• 9.5.1. Основы биологического контроля

Уже в самом начале развития микробиологии стало известно, что одни микроорганизмы могут подавлять рост других. Наи­более важным результатом интенсивных исследований в этой области было, наверное, открытие антибиотиков и разработка способов их применения в клинике. Большое внимание привлек­ла к себе и сама возможность использования одних микроорга­низмов для регуляции численности популяции других благодаря действию антагонистических или конкурентных механизмов. К сожалению, в ходе этих исследований почти ничего важного для сельского хозяйства открыто не было. Тем не менее сама идея такого биологического широкомасштабного контроля про­должает привлекать внимание ученых.

Биологический контроль осуществляется в природе и помо­гает предотвращать болезни растений, но мы далеко не всегда понимаем, каков его механизм и как им- можно управлять а пользой для сельского хозяйства. Успехи в этой прикладной области исследований весьма незначительны, вне всякого со­мнения потому, что слишком мало усилий предпринималось для изучения поведения смешанных популяций микроорганизмов в почве и на поверхности растений. Есть, однако, и примеры си­стем биологического контроля, которые разработаны до такого уровня, что их не без основания можно считать биотехнологи­ческими.

• 9.5.2. Примеры биологического контроля

Антагонистическое действие Trichoderma

Об антагонистической активности гриба Trichoderma известно давно. Если внести во влажную почву значительное количество Trichoderma Hgnorum, то он подавит выпревание проростков (болезнь «черная ножка»), главным образом благодаря дейст­вию токсина, который можно выделить из фильтратов культур гриба. Было показано, что к этому эффекту причастен и прямой паразитизм гриба. Известно, что другие виды Trichoderma всту­пают в антагонизм или прямо паразитируют на многих грибах и способны существенно снижать заболеваемость, вызываемую рядом почвенных патогенов растений. Некоторые виды Tricho- derma вполне могут использоваться в системах биологического контроля. В работе Уэлса и др. (Wells et al., 1972) сообщалось, что в полевых условиях Trichoderma harzianum подавляет забо­левания стеблей и корней, вызываемые Sclerotium rolfsii, если вносить его в почву в больших количествах (1 : 10, по объему). Бэкмен и Родригес-Кабана (Backman, Rodriguez-Kabana, 1975) предложили использовать для инокуляции гранулированный но­ситель из диатомовой земли, пропитанный 10%-ным раствором мелассы: он способствовал росту Trichoderma harzianum и его было легко рассеивать. Применение этого инокулята позволяет бороться с болезнями, вызываемыми Sclerotium rolfsii в поле­вых условиях. На 1 га вносили 140 кг гранул, и это было вы­годней, чем обработка пестицидами.

В условиях теплиц Trichoderma harzianum сдерживает вы­превание проростков фасоли и редьки, но целесообразность его применения в этом качестве в полевых условиях не установ­лена. Trichoderma harzianum оказывает ингибирующее действие на Rhizoctonia solani и защищает проростки инокулированных им семян гороха и редьки от выпревания, вызываемого Rhizoc- Ionia solani или Pythium spp.

Грибная гниль

В Европе базидиомицет Fomes annosus является основным воз­будителем сердцевинной гнили хвойных, особенно ели Picea abies. Он поражает также лиственные породы и лесоматериалы. Заражение этим грибом сосновых пней тоже нежелательно, так как инфекция распространяется на их корни, а затем и на кор­ни соседних, здоровых деревьев. Заселение пней этим грибом можно предотвратить, засеяв их спорами другого гриба-бази- диомицета, Peniophora gigantea. Гриб разрастается на пнях, и, конкурируя с Fomes annosus, подавляет развитие сердцевин­ной гнили. Этот способ применяется в Англии и США, где нуж­ный инокулят имеется в продаже.

Скорее всего любой организм, избранный в будущем для осуществления биологического контроля, будет действовать на патогены двояким способом: либо образуя вещества-ингибито­ры, либо конкурируя за питательные вещества, либо проявляя и тот и другой эффект. Многие сообщения на эту тему пред­ставляют сегодня лишь научный интерес; оценить значение их для практики нет возможности.

• 9.5.3. Корончатые галлы и борьба с ними

Природа заболевания

Некоторые разновидности почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens способны внедряться в ткани двудольных растений через раневые поверхности и вызывать образование опухолей — корончатых галлов. Хотя об этом явлении известно с 1907 г., механизм патогенности удалось установить совсем недавно. Бы­ло показано, что клетки патогенных штаммов этой бактерии со­держат крупную плазмиду (Ti) с мол. массой от 90∙ IO⁶ до 150∙ IO⁶₁ зависящей от того, какие иные свойства, кроме пато­генности, в ней закодированы. Имеются данные, что превраще­ние нормальных клеток растения в опухолевые обусловлено переносом в них плазмиды Ti и включением ее в хромосомную ДНК хозяина.

Клетки опухоли растений могут расти на питательной среде в форме недифференцированной массы, но иногда из них обра­зуются тератомы, которые порождают внешне нормальные рас­тения. Эти тератомы все еще содержат плазмидную ДНК и син­тезируют опины, но обычно опухоли у них отсутствуют и могут развиваться либо спонтанно, либо после повреждений.

Было показано, что плазмиду Ti методами генетической ин­женерии можно модифицировать, в результате чего она приоб­ретает способность переносить чужеродную ДНК в растение- хозяина. Существование жизнеспособных тератом позволяет надеяться, что на основе такого плазмидного переноса ДНК можно получить стабильно трансформированные растения.

Любопытно, что хотя тератомы могут цвести и образовывать семена, выращенные из таких семян растения не несут плазми­ды Ti. Видимо, она каким-то образом утрачивается при мейозе. Сегодня содержащие ДНК Ti-плазмид растения размножают только вегетативно.

Agrobacterium tumefaciens не инфицирует однодольные рас­тения, и поэтому векторы на основе плазмиды Ti нельзя исполь­зовать в генетических экспериментах с культивируемыми зла­ками.

Биологический контроль

В Австралии корончатые галлы очень часто встречаются у мин­даля, персиков и роз, и в 1973 г. садоводы-профессионалы раз­работали метод защиты этих культур, состоящий в том, что саженцы (проростки, трансплантаты и черенки) смачивают в суспензии бактерий, которые подавляют рост патогена. Такая обработка почти полностью предотвращает заболевание и яв­ляется первым примером практического использования бакте­рий для борьбы с корончатыми галлами.

Не все агробактерии являются патогенами. Многие их штам­мы, выделенные из почвы питомников, где выращивали косточ­ковые культуры, были непатогенными, но отличить их от пато­генных по какому-либо иному, чем степень патогенности, приз­наку было невозможно. Для почвы вокруг больных растений отношение патогенных штаммов к непатогенным было высоким, а для почвы вокруг здоровых растений — низким.

Изучение взаимоотношений между двумя формами в лабо­ратории, когда в качестве типичной непатогенной формы был взят штамм 84, показало, что если в опытах с проростками помидоров или персиков отношение числа патогенных штаммов к непатогенным было меньше или равно 1, то галлы не разви­вались. Конечная цель этих экспериментов заключалась в соз­дании условий, при которых указанное отношение для поверх­ности корней не превышало бы единицы, для чего предприни­мались попытки повысить содержание непатогенных форм на семенах или корнях молодых деревьев при пересадке. В опытах с персиками путем инокуляции корней удалось защитить около 95% растений, росших год на почве без патогенов, и около. 99%, когда инокулировались и семена, и корни.

Способ обработки

Сама обработка крайне проста: семена, черенки или корни мо­лодых растений погружают в суспензию бактерий, а затем не­медленно высаживают. Хорошие результаты получают при плот­ности суспензии порядка IO⁷—IO⁸ бактерий/мл; при этом забо­леваний практически не наблюдается. В Австралии, Новой Зе­ландии и США такие инокуляты имеются в продаже; некоторые из них делают на основе торфа, как и в случае Rhizobium, .а другие представляют собой культуры, выращенные на агаре.

Механизм контроля

Штамм 84 синтезирует высокоспецифичный антибиотик, кото­рый подавляет рост большинства патогенных агробактерий. Это нуклеотидный бактериоцин, известный под названием агро­цин 84. В клетках этого штамма содержится небольшая плаз­мида с мол. массой 30∙ 10®, детерминирующая синтез агроцина, и крупная плазмида с мол. массой 124∙10®, в которой закоди­рована способность использовать нопалин — необычную амино­кислоту типа опина, присутствующую только в тканях корон­чатых галлов. Крупная плазмида Ti, которая несет гены пато­генности и чувствительности к агроцину, в этих клетках отсут­ствует. Когда патогенный штамм выращивают в присутствии агроцина 84, образуется небольшое количество устойчивых к не­му колоний, как правило непатогенных. При этом, видимо, либо теряется плазмида Ti, либо происходит мутация (делеция), ко­торая проявляется не только в форме устойчивости к агроци­ну 84, но и в потере патогенности.

Проблемы борьбы с корончатыми галлами

К сожалению, метод борьбы с корончатыми галлами с помощью штамма 84 не удается распространить на все подверженные этой болезни культуры, так как некоторые из них, например винный виноград, инфицируются штаммами, устойчивыми к аг­роцину 84. Кроме того, в некоторых полевых опытах из галлов были выделены патогенные, образующие агроцин 84, штаммы. Все известные синтезирующие агроцин 84 штаммы устойчивы к этому бактериоцину, так что бороться с ними с помощью штамма 84 невозможно.

Опыты показали, что такие устойчивые патогенные штаммы могут появляться в результате конъюгации между штаммом 84 и патогенными штаммами. В ходе конъюгации две плазмиды штамма 84 передаются независимо друг от друга, в то время как плазмида Ti патогена не обязательно проникает в клетку- реципиент. Из шести возможных трансконъюгатов три содержат Ti-плазмиду, а два из них к тому же и небольшую плазмиду,, в которой закодирована способность к синтезу агроцина 84. В лаборатории конъюгация происходит только в присутствии нопалина, а в природе, по-видимому, непосредственно в самой ткани корончатого галла либо вблизи него. Можно предполо­жить, что иногда при этом появляются патогенные штаммы,, образующие агроцин. Ясность в этот вопрос будет внесена лишь тогда, когда будет обнаружен или создан методами генетической инженерии мутант штамма 84, неспособный к конъюгации с па­тогеном или же к переносу плазмиды с маркером агроцин 84.