивания, но у Streptomyces rimosus, продуцента окситетрациклина, най­дена плазмида SRPl, которая несет активный фактор пола, и при скрещивании SRP1+×SRP1^- рекомбинантные формы обра­зуются с частотой IO^-4—IO^-3.

У других грамотрицательных бактерий (помимо Streptomy- ces) конъюгационные плазмиды встречаются относительно ред­ко. Отметим, что недавно система скрещивания была обнару­жена у бактерий такого важного в промышленном отношении рода, как Bacillus. Существенно, что эти бактерии способны легко акцептировать «голую» ДНК, и поэтому рекомбинант­ные формы несложно получить путем трансформации. Такая возможность была использована при создании штаммов Bacil­lus, у которых около 50% синтезируемого ими белка составля­ет гидролизующий крахмал фермент а-амилаза. При этом бы­ли отобраны несколько мутантов по разным генам с повышен­ной способностью к образованию фермента. Эти разные мута­ции были затем сведены воедино у одного штамма путем по­следовательной трансформации хромосомной ДНК и отбора на повышенную способность гидролизовать крахмал.

Системы скрещивания у грибов

У грибов существуют разнообразные типы скрещивания, кото­рые используются в генетических исследованиях. Многие гри- бы-аскомицеты и базидиомицеты обладают сложноорганизован­ными системами скрещивания, препятствующими самооплодо­творению и другими формами инбридинга. Половой процесс контролируется системой несовместимости. У некоторых грибов система несовместимости биполярна; при этом процесс скрещи­вания контролируется всего одним локусом, который существу­ет в двух альтернативных аллельных формах. Это дает два ти­па спаривания, например а и а у Saccharomyces cereυisiae, причем разрешена лишь комбинация а/а. У других грибов (на­пример, Schizophyllum commune) система несовместимости тетраполярна. У них тип спаривания определяется двумя гена­ми, каждый из которых имеет множество аллельных форм. Для успешного скрещивания два партнера должны обладать разны­ми аллелями каждого из двух локусов типа спаривания (на­пример, AxBy×AyBx — это полностью совместимое спарива­ние, а комбинации AxByXAxBx или же AxByXAyBy и AxBy× XAxBy невозможны, так как приводят к гибели клеток на раз­ных стадиях процесса скрещивания).

Парасексуальный цикл у грибов

Многие мицелиальные формы грибов, применяющиеся в про­мышленности, не имеют истинного полового цикла, во время: которого можно было бы провести скрещивание с целью кон­струирования более продуктивных штаммов. Однако в этом случае для осуществления рекомбинации можно использовать парасексуальный цикл. Именно этот подход применялся при работе с грибами таких промышленно важных родов, как As- pergillus, Penicillium, Cephalosporium и Fusarium. Суть парасексуального цикла отражена на рис. 7.2.

Рис. 7.2. Обычный парасексуальный цикл. [С. E. Caten (1981) Parasexual pro­cesses in fungi. In: The Fungal Nucleus (eds. K. Gull, S. G. Oliver), pp. 191— 214. Cambridge University Press.] Тонкие линии — гаплоидные или анеуплоидные ядра; жирные линии — диплоидные ядра.

Гетерокарионы, у которых в одной клетке сосуществуют ге­нетически разные ядра, могут быть получены либо путем слия­ния (анастомоза) гиф разных мицелиев, либо в результате образования мутантного ядра в мицелии. Слияние ядер в гете­рокарионе происходит с низкой частотой (10~⁵—IO^-4), но этот процесс ускоряется под действием (+)-камфоры или УФ-све- та. Митотическую рекомбинацию в диплоидном ядре можно ин­дуцировать с помощью химических и физических воздействий, которые либо вызывают мутации, либо ингибируют синтез ДНК. Возврат к гаплоидному состоянию после рекомбинации, видимо, происходит в результате постепенной утраты отдель­ных хромосом. Этому способствуют такие вещества, как п-фтор- фенилаланин и карбаматы бензимидазола, препятствующие об­разованию микротрубочек.

По сравнению с истинными системами пола парасексуаль ный цикл — это малоэффективный механизм образования ре­комбинантов. Впрочем, его эффективность можно повысить, применяя интенсивный отбор и разнообразные ещества. Эта система была использована для повышения выхода антибиоти­ков, синтезируемых Penicillum и Cephalosporium.