• 9.4.1. Роль везикулярно-арбускулярной микоризы

Корни растений в природных условиях никогда не бывают сте­рильными. На их поверхности всегда присутствует типичная для данного местообитания микрофлора, причем нередко корни бывают заражены почвенными патогенными микробами. Под действием некоторых непатогенных грибов формируются осо­бые структуры; одни грибы, размножаясь, образуют вокруг мелких корешков чехол — эктомикоризу, другие, проникая в кортикальную ткань корней, образуют эндомикоризу. В резуль­тате устанавливаются симбиотические отношения, выгодные растениям-хозяевам. Эктомикоризы, образованные грибами-базидиомицетами и аскомицетами, обнаружены у некоторых де- девьев и кустарников, в частности тех, которые произрастают в умеренном поясе северного полушария, а две из трех извест­ных разновидностей эндомикоризы встречаются только в пре­делах семейств Ericaceae и Orchidaceae. Третья из них известна под названием «везикулярно-арбускулярная микориза» (BA): при ее образовании в покровных тканях формируются харак­терные структуры. Эта разновидность микориз особенно важна для сельского хозяйства (рис. 9.3—9.5). Микориза BA, обра­зуемая грибом-фикомицетом из семейства Endogonaceae, встре­чается особенно часто в большинстве почв всех климатических зон: она присуща большей части покрытосеменных, многим го­лосеменным, а также некоторым папоротникам и печеночникам. Микориза BA найдена у большинства важнейших видов сель­скохозяйственных растений, она обычно встречается у важней­ших культур из семейств Gramineae и Leguminoseae, но не най­дена у видов семейства Cruciferae и сахарной свеклы.

Рис. 9.3. Интактные корни лука, инфицированные везикулярно-арбускулярным ми­коризным грибом (Phillips, Hayman, 1970). После освет­ления препарат был окра­шен КОН-трипановым си­ним. Корни инокулированы штаммом Endogone с жел­тыми вакуолярными спора­ми. Видны выходящие нару­жу гифы и несколько зон проникновения, но инфекция в глубине ткани слабая.

Рис. 9.4. Корень лука (см. рис. 9.3) с везикулами и ги­фами, располагающимися в коре продольно (Phillips, Hayman, 1970).

Значение BA-микоризы в сельском хозяйстве определяется тем, что она помогает растениям поглощать из почвы фосфаты. Фосфат-ионы в почве не очень подвижны, и поэтому вокруг корней их часто недостает. Гифы микоризы, вырастающие из корневого мицелия и распространяющиеся за пределы области^ где недостает фосфата, переносят его прямо в клетки хозяина. Растения со слабо развитой корневой системой, имеющие ко­роткие торчащие корни с небольшим числом волосков (напри­мер, лук и цитрусовые), обычно не очень успешно поглощают фосфаты из почвы и «полагаются» в этом на ВА-микоризу.

Рис. 9.5. Корень лука (см. рис. 9.3) (Phillips, Hayman, 1970). Видны арбускулы, ответвляющиеся от расположенных продольно гиф.

Благодаря микоризам нередко существенно улучшается рост растений на почвах, бедных фосфором. При этом также увели­чивается поступление микроэлементов, например цинка и меди. Выявлено, что концентрация гормонов роста в растениях с ми­коризой бывает выше, чем в ее отсутствие. Есть и другие пре­имущества; когда образование микоризы происходит в присут­ствии подходящих видов Rhizobium, у бобовых усиливаются образование клубеньков и азотфиксация.

Поскольку фосфатные удобрения приходится расходовать экономно, большое внимание сегодня уделяется тому, как эф­фективнее использовать преимущества BA-микоризы в растение­водстве. Хотя микоризные грибы встречаются повсеместно, .в почве, на которой предполагается выращивать новую куль­туру, может и не быть нужных их разновидностей. Они навер­няка отсутствуют в стерилизованной почве теплиц и средах для выращивания растений в горшках. Частичная стерилизация, необходимая для уничтожения патогенов и вредителей расте­ний, убивает и полезные грибы-эндофиты. Чтобы размножить в почве эндофиты или ввести их туда заново, нужна инокуляция, но здесь возникает немало сложностей, поскольку гриб не раз­вивается без растения-хозяина. Осыпающиеся с корней крупные покоящиеся споры гриба-эндофита (около 0,15 мм в диаметре) можно отсеять от почвы и поместить на среду с агаром. Они прорастут, но в отсутствие растения-хозяина, в которое прони­кает мицелий, вскоре перестанут расти. Единственный способ получения больших количеств эндофита — это выращивание его на подходящей линии растений. На самом деле инокулятом  должна служить смесь корней мицелия и спор. На рис. 9.6 по­казано, какое благотворное действие на растения оказывает внесение в почву грибов, вызывающих образование ВА-микоризы.

• 9.4.2. Инокуляция эндофитом

Выделение спор эндофита из почвы

Почву, содержащую тонкие корешки, замачивают в воде и раз­мешивают до разделения почвенных частиц, а затем процежи­вают через сито с отверстиями диаметром 500—600 мкм. Про­шедшую сквозь сито киселеобразную массу перемешивают, встряхивают и дают постоять, чтобы осели грубые минеральные частицы, после чего пропускают через другое сито, с диаметром «отверстий 70—100 мкм. Осадок на сите изучают под микроско­пом. Такой способ отсеивания дает вполне хорошие результаты, поскольку покоящиеся споры эндофита диаметром 100—200 мкм превышают по размеру крупнейшие среди грибов. Этот метод особенно хорош для легких песчаных почв, так как при избытке органики в почве обнаружить споры бывает сложно. Морфоло­гические признаки таких спор весьма своеобразны, и на них основана систематика этих грибов.

Рис. 9.6. Проростки белого клевера, растущие на нестерильном торфе, взятом с горного луга в среднем Уэльсе. Обе группы растений были инфицированы одним и тем же местным микоризным грибом, но росли плохо (слева) до тех пор, пока не была проведена инокуляция микоризным грибом, взятым с бли­жайшего горного луга той же местности (справа). Во все горшки был добав­лен суперфосфат (40 кг/га).

Другой метод заключается в выделении спор из обогати­тельной культуры, которую получают путем инокуляции опре­деленных сортов растений, выращиваемых в горшках, кусочка­ми корней с микоризой. В результате заражения в пересчете на горшок образуется гораздо больше спор (несколько тысяч), чем в полевых условиях (несколько сот на 100 г почвы), по­этому выделить их намного проще.

Получение одноразовых культур

Для получения одноразовой культуры на растениях определен­ного сорта для инокуляции корней проростков в стерильной почве берут 10—20 идентичных спор. В случае успешного зара­жения через 3—4 мес в горшке развивается гомогенная попу­ляция спор. Их можно выделить одним из описанных выше спо­собов и использовать для заражения новых партий опытных растений.

Крупномасштабное производство инокулятов

Технология, предложенная Менге и др. (Menge et al., 1977), представляет собой по сути дела модификацию только что опи­санного маломасштабного способа культивирования в горшках.. Корни растения с BA-микоризой или же инфицированную почву используют для инокуляции растения-хозяина. При этом у рас­тения-донора и растения-хозяина, для которого предназначен вырабатываемый инокулят, не должно быть общих заболеваний корневой системы. Так, инокулят для цитрусовых можно полу­чать, размножая эндофит на суданской траве; использовать для этого цитрусовые не следует.

Споры, полученные при таком способе культивирования, можно подвегнуть поверхностной стерилизации и использовать для инокуляции других линий растений той же разновидности. Убедившись, что горшечные растения свободны от болезней и вредителей, которые могли бы поразить выбранные для иноку­ляции растения-хозяева, можно провести инокуляцию послед­них содержимым горшков. При получении инокулята рекомен­дуется использовать подходящие пестициды и фунгициды, не действующие на BA-микоризу. Методы, подобные описанному, позволяют получать инокуляты в количестве, достаточном для промышленного выращивания растений с хорошо развитой BA-микоризой в горшечной культуре. И все же метод горшечной культуры малоэффективен, и таким путем трудно получить ино­куляты в количестве, необходимом для полевых опытов. Не удивительно поэтому, что наряду с ним изучаются и другие методы. Кроме того, есть надежда, что исследование физиоло­гии эндофита позволит разработать метод его выращивания в чистой культуре, без растения-хозяина, в лабораториях. Это существенно упростило бы производство инокулята, позволило бы получать более гомогенный, свободный от патогенов препа­рат. Сегодня же основой для производства инокулята остаются несущие микоризу растения.

Получение чистых инфицированных корней

В настоящее время изучается возможность получения чистых корней, инфицированных эндофитом BA (с помощью метода питательной пленки; разд. 9.2). Опубликованы результаты пер­вых опытов, в которых при производстве инокулята использо­вали фасоль (Phaseolus vulgaris) и кукурузу (Zea mays). Спо­ры или корешки с микоризой, завернутые в небольшие кусочки гигроскопичного материала, помещали между корнями, где цир­кулировал питательный раствор, и получали гораздо более чи­стые инфицированные корни, чем при выращивании в почве,, но эндофит распространялся в корневой массе медленно. Когда такие корни с микоризой применяли для инокуляции в опытах с проростками салата, лука, фасоли и кукурузы, наблюдалось нормальное образование BA-микориз. При инфицировании про­ростков фасоли и салата культурами трех разных видов эндо­фитов рода Glomus, полученными с помощью метода питатель­ной пленки, во всех случаях образовывались видоспецифичные микоризы. Каждый препарат данного инокулята был не менее эффективен, чем препарат такой же массы, полученный методом горшечной культуры. При высушивании на воздухе инфекционность уменьшалась, но инактивации препарата не происходило (Elmes₁ Mosse, 1980).

Метод питательной пленки хорош тем, что можно строго контролировать условия роста и видоизменять их так, чтобы микориза развивалась успешно, без помех со стороны коллои­дов почвы. Так, опыты, о которых речь шла выше, показали, «что для хорошего развития проростков кукурузы и микоризы необходимо присутствие 5,6 мг/л железа в форме NaFe-ЭДТА; при концентрации азота в циркулирующем растворе И мг/л (95% в форме NO₃^- и 5% в виде NH₄+) наблюдалось подав­ление заражения эндофитом, но если концентрация азота в рас­творе была 1 мг/л, то заражение протекало нормально. Таким образом, этот метод весьма перспективен как для изучения ми­коризных заражений, так и при крупномасштабном производ­стве инокулятов для полевых опытов и на продажу.

• 9.4.3. Методы инокуляции

Инокулировать BA-эндофитами молодые многолетние растения, например сеянцы деревьев или черенки, относительно просто, особенно если выращивать их в контейнерах. Несколько грам­мов неочищенного инокулята, полученного из горшечной куль­туры растения-хозяина, либо добавляют в среду, либо помеща­ют его поблизости от молодых корней так, чтобы до пересадки при участии эндофита успела образоваться мощная микориза. Те, кто занимается разведением лесов и цитрусовых, все более убеждаются, что это очень эффективный метод.

В практику сельского хозяйства инокуляция полевых куль­тур BA-эндофитами не внедрена, но в опытах используется ши­роко. Этот метод хорош для выращивания многолетних культур в контейнерах, но не нашел применения для инокуляции в по­левых условиях, так как препарата нужно очень много. На гектар приходится вносить около 2—3 т неочищенного инокуля­та, а получить такие количества методом горшечной культуры растения-хозяина практически невозможно. Даже при работе на небольших опытных делянках для получения хорошего ре­зультата следует вносить ценный инокулят очень аккуратно. Рассмотрим один  пример такого рода.

В опытах с красным клевером (Trifolium pratense) на Ротам- стедской станции в 1979 г. было проведено сопоставление че­тырех способов инокуляции. Для заражения использовали не­очищенные препараты (растение-хозяин с почвой), содержащие эндофиты двух типов. Инокулят вносили: 1) под семена в бо­розды; 2) разбрасыванием, с заделкой граблями вместе с се­менами; 3) в форме многосеменных гранул объемом около 1 см³. По четвертому методу, называемому «мокрым высевом», неочи­щенный инокулят обогащали, отмывая его на сите, суспендиро­вали в 4 %-ном растворе метилцеллюлозы вместе с пророщенны­ми семенами и вносили эту кашицу в борозды. Через девять, месяцев выяснилось, что второй метод дает плохие результаты, так как BA-микориза образовывалась всего у 5—10% расте­ний — примерно у такого же их числа, как и в контроле без: инокуляции, когда она формировалась при участии природных эндофитов почвы. При внесении гранул микориза образовыва­лась чаще, приблизительно в 25% случаев, но наилучшие ре­зультаты были получены при внесении инокулята в борозды или при «мокром высеве». И в том и в другом случае микориза формировалась у большинства растений (65—70%).

Мокрый высев, по-видимому, наиболее удобен для проведе­ния инокуляции в полевых условиях, так как при этом нужно- меньше препарата, чем при его внесении другими способами. Кроме того, в метилцеллюлозный гель можно добавлять и дру­гие микроорганизмы, например Rhizobium. Использование гра­нул также имеет свои преимущества, поскольку с семенами и инокулятом можно вносить одновременно большие количества- малорастворимых веществ, например извести (Hayman et al.,. 1981).