• 7.3.1. Плазмиды

Многие свойства бактерий, интересные с точки зрения биотех­нологии, кодируются плазмидами. Плазмиды — это кольцевые молекулы ДНК, которые стабильно передаются потомству бак­териальных клеток независимо от хромосомной ДНК- В гене­тической инженерии плазмиды используются для клонирования нужных генов. Мы опишем в этом разделе некоторые важней­шие свойства плазмид и обсудим те из них, которые особенно ценны для биотехнологии.

Структура и репликация

Мол. масса плазмид составляет от I-IO⁶ до 200∙ IO⁶. Таким об­разом, самые мелкие плазмиды кодируют один-два белка сред­него размера, тогда как более крупные — 300 или более бел­ков. Крупные плазмиды могут кодировать множество фермен­тов, необходимых для работы целой последовательности биохи­мических реакций, например для превращения толуола в кате­хол. Плазмиды с мол. массой более IOO-IO⁶ обнаружены толь­ко у грамотрицательных бактерий, в частности у видов Pseudo­monas и Agrobacterium. Мол. масса плазмид грамположитель- ных бактерий лишь в отдельных случаях превышает 40-IO⁶.

В бактериальных клетках плазмиды существуют в виде кольцевых двухцепочечных ДНК, которые, кроме того, находят­ся в сверхспиральном состоянии. Некоторые из плазмид могут существовать лишь в клетках одного или двух близких видов. К числу плазмид с широким кругом хозяев относятся RP4, R68.45, RK2 и сходные с ними плазмиды, несущие маркер ус­тойчивости к лекарственным препаратам (R-плазмиды), кото­рые принадлежат P-группе несовместимости (члены одной и той же группы несовместимости не могут сосуществовать в бак­териальной клетке). Эти плазмиды были перенесены во многие виды грамотрицательных бактерий; создается впечатление, что их хозяевами могут быть все штаммы грамотрицательных бак­терий.

Таким образом, R-плазмиды, относящиеся к группе Р, осо­бенно подходят для генетических экспериментов с грамотрицательными бактериями, используемыми в промышленности. При помощи этих плазмид мы можем осуществлять перенос хромо­сомных генов между неродственными видами. Небольшие по размеру производные плазмид RP4 и RK2 используются как векторы для клонирования молекул ДНК, которая затем мо­жет быть перенесена в клетки самых разных видов.

Рис. 7.3. Плазмиду pBR322 получают путем объединения плазмид TnJ, pSC101 и pMBl. [J. G. Sutcliffe (1979) Cold Spring Harbor Simposia on Quanti­tative Biology, 43, 77—90.] Плазмида pMBl сходна с плазмидой ColEl. Устой­чивость к ампициллину определяется геном р-лактамазы. Указано направление транскрипции этого гена. Стрелками отмечены уникальные сайты расщепления pBR322 некоторыми ферментами.

Репликация некоторых типов плазмид тщательно изучена, и нам известны сегодня многие детали этого процесса, особен­но для небольшой плазмиды ColEl. Эта информация помогает при использовании плазмид для клонирования генов. Чаще все­го применяют производные плазмиды pBR322 длиной 4362 пар нуклеотидов, несущей гены устойчивости к пенициллину и тет­рациклину. Эти гены были перенесены из R-плазмид (рис. 7.3)

Плазмиды pBR322 и ColEl могут реплицироваться в Е. co­ll и близких видах Enterobacteriaceae. В бактериальных клет­ках они представлены несколькими копиями; так, для ColEl чис­ло плазмидных копий на хромосому равно примерно 20, а для pBR322 — 40. Это обстоятельство очень важно для клонирова­ния. Чем больше число копий клонированного гена, тем выше выход кодируемого белка. Кроме того, многокопийные плазми­ды не так легко утрачиваются при культивировании. C другой стороны, малое число копий плазмиды иногда имеет свои пре­имущества, например при клонировании таких генов, продукты; которых гибельны для бактериальной клетки в большом коли­честве.

Изучению механизмов контроля репликации и числа копий бактериальных плазмид посвящено множество работ. Было обнаружено, что число копий плазмид примерно одинаково в клетках, размножающихся с разной скоростью. Из этого сле­дует, что репликация плазмид как-то связана с ростом бакте­рий. Такая координация достигается при участии механизмов,, контролирующих начало репликации. Если уж репликация на­чалась, то она идет с относительно постоянной скоростью при любом темпе размножения бактерий. При высокой скорости размножения репликация индуцируется чаще в случае много.- копийных плазмид, чем малокопийных.

Начало репликации ColEl и pBR322 контролируется неболь­шими молекулами РНК, которые взаимодействуют с особым; участком плазмиды, расположенным поблизости от точки ини­циации репликации. Начавшись, репликация идет в одном нап­равлении и заканчивается вблизи точки инициации. Генетики, стремящиеся максимально увеличить выход белков, кодируе­мых клонированными в pBR322 генами, получали мутанты с модифицированными РНК. У некоторых таких мутантов число копий плазмиды составляет более 100, что приводит к суще­ственному увеличению выхода продуктов, кодируемых клониро­ванными генами. Интересная особенность репликации ColEl и pBR322 заключается в том, что она полностью обеспечива­ется ферментами хозяина. Сами плазмиды не несут информа­ции, нужной для кодирования ферментов репликации.

Процессы репликации pBR322 и ColEl, с одной стороны, и хромосомы Е. coll — с другой, различаются тем, что первый не подавляется хлорамфениколом, который блокирует синтез бел­ка. В присутствии этого соединения репликация хромосом пре­кращается по завершении уже начавшегося раунда реплика­ции. Такого подавления репликации pBR322 не происходит, и плазмиды накапливаются в обработанных хлорамфениколом.

Инициация репликации плазмиды Rl Е. coli регулируется белком-репрессором, кодируемым одним из генов Rl. Были по­дучены мутантные плазмиды, которые кодируют аномальный репрессор или же имеют несовершенный механизм регуляции его образования. Некоторые из этих мутантов — температуро­чувствительные (репрессор неактивен при 43 ⁰C). При 30 ⁰C репликация идет нормально, и на клетку образуется 1—2 плаз- мидные копии, а при 43 ^oC репликация инициируется гораздо чаще, так что в клетке накапливается по нескольку сот плаз­мид. Небольшой сегмент Rl, содержащий участок начала реп­ликации и связанные с ними регулирующие элементы, был ис­пользован для создания плазмид-векторов, применяемых при клонировании разнообразных генов. Преимущество таких век­торов заключается в том, что при повышенной температуре с их помощью можно получать множества копий клонируемого гена, а следовательно, и много белка, кодируемого этим геном.

Важнейшие гены плазмид

Для биотехнологии особенно интересны те гены плазмид, в ко­торых закодирована способность к фиксации азота и деграда­ции органических соединений, а также факторы вирулентности патогенных бактерий.

По-видимому, одним из крупных достижений генной инже­нерии может оказаться использование бактерий или их генов для передачи растениям способности фиксировать азот. На корнях бобовых растений при участии бактерии Rhizobium об­разуются клубеньки, в которых и происходит фиксация азота — перевод его в форму, доступную растениям. Недавно было ус­тановлено, что по крайней мере некоторые гены бактерий, де­терминирующие образование клубеньков и фиксацию азота, ло­кализованы в плазмидах. Впервые указания на это были полу­чены в опытах по передаче плазмид при конъюгации от одного штамма Rhizobium другому. Каждый конкретный вид из рода Rhizobium обычно вступает в симбиотические отношения только с одним определенным бобовым растением. Так, R. phaseoli участвует в образовании клубеньков у фасоли, а R. Iegumino- sarum — у гороха. Было найдено, что варианты R. Ieguminosa- гит, утратившие способность индуцировать образование клу­беньков у гороха, вновь ее обретали, если путем конъюгации им передавалась плазмида от штамма, обладающего такой способ­ностью. Более того, если подобная конъюгативная плазмида передавалась от R. Ieguminosarum к R. phaseoli, то эти бакте­рии с большей эффективностью индуцировали образование клу­бенька у гороха, чем у фасоли. Крупные плазмиды с мол. мас­сой более 90-IO⁶, которые имеются у Rhizobium trifolii и R. те- Iiloti, также несут по меньшей мере часть генов, нужных для: образования клубеньков и фиксации азота.

Плазмиды могут обусловливать увеличение вирулентности патогенных бактерий. В некоторых случаях идентификация свя­занных с плазмидами факторов вирулентности помогает в борь­бе с патогенными микроорганизмами. К числу наиболее изу­ченных в этом отношении плазмид принадлежат плазмиды ви­рулентности патогенных штаммов Е. coli. Энтеротоксигенные штаммы Е. coll часто вызывают острую диарею у молодняка животных, а у людей — «диарею путешественников». Плазми­ды этих штаммов нередко несут ген температурочувствительно­го токсина, близкого к токсину холеры, и ген температуроус- стойчивого токсина. Энтеротоксигенные штаммы обычно со­держат и плазмиды с генами фимбрий (pili), которые называ­ют также «факторами колонизации». Эти факторы находятся на поверхности бактериальных клеток, которые с их помощью' прикрепляются к стенке тонкого кишечника. Штаммы, инфи­цирующие определенный вид животных, обладают обычно оди­наковым фактором колонизации. Так, у штаммов Е. coli, вызы­вающих диарею у свиней, в состав этих липких выростов обыч­но входит антиген К88 или 987Р, в то время как у штаммов,, выделенных от телят, образуется антиген К89. Потеря энтеро- токсигенными штаммами плазмид, кодирующих антигены — факторы колонизации, сильно снижает их вирулентность, хотя штаммы и продолжают образовывать токсины.

Одним из способов борьбы с заболеванием свиней, вызывае­мым энтеротокоигенными штаммами, была вакцинация живот­ных препаратом, содержащим антиген К88. Предпринимаются' попытки повысить выход применяемого в вакцинах антигена К.88, используя технологию рекомбинантных ДНК. Эти методы нашли применение также и в производстве некоего токсоида, который можно не опасаясь вводить животным для образова­ния у них антител к токсинам, продуцируемым энтеротоксиген- ными бактериями. Другой подход в борьбе с диареей в живот­новодстве состоит в выведении пород, устойчивых к кодируе­мым плазмидами антигенам — факторам колонизации.

Tранспозоны

Транспозоны и вставочные последовательности — это сходные элементы в хромосомных ДНК бактерий, ДНК бактериофагов, и плазмид. В опытах с бактериями транспозоны используются для получения мутантов и для клонирования нужных бакте­риальных генов. Открыты они были Хеджесом и Жакобом, ко­торые показали, что небольшой фрагмент плазмиды RP4, опре­деляющий устойчивость к пенициллину, может встраиваться в другие плазмиды, последовательность которых не гомологич­на RP4. Обычный механизм рекомбинации в клетках бактерий, основанный на взаимодействии гомологичных молекул ДНК и зависимый от продукта бактериального гена rec А+, в переносе этого гена устойчивости к антибиотику не используется. В по­следующие годы было описано множество других транспозонов. Большинство из них было обнаружено в R-плазмидах грамот- рицательных бактерий; обычно они придают им устойчивость к антибиотикам. Лучше всего изучен транспозон ТпЗ длиною 4957 пар нуклеотидов, обеспечивающий устойчивость к пени­циллину. Последовательности из 38 пар нуклеотидов на концах Tn∙3 одинаковы, но противоположно направлены. В транспозо­не закодирована информация о ферменте транспозазе, играющем важную роль в его перемещениях (транспозициях). Этот транс­позон может встраиваться во множество сегментов молекулы ДНК, но предпочитает АТ-богатые участки.

Транспозоны могут служить маркером гена, предназначен­ного для клонирования. Как известно, при клонировании хро­мосомных генов бактерий иногда возникают сложности, свя­занные с тем, что нет простого метода, позволяющего выявить, какая из плазмид, несущих встроенный фрагмент хромосомной ДНК, содержит интересующий исследователя ген. Иногда эту проблему удается решить, выделив сначала мутант по этому тену с включенным в него или расположенным поблизости транспозоном.

• 7.2.2.  Слияние протопластов

C целью преодоления преград для генетического обмена, су­ществующих в обычных системах скрещивания, был разработан метод слияния протопластов (клеток с удаленными клеточны­ми оболочками). Этот метод пригоден для получения межвидо­вых и даже межродовых гибридов. Его можно использовать при гибридизации клеток одного вида, которые принадлежат к несовместимым группам спаривания или же когда природная система скрещивания малоэффективна в плане образования ге­нетических рекомбинантов.

Слияние протопластов бактерий

Метод слияния протопластов был впервые использован в опы­тах с бактериями для получения межвидовых гибридов Bacillus megateriurnXBacillus subtilis. В природе эти бактерии не конъюгируют, но легко трансформируются изолированной ДНК- Путем слияния протопластов, индуцируемого либо поли­этиленгликолем, либо CaCl₂, получить их гибриды несложно. При этом частота рекомбинации может достигать IO^-5—IO^-4; процесс нечувствителен к ДНКазе, следовательно, он осу­ществляется без трансформации.

Этот метод нашел широкое применение при гибридизации видов Streptomyces. Так, Streptomyces coelicolor обладает плаз­мидозависимой системой фертильности или скрещивания (с. 300), однако эта система малоэффективна, а многие исполь­зуемые в промышленности виды Streptomyces вообще не спо­собны к обычному скрещиванию. Если же применить метод •слияния протопластов, индуцируемого полиэтиленгликолем, то частоту рекомбинации удается повысить примерно на четыре порядка по сравнению с наблюдаемой при обычном скрещива­нии. Максимальная частота рекомбинации, достижимая при ра­боте этим методом, составляет 10—20%. Штаммы не обяза­тельно должны нести селективные генетические маркеры, по­скольку при использовании этого метода возможен прямой от­бор гибридов с нужным свойством. Это дает большие преиму­щества при конструировании промышленно важных штаммов, поскольку работа по введению подходящих маркеров нередко превращается в утомительное трудоемкое занятие.

Слияние протопластов грибов

Образование гибридов грибов с помощью слияния протопластов изучалось очень активно; этот метод нашел применение в про­мышленности при создании штаммов Cephalosporium acremo- nium, для которых характерны высокая скорость роста и боль­шой выход цефалоспорина. Первые опыты по слиянию были выполнены с ауксотрофными мутантами Geotrichum Candidum, у которых не обнаружено ни половой, ни парасексуальной си­стем. Слияние протопластов осуществляли путем центрифугиро­вания, причем прототрофные гетерокарионы образовывались с низкой частотой. Впоследствии слияние обычно осуществляли, добавляя ионы Ca²++ или ПЭГ.

Межвидовые слияния удалось провести как в опытах с раз­личными мицелиальными грибами, так и с дрожжами, среди которых были и такие промышленно важные организмы, как Penicillium chrysogenum, Aspergillus niger, Candida tropicalis, Yarrowia Iipolytica, Kluyveromyces Iactis и Saccharomyces се- Tevisiae. Слияние обычно происходит с частотой 0,2—2%. Ве­роятность слияния ядер, приводящего после слияния клеток к образованию диплоидов, зависит от вида организма. Здесь вскрыта определенная закономерность: мицелиальные грибы дают гетерокарионы, диморфные дрожжи — нестабильные диплоиды, а истинные дрожжи — стабильные диплоиды (рис. 7.4).

Межвидовые слияния также происходят с достаточно высо­кой частотой, особенно у относительно близкородственных ви­дов Aspergillus или Penicillium. Если сливаются ядра, то за этим обычно следует потеря хромосом. Нередко после выращивания в неселективных условиях образуются споры с гапло­идными ядрами лишь одного из двух родительских видов.

Гетерокарионы

Geotrichum Candidum

Phycomyces blakesleeanus

Mucor racemosus

Гетерокарионы и часто образующиеся нестабильные диплоиды

Cephalosporium acremonium

Гетерокарионы и редкие стабильные диплоиды

Aspergillus

PeniciHum

Гетерокарионы и часто образующиеся стабильные диплоиды

Candida Iropicalis

Нестабильные диплоиды

Yarrowia Iipolytica

Стабильные диплоиды

Saccharomyces Cerevisiae
Kluyveromyces Iactis

Рис. 7.4. Результаты внутривидовых слияний протопластов.

Предпринимались попытки осуществить слияние протопла­стов дрожжей разных родов (например, CandidaXSaccharomy- copsis, YarrowiaXPichia, YarrowiaxKluyveromyces, Saccharo- mycesXSchizosaccharomyces). Однако такие гибриды оказа­лись нестабильными, а частота их образования очень низкой (10^^⁵—IO^-4). В последнем варианте обычно формировались многоядерные "клетки. Сообщалось об успешном слиянии про­топластов мицелиальных грибов (целлюлолитический организм Trichoderma reesii) и дрожжей (5. cerevisiae), но эти наблюде­ния нуждаются в подтверждении.

При многих слияниях образуются нестабильные гетерока­рионы, в которых обычно доминирует ядро одной из родитель­ских форм. Впрочем, далеко не всегда это препятствует гене­тическому обмену. Так, убедительно показана возможность межъядерных генетических обменов в гетерокарионах Schizop-hilum commune и Saccharomyces cerevisiae. Таким образом, слияние протопластов может быть полезным методом установ­ления гетерокариотического состояния, при котором возможен в ограниченном объеме перенос генов.

Образование гибридов растений путем слияния протопластов

Протопласты растений можно получить путем механического или ферментативного разрушения клеточных стенок. Такие про­топласты — ценный инструмент в руках генетика растений. Они довольно быстро и эффективно регенерируют клеточную стен­ку, у них легко индуцировать деление с образованием каллусной ткани. Из каллуса можно вырастить растения, способные цвести и давать всхожие семена. Доступность жизнеспособных протопластов позволила генетикам растений проводить опыты по мутагенезу и селекции на уровне единичной клетки, т. е. примерно так, как это делают микробиологи. В результате, на­пример, были получены растения табака, устойчивые к болезни «wild-fire»: мутации у протопластов вызывали этилметансульфонатом, а затем отбирали мутанты, устойчивые к действию метионинсульфоксима. Дело в том, что токсин, образуемый Pseudomonas tabaci (организмом, вызывающим упомянутое за­болевание),— это тоже аналог метионина.

Слияние протопластов растений осуществляют с помощью ряда агентов, включая азотнокислый натрий, гидроксид каль­ция и ПЭГ. Наибольшая частота слияния наблюдается при действии ПЭГ, но гибриды, полученные в присутствии кальция, проще регенерировать в целое растение. Таким путем удалось получить межсортовые внутривидовые гибриды, гибриды между видами одного рода и даже разных родов. Опыты эти проводи­лись на таких важных культурах, как картофель, табак и спаржа.

Результатом слияния может быть простое сращение клеток одной и той же родительской линии или образование гибридов двух типов клеток. Как и для большинства других разновидно­стей скрещивания, основная трудность здесь состоит в выборе метода отбора гибридов; кроме того, работа с растениями силь­но осложняется недостатком подходящих генетических марке­ров. В большинстве тех случаев, когда гибриды удавалось получить путем слияния протопластов, гибридизация уже была осуществлена обычными генетическими методами. Таким об­разом, фенотип гибрида был уже известен, и его можно было принять за стандарт при отборе. В этой новой области селек­ции растений предстоит еще большая работа, и успех ее опре­деляется тем, сможем ли мы использовать обширный набор маркеров (например, устойчивости к химическим веществам и токсинам) или ауксотрофных мутантов растений.

• 7.2.3.   Слияние клеток животных

Осуществить слияние клеток и получить внутри- или межви­довые гибриды клеток млекопитающих методически проще, чем в случае микроорганизмов или растений, так как клетки млеко­питающих не имеют клеточной стенки, которую необходимо удалять перед слиянием. Первый метод контролируемого слия­ния клеток млекопитающих был основан на использовании ин­активированного вируса Сендай. Этот вирус относится к группе парамиксовирусов; его вирион покрыт липидсодержащей обо­лочкой, сливающейся с мембраной клетки-хозяина и обеспечи­вающей проникновение вируса в клетку. Вирус способствует слиянию, связываясь одновременно с мембранами двух клеток. В опытах по слиянию клеток млекопитающих используются также некоторые химические вещества (ионы кальция, лизолецитин, ПЭГ).

Отбор гибридов из смеси продуктов слияния лучше всего- вести в селективных условиях, хотя для этого можно использо­вать и трудоемкий метод скрининга. Так, отбор может происхо­дить в результате комплементации ауксотрофных и температу­рочувствительных мутаций, но чаще всего для этого использу­ются маркеры устойчивости к химическим веществам. Послед­ний метод был предложен Литтлфилдом, который провел опы­ты по слиянию устойчивой к бромдезоксиуридину линии (BUdR^r) L-клеток мыши и еще одной линии, устойчивой к аза­гуанину (AG^r). В клетках BUdR^r отсутствует фермент тимидинкиназа (TK), а в клетках AG^r — инозинпирофосфорилаза (IPP). Ни клетки TK^-IPP⁺, ни клетки TK⁺IPP^- не растут на среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Ами­ноптерин ингибирует биосинтез нуклеотидов; трифосфаты пури­новых и пиримидиновых нуклеозидов могут синтезироваться только клетками, способными использовать и тимидин, и гипо­ксантин. Для жизнедеятельности этим клеткам необходимы ак­тивные ферменты TK и IPP. Таким образом, среди продуктов слияния TK⁺IPP^-, TK^-IPP⁺ и TK⁺IPP⁺ способностью к росту будут обладать лишь клетки, у которых активны оба фермента.

Использование таких приемов отбора позволило получить гибриды не только путем слияния линий клеток одного вида, но и межродовые гибриды клеток человека с клетками мыши и крысы. Эти линии клеток грызунов/человека нестабильны, причем легче они теряют хромосомы человека, так что после тридцати делений в процессе выращивания у них остается все­го семь из 24 хромосом человека, изначально присутствовавших в гибридной клетке. Этот процесс элиминации хромосом был применен при картировании генома человека, поскольку та­ким путем удается быстро локализовать определенные гены на хромосомах.

Моноклональные антитела

Один из результатов использования метода слияния клеток млекопитающих чрезвычайно быстро нашел применение в био­технологии: это линии клеток, полученных при гибридизации с участием клеток миеломы (так называемые «гибридомы»), с помощью которых могут вырабатываться моноклональные ан­титела. Этот метод, разработанный в Кембридже Мильштейном и его сотр., основан на создании «бессмертных» клеток, произ­водящих антитела, за счет слияния их с клетками миеломы.

Большинство антигенов вызывает в организме образование целого набора антител, но каждый отдельно взятый лимфоцит продуцирует лишь одно из них. Миеломы — это злокачествен­ные новообразования иммунной системы; они развиваются в ре­зультате неконтролируемой пролиферации одной линии лимфо­цитов. При этом в больших количествах синтезируется один тип белков-антител. Иными словами, миеломы являются природны­ми продуцентами моноклональных антител. По методу Миль­штейна проводят слияние нормальных (неопухолевых) лимфо­цитов и клеток миеломы. Вначале полученные гибриды синте­зируют смесь антител, включающую два типа антител роди­тельских клеток, а также гибридные их формы, образующиеся путем ассоциации тяжелых и легких цепей антител двух роди­тельских форм. Впоследствии в результате элиминации хромо­сом образуются клетки, способные к синтезу антител лишь од­ного типа. Это могут быть либо антитела, закодированные в ге­номе лимфоцита, либо антитела, характерные для клеток мие­ломы. Скрининг и обнаружение клона, синтезирующего иско­мое антитело, ведут при помощи биохимических и иммунохимических методов. Схема этого метода дана на рис. 7.5.

Область возможного применения моноклональных антител весьма обширна. Их используют в диагностике, например для быстрого и точного типирования тканей и органов, предназна­ченных для пересадки. Они находят применение при очистке белков и других биологических соединений методом иммуноадсорбции. Секер и Берке использовали моноклональные антите­ла для очистки больших количеств интерферона из лимфоцитов человека (гл. 8). Очевидно, что такой подход пригоден и для очистки интерферона, синтезируемого бактериями-рекомбинан­тами. Возможности применения моноклональных антител для пассивной иммунизации ограничены, во всяком случае, у боль­ных людей, поскольку пока не удалось получить стабильные клоны на основе клеток человека.

Рис. 7.5. Метод Мильштейна