• 9.3.1. Из истории вопроса

Семейство Leguminoseae включает около 625 родов и 18 000 ви­дов. Это одно из самых многочисленных и наиболее важных с экономической точки зрения семейств цветковых растений. Семена многих видов бобовых богаты белком. Они являются ценным сырьем для производства кормов и пищевых продуктов. Из растений умеренного климата можно назвать горох и фасоль. В тропических и субтропических зонах возделываются самые разнообразные культуры, включая сою, вигну китайскую, чече­вицу и арахис. Многие бобовые — ценные пастбищные культуры (например, различные виды клевера, Stylosanthes и др.). Они могут служить зеленым удобрением (например, люцерна), дают нам лесоматериалы, фрукты, овощи, клеящие вещества, волок­на, лекарства и пряности. Роль бобовых определяется еще и тем, что они способны фиксировать азот атмосферы в корневых клубеньках, которые формируются при участии почвенных бактерий из рода Rhizobium. Образующиеся в них азотистые ве­щества необходимы для роста растений.

Если об участии клубеньковых бактерий в симбиогенной фиксации атмосферного азота стало известно сравнительно не­давно (менее 100 лет назад), то о многих преимуществах вы­ращивания бобовых люди узнали гораздо раньше (по меньшей мере две тысячи лет тому назад). Культура, из которой можно получать богатые белком пищевые продукты и которая не тре­бует (или требует очень мало) азотных удобрений, несомненно, выгодна, и неудивительно, что образующие клубеньки бобовые стали важной сельскохозяйственной культурой в Европе, Север­ной Америке и на других континентах.

Установлено, что среди бобовых, играющих важную роль в сельском хозяйстве (в основном из Papilionoideae), приблизи­тельно 98% видов могут образовывать клубеньки. У диких ви­дов они чаще всего формируются при участии особых разновид­ностей бактерий-ризобиумов, существующих в их природном местообитании. Если какой-то вид бобовых (дикий или куль­тивируемый) долго растет на одном месте, это приводит к по­степенному накоплению в почве сожительствующей с ним раз­новидности ризобиумов. Урожай, особенно если в почве недо­стает азотистых соединений, нередко зависит от того, образова­лась ли в данном месте эффективная (т. е. способная к фикса­ции азота) ассоциация из растения-хозяина и соответствующей разновидности (штамма) Rhizobium. Нужный штамм не всегда присутствует в том месте, где предполагается выращивать дан­ную культуру, и в таком случае его приходится вносить в почву.

Как только стала ясна роль симбиоза бактерий рода Rhizobiuт и бобовых, были разработаны способы внесения этих бак­терий в почву для улучшения условий культивирования. Их ста­ли добавлять также и к семенам. Затраты на внедрение этого способа инокуляции невелики, транспортные расходы незначи­тельны, а сами методы достаточно несложны, чтобы их можно было внедрить в сельское хозяйство развивающихся стран, где высокая стоимость удобрений ложится тяжелым грузом на пле­чи фермеров. Выращивание бобовых с применением метода ино­куляции семян нередко благоприятно сказывается на состоянии окружающей среды: оно помогает бороться с наступающей пу­стыней, облегчает борьбу с эрозией почв, уменьшает перенос почвы ветрами и позволяет с большим успехом восстанавливать истощенные земли. Большинство образующих клубеньки бобо­вых способны полностью удовлетворить свои потребности в азо­те. Это, конечно, бывает только тогда, когда и прочие условия благоприятствуют росту растений, т. е. растения получают до­статочно воды и других питательных веществ.

• 9.3.2. Инокуляция бактериями Rhizobium

Наиболее простой способ инокуляции основан на использовании почвы, взятой с полей, где выбранная для выращивания куль­тура бобовых растет хорошо. Этот способ вполне пригоден и широко применялся в конце XIX в.

Недостаток его заключается в том, что при этом приходится перемещать много почвы, так как Rhizobium составляют лишь малую часть микрофлоры и ничтожную часть самой почвы. В Америке обычно вносили 100—1000 кг почвы на 1 га. Брали эту почву с расположенного где-нибудь недалеко поля, где был получен хороший урожай нужной бобовой культуры. Еще один недостаток этого метода — возможность распространения с поч­вой болезней растений.

Гораздо меньше почвы необходимо вносить при помощи сея­лок, когда бактерии попадают прямо к семенам, где они нужнее всего. На основе этого простого способа был разработан метод прямой инокуляции семян. Сначала применяли измельченную почву (всего около 0,5 кг почвы на 1 кг семян), а затем стали использовать методы, основанные на введении чистых культур бактерий.

Первая разновидность коммерческой культуры для инокуля­ции была запатентована Ноббе и Хилтнером в 1896 г. Она по­ступала на рынок под названием «Nitragin». Для разных бобо­вых выпускалось 17 ее вариантов. Уже в 20-х гг. на рынок поступало много других разновидностей инокулятов. Некото­рые из них представляли собой чистые культуры бактерий, сме­шанные с почвой, песком, торфом, навозом или измельченной породой, другие — культуры, выращенные на агаре или в жид­кой среде. Далеко не в каждом случае качество таких иноку­лятов было высоким, не каждый раз их правильно применяли, так что и высокие урожаи получали не всегда.

• 9.3.3. Инокуляция семян

Суть этого метода заключается в том, что на семена наносят большое число клеток Rizobium, соответствующих определенно­му виду растения-хозяина, что увеличивает вероятность быстро­го образования клубеньков у проростков при участии данных микроорганизмов. Для этого нужно достаточно много бактерий, которые должны сохранять жизнеспособность до тех пор, пока в почве они не проникнут в корневые волоски.

Культуры на агаре

Для прямой инокуляции семян пригодны культуры Rhizobium, выращенные в пробирках или колбах на среде с агаром. Обыч­но для наращивания бактерий применяют агаровую среду с маннитолом и дрожжевым экстрактом следующего состава: 0,5 г K₂HPO₄, 0,2 г MgSO₄-7H₂O, 0,1 г NaCl, 10 г маннитола, 0,4 г дрожжевого экстракта (например, Difco, Oxoid), 15 г агара, до 1 л дистиллированной воды, pH 6,8—7,0; среду автоклави­руют при 121 ^oC 15 мин. В 10 мл такой среды может содержать­ся ~10¹° клеток ризобиумов. На холоде их можно хранить несколько недель.

В промышленном масштабе пробирочные культуры Rhizobi- um meliloti для инокуляции люцерны (альфальфы, Medicago sativa) производились в Англии с 1929 по 1963 г. За их качест­вом следил отдел микробиологии почвы Ротамстедской экспе­риментальной станции. Для инокуляции семян бактерии со­скабливали с поверхности косяка и суспендировали в снятом молоке, к которому добавляли немного фосфата кальция. Эту смесь выливали на кучу зерна и хорошо все перемешивали, а затем давали просохнуть в тени. При этом бактерии прили­пали к поверхности семян, а пленка высохшего молока надежно их защищала. В идеальном случае семена вскоре высевали. Этот метод пригоден для выработки небольших партий иноку­лята и соответствовал потребностям потребителей, выращиваю­щих люцерну в Англии, но сегодня такие культуры здесь боль­ше не производят. В каждой пробирке содержалось достаточно клеток Rhizobium, чтобы обработать семена для ~0,5 га посе­вов люцерны. К середине 40-х г. ежегодно продавалось около 40 000 таких препаратов, но к концу 50-х г. число их упало до 9000—10 000, а к 1964 г. до 1000—2000. Это было связано, по крайней мере частично, с уменьшением площадей, засеваемых люцерной. Сегодня в Англии коммерческие препараты-инокуля­ты не производятся, но из Австралии и США импортируются высококачественные препараты на торфяной основе.

• 9.3.4. Современные инокуляты на твердых носителях

Rhizobium, выращенные на агаре или в жидкой среде, после высушивания на поверхности семян быстро погибают, да и са­ми культуры их нежизнестойки. Этих недостатков лишены ино­куляты на торфяной основе, которые были созданы в США, а сегодня применяются повсеместно.

При получении культуру нужного штамма Rhizobium выра­щивают обычным способом в ферментере объемом в несколько литров в жидкой среде (например, содержащей маннитол и дрожжевой экстракт). Установка может быть очень несложной, лишь бы ее устройство обеспечивало защиту от микробного загрязнения. Температуру среды поддерживают в интервале 25—28 ⁰C₁ и осуществляют интенсивную аэрацию, продувая че­рез среду стерильный воздух. Контроль за pH осуществлять не нужно, особенно если в среду добавлено немного CaCO₃. К мо­менту смешивания с торфом (носителем) — стерильным или не­стерильным— плотность культуры должна быть достаточно вы­сокой, 5∙ IO⁸—4∙ IO⁹ клетка/мл. В случае медленно растущих штаммов (например, R. Iupini) со средним временем удвоения числа клеток около 10 ч обычно бывает сложно получить куль­туру с высокой плотностью, и нередко даже размножение более быстро растущих штаммов (со средним временем удвоения 3 ч) подавляется видами-загрязнителями. Для обеспечения быст­рого роста культуры на жидкой среде полезно вносить сразу много бактерий.

Культуры на торфяном носителе

Торф высушивают либо при обычной температуре, либо при осторожном нагревании до влажности около 10% (на сухую массу), а затем измельчают при помощи молотковой мельницы до порошка, который просеивают через сито (200 меш) и дово­дят pH до 6,5—7,0, добавляя тонко измельченный CaCO₃. Такой торф можно использовать как стерильный или нестерильный носитель. О пригодности партии торфа для получения инокуля­тов Rhizobium нельзя судить по общим его свойствам, и на каж­дой из них проводят пробные выращивания именно тех штам­мов, которые предполагается использовать. Рост и выживае­мость бактерий в торфе зависят от многих факторов.

Нестерильные инокуляты на торфе

К подготовленному измельченному торфу добавляют до 40% (по массе) жидкой культуры, тщательно перемешивают смесь и оставляют ее для созревания в неглубоких лотках. Через не­сколько суток смесь опять перемешивают, а затем фасуют, обычно в заплавленные мешочки из полиэтиленовой пленки (толщиной 0,0375 мм). За первые несколько недель после при­готовления смеси число жизнеспособных клеток Rhizobium обычно увеличивается в 2—5 раз. Если держать фасовки при низкой температуре, бактерии обычно долгое время сохраняют жизнеспособность. Возможное время хранения оценивают ис­ходя из продолжительности периода, за который погибает 90% клеток (время уменьшения численности до Vio от первоначаль­ной). Это время варьирует от 90 недель (при 5 °C) до 8 (при 25 ⁰C). При благоприятных условиях культуры можно хранить до года (время уменьшения численности до Vio >16 недель), но срок этот заметно меньше, когда они содержатся при ком­натной температуре. Точно предсказать возможную продолжи­тельность хранения нельзя, и ее приходится определять для каждой партии отдельно.

Стерильные инокуляты на торфе

Заплавленные полиэтиленовые или полиамидные мешочки с под­готовленным измельченным влажным торфом стерилизуют в ав­токлавах (например, при 115 ^oC в течение 4 ч) или же путем у-облучения (примерно 4,5∙ IO⁶ рад). Затем при помощи шпри­ца для инъекций в них вводят нужный объем жидкой культуры (порядка 10 мл). Прокол запаивают и мешочки ставят на ин­кубацию, в ходе которой происходит существенное размножение бактерий.

Носители для Rhizobium

Твердый инокулят состоит из бактерий и носителя, роль кото­рого заключается в поддержании жизнеспособности клеток, по­скольку он частично защищает их от пересыхания. Кроме того, носитель способствует более равномерному распределению бак­терий в массе семян и помогает им прикрепиться к их поверх­ности. Хотя в случае бактериальных суспензий нередко получа­лись хорошие результаты, считается, что применение торфа как носителя более эффективно: при использовании жидких культур или же суспензий клетки Rhizobium после инокуляции и при­креплении их к поверхности семян оказываются практически беззащитными. Поэтому при производстве коммерческих ино­кулятов вначале чаще всего использовали именно торф. Однако торф есть далеко не везде, а если он и имеется, то сказать заранее, пригоден ли он как носитель, невозможно. В связи с этим были предприняты поиски альтернативных носителей с (Такими же защитными свойствами, как у торфа.

C неодинаковым успехом для этой цели были испробованы всевозможные композиции: разнообразные смеси почвы и торфа, в которые были добавлены молотая люцерна, измельченная со­лома, дрожжи или сахар; нильский ил с добавками питательных веществ; почва, смешанная с кокосовыми охлопьями или дре­весным углем. Опробованы также вермикулит, перегнившие опилки, бентонит, кизельгур и каменный уголь. В Африке удач­ный носитель был получен путем компостирования кукурузных кочерыжек в течение 30 недель вместе с молотым известняком, суперфосфатом и азотнокислым аммонием. Полученный ком­пост высушивали на воздухе, измельчали, просеивали, разве­шивали по 100 г в плотные полиэтиленовые мешочки и авто­клавировали.

Сегодня для поддержания жизнеспособности Rhizobium по­лучают носители из самых разнообразных веществ, но лучшим носителем все же является торф. В некоторых регионах, напри­мер в развивающихся странах, определенную ценность могут представлять дешевые местные заменители торфа.

• 9.3.5. Методы, инокуляции

Самый простой, но, наверное, наименее эффективный метод ино­куляции— смешивание сухого инокулята и семян перед посе­вом. При этом к семенам прикрепляется мало бактериальных клеток, большая их часть теряется, и необходимое условие на­несения достаточного числа клеток Rhizobium на семена не вы­полняется. Поэтому лучше вносить инокулят в виде водной кашицы. Хорошо прилипает к семенам инокулят на торфе, осо­бенно если добавить к нему водорастворимый клей (карбокси- метилцеллюлозу или гуммиарабик). К тому же при этом по­вышается выживаемость бактерий после высушивания семян.

Дражирование семян

Цель этой обработки состоит в интенсификации образования клубеньков; при этом вместе с бактериями к семенам бобовых добавляют относительно малорастворимые неорганические по­рошкообразные вещества (фосфат кальция, измельченный из­вестняк и т. п.). Хороший эффект при внедрении культуры кле­вера (Trifolium Subterraneum) на кислых почвах Австралии дало дражирование известью. Сначала семена дражировали в тонко измельченном известняке, а затем непосредственно перед высевом смешивали с влажным инокулятом на торфе. Такой способ позволяет нанести больше инокулята и увеличивает вы­живаемость бактерий на семенах. К инокуляту на торфе при этом добавляют раствор гуммиарабика (~40%), и все это тща­тельно перемешивают с семенами (например, в небольшой, чи­стой бетономешалке), добиваясь равномерного их покрытия. Затем за один прием добавляют необходимое количество кар­боната кальция (но не гидроокиси кальция, которая является слишком сильной щелочью) и продолжают перемешивание до тех пор, пока инокулированные семена не покроются ровным слоем известковой муки. Количество добавок и время обработки нужно строго контролировать, так чтобы образовались плотные гранулы, содержащие большое число жизнеспособных бактери­альных клеток. Семена после дражирования следует высевать как можно быстрее, пока число жизнеспособных клеток на них максимально.

Используемые в настоящее время инокуляты
на основе почвы

Хотя сегодня в нашем распоряжении есть хорошие инокуляты семян, их не всегда удается использовать с полной эффектив­ностью. Дело в том, что часто семена бывает необходимо об­рабатывать фунгицидами и пестицидами, а некоторые из них либо легальны для Rhizobium, либо оказывают на них небла­гоприятное воздействие. Кроме того, в оболочке семян ряда бобовых содержатся природные антибиотики. Проблемы возни­кают и при высеве семян в нагретую сухую почву: при этом бактерии могут погибнуть до того, как пройдет дождь и семена прорастут.Поэтому разумно было бы вносить Rhizobium в почву так, чтобы они находились поблизости от семян, в пределах досягаемости для развивающихся корней, но все же на некото­ром расстоянии, чтобы свести к минимуму влияние токсинов, содержащихся в семянах. Сегодня вновь привлекает к себе вни­мание инокуляция почвы, а не семян, с использованием улуч­шенных инокулятов.

Так, очень удобен инокулят на основе пористых гранул; да­же после нескольких месяцев хранения в нем остается доста­точно много жизнеспособных бактерий. Такие гранулы можно изготовить из увлажненного гипса с добавлением 0,2% натрие­вой карбоксиметилцеллюлозы, замедляющей схватывание. Бак­терии выращивают в жидкой питательной среде, к которой до­бавляют сформированные гранулы, затем их высушивают на воздухе, фасуют и в таком виде хранят.

Можно приготовить и гранулированный инокулят на основе торфа, в котором создаются условия для размножения Rhizobium. Его, как и гипсовые гранулы, можно высевать вместе с семенами или же помещать в почву под ними, если нужно за­щитить бактерии от вредного воздействия жары и сухости.

• 9.3.6. Улучшение симбиоза между бобовыми и Rhizobium

Симбиотические отношения, приводящие к фиксации азота,— это наиболее эффективный способ биологического образования аммиака, потребляемого сельскохозяйственными культурами. Влияя на них, мы сможем достичь значительного прогресса в использовании биологической фиксации азота для производ­ства пищевых продуктов. Для расширения масштабов и эффек­тивности систем фиксации азота необходимо глубже понять ге­нетику бактерий Rhizobium, чтобы не зависеть столь сильно от природных систем симбиоза, а формировать их с участием любого желаемого вида растений, употребляемых в пищу.

Генетические эксперименты
с азотфиксирующими организмами

В последние десять лет для изучения биологической азотфикса- Ции стали применять методы генетики микробов и молекулярной биологии. После того как в 1971 г. Штейхер и др. (Steicher et al., 1971) показали, что колифаг P_i можно размножать в Kleb­siella pneumoniae М5 (свободноживущая азотфиксирующая бак­терия) и трансдупировать с ее помощью nif-гены (гены азот- фиксации), появилась надежда, что генетическими методами удастся повысить способность к азотфиксации и получать более высокие урожаи.

До недавнего времени мы не знали достаточно определенно, какой из партнеров в симбиотической системе Rhizobium — бо­бовое несет nif-гены, ответственные за фиксацию азота, но в 1975 г. несколько групп ученых обнаружили, что чистым куль­турам некоторых медленно растущих видов Rhizobium присуща нитрогеназная активность. Из этих опытов следовало, что nif-гены содержатся в геноме бактерий, а не растения-хозяина. В подтверждение этого было показано, что с помощью плазми­ды возможен перенос nif-генов от R. trifolii к неспособному фиксировать азот штамму Klebsiella aerogenes. Было установ­лено, что некоторые из плазмид, несущих гены, ответственные за формирование клубеньков и фиксацию азота, относительно легко передаются от штамма к штамму Rhizobium при конъ­югации.