• 8.4.1. Пренатальная диагностика наследственных болезней

Многие методы молекулярной генетики начинают широко при­меняться в пренатальной диагностике наследственных болезней, например гемоглобинопатий. Так, в 1978 г. Кен и Доузи раз­работали метод диагностики серповидноклеточной анемии путем анализа ДНК из клеток околоплодной жидкости. Это несрав­ненно более безопасный метод, чем взятие для анализа крови- плода, когда вероятность аборта доходит до 7%. Серповидно­клеточная анемия — это одно из наиболее часто встречающихся нарушений синтеза гемоглобина. Она развивается в результате замены глутаминовой кислоты в 6-м положении 3-Цепи гемогло­бина на валин. При дезоксигенации эритроциты, содержащие- аномальный HbS (две обычные а- и две аномальные 3-цепи), приобретают форму полумесяца (серповидную). Такие негибкие серповидные клетки затрудняют кровообращение в капиллярах и быстро разрушаются. Клиническими проявлениями болезни являются анемия, прекращение роста, приступы острой боли (кризы), а также острые или хронические заболевания органов вследствие закупорки сосудов (например, инсульт).

В работе Кена и Доузи (рис. 8.6) ДНК выделяли из лейкоцитов крови двух родителей, их ребенка, страдающего серпо­видноклеточной анемией, и здорового добровольца (контроль). 

Рис. 8.6. Схема, иллюстрирующая использование генных зондов и анализ по­лиморфизма длины рестрикционных фрагментов в пренатальной диагностике гемоглобинопатий, например серповидноклеточной анемии (Emery, 1981).

ДНК была выделена также из клеток околоплодной жидкости, отобранной в ходе третьей беременности матери. Вошедший не­давно в практику метод картирования с помощью эндонуклеаз рестрикции (гл. 7) позволяет сопоставлять разные ДНК; мече­ную Р³²-кДНК, комплементарную глобиновому гену, можно по­лучить путем выделения глобиновой мРНК из ретикулоцитов и использования обратной транскриптазы, с помощью которой из Р³²-нуклеотидов синтезируется кДНК. При расщеплении со- шоставляемых ДНК эндонуклеазой (в данном случае—HpaI) образуются фрагменты разной длины, которые разделяют ме­тодом гель-электрофореза. Затем фрагменты переносят на нит­роцеллюлозный фильтр и проводят гибридизацию с радиоактив­ной кДНК-зондом (метод саузерн-блотинг). Нуклеотидные последовательности, связавшие зонд, локализуют методом ра­диоавтографии. Именно они содержат гены глобина. У здоро­вого человека ген р-глобина локализован во фрагменте длиной 7,6 kbp. У больного ребенка он был обнаружен во фрагменте длиной 13,0 kbp, а анализ распределения фрагментов расщеп­ленной ДНК у обоих родителей и в клетках плода выявил участки длиной как 7,6, так и 13,0 kbp (т. е. они являются ге­терозиготами и несут локус серповидноклеточности). Полимор­физм определяется вариациями в локализации сайта узнавания эндонуклеазой, расположенном приблизительно на расстоянии 5000 нуклеотидов от З'-конца гена.

Сходный метод был применен для пренатальной диагностики Р-талассемии. При этой гемоглобинопатии p-цепь гемоглобина синтезируется либо в недостаточном количестве, либо не син­тезируется вообще. При использовании метода определения по­лиморфизма рестрикционных фрагментов по длине (RFLP) глу­боких знаний о молекулярных основах патологических измене­ний при данном заболевании не требуется. Это по сути «метод, отпечатков пальцев», при помощи которого выявляются анома­лии, сопутствующие клиническим симптомам, и поэтому он мо­жет применяться при лечении многих наследственных болезне..

• 8.4.2.  Роль генетических факторов в патологии

Примером генетически обусловленного заболевания может быть, и диабет, но механизм наследования и молекулярная основа его остаются неясными. У пациентов группы 1, страдающих юношеским диабетом, наблюдается полная или почти полная, гибель р-клеток островков Лангерганса, и инсулин у них не об­разуется. Такая разновидность диабета чаще всего встречается; у гаплотипов Dr3 и Dr4 HLA. В группе 2 (диабет взрослых) уровень инсулина в крови больных близок к норме или повы­шен; аномалии у них иные, и среди них — нечувствительность, рецепторов к инсулину. Они и приводят к недостатку инсулина. У больных диабетом группы 2 взаимосвязи с определенными типами HLA не выявлено. Ротвейн и др. (Rotwein et al., 1981) использовали метод RFLP для анализа ДНК 35 здоровых лю­дей, 17 больных диабетом из группы 1 и 35 — из группы 2.. У 26% здоровых людей в последовательности ДНК, прилегаю­щей к б'-концу гена инсулина, были обнаружены вставки дли­ной 1,5—3,4 kbp. Такие же вставки присутствуют и в ДНК 35% больных группы 1 и 66%—группы 2 (рис. 8.7). Была определена полная нуклеотидная последовательность этого по­лиморфного участка, прилегающего к гену инсулина, и показа­но, что различия определяются числом и расположением повто­ряющихся последовательностей. Из ряда опытов следует, что последовательность прилежащего к 5'-концу гена участка может сказываться на экспрессии гена. В этой связи существенно более высокий полиморфизм этого участка при диабете типа 2 представляет особый интерес (следует, впрочем, отметить, что некоторым исследователям не удалось подтвердить наличия та­кой взаимосвязи). Сегодня мы еще не можем утверждать, что эти изменения достаточны или обязательны для развития болезни, и трактовку результатов нельзя считать однозначной.

Рис. 8.7. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов 5'-фланкирующего участка гена инсулина человека. Указано место вставок длиной 1,5 и 3,4 kbp. Pre — участок, кодирующий аминокислотную последовательность, примыкаю­щую к N-концу проинсулина, которая, видимо, способствует его секреции в эн­доплазматический ретикулум; В, C и А — последовательности, кодирующие В-цепь, конвекторный пептид и A-цепь инсулина. Заштрихованный участок — интрон (гл. 7).

Еще два наследственных заболевания, точная генетическая основа которых нам не известна, но для которых недавно была установлена взаимосвязь между особым типом полиморфизма ДНК и наличием «больного» гена — это мышечная дистрофия Дюшена и хорея Хантингтона. Последнее заболевание неизле­чимо, наследуется по аутосомному доминантному механизму и выражается в прогрессирующем слабоумии и параличе, насту­пающем на тридцатом — сороковом году жизни. К сожалению, до недавнего времени мы не располагали методом выявления носителей такого гена. Поскольку здесь налицо определенная связь с маркерами ДНК, ее следует иметь в виду при генети­ческом консультировании, и возможно, что со временем на этой основе будут идентифицированы и сам ген хореи Хантингтона, и соответствующий продукт.