Сохранение разнообразия форм жизни – важнейшая проблема, с которой столкнулось современное человечество. Еще Г. Ф. Гаузе доказал, что устойчивость сообщества тем выше, чем больше число составляющих его видов. Следовательно, сохранение биоразнообразия – один из важнейших механизмов стабильности жизни на Земле. Кроме того, для обеспечения питанием растущей численности населения нашей планеты необходимо выведение новых, более продуктивных сортов сельскохозяйственных растений, а для успешной селекции важен постоянный приток генов из новых источников. Традиционным источником генетического материала служат дикие виды растений. Однако в связи с увеличением числа городов, расширением сельскохозяйственных угодий, вырубкой лесов, ухудшением экологии эти виды постепенно вытесняются, а многие из них находятся на грани вымирания, поэтому их необходимо сохранить.

8.1. СПОСОБЫ СОХРАНЕНИЯ ГЕНОФОНДА

Существует несколько способов сохранения генофонда живых организмов: заповедники, национальные парки, зоопарки. Заповедники и национальные парки – наиболее совершенная форма резерватов. Основной недостаток этих формирований состоит в том, что они требуют значительных территорий. Для сохранения 90–95 % существующих видов живых организмов территория заповедников должна занимать около 30 % всей площади суши, отдать которые при современной плотности населения и потребности в сельскохозяйственных угодьях просто невозможно. Зоопарки и питомники требуют меньших территорий. Однако возвратить выращенных там животных в дикую природу удается достаточно редко. В последнее время большое внимание уделяется созданию и развитию новых способов: пересадочных коллекций каллусных клеток, депонированию культур клеток и, наконец, криосохранению, т.е. хранению объектов при очень низкой температуре, обычно это температура жидкого азота (-196 °С).

Однако современное понятие «криоконсервация» несколько расплывчато из-за разнообразия объектов, каждый из которых требует своих температур и условий хранения. Этот метод позволяет сохранять соматические и половые клетки, семена растений, эмбрионы и личинки животных. Разработаны технологии длительного сохранения с помощью криоконсервации генетического материала разных объектов: грибов, споровых растений, высших растений, некоторых млекопитающих, птиц, амфибий, рыб, иглокожих, моллюсков, насекомых, ракообразных.

Криосохранение имеет существенные преимущества по сравнению с остальными методами. При сохранении в глубоко замороженном состоянии полностью прекращается обмен веществ, отсутствуют значительные физико-химические молекулярные изменения не только в клетке, но и в окружающей водной среде. Таким образом, сохраняется генофонд, а следовательно, все свойства замороженного объекта.

В 1992 г. в Рио-де-Жанейро большинством государств мира была принята Медународная конвенция по сохранению биологического разнообразия, созданы Национальные программы по сохранению природных генетических ресурсов. Одно из обязательных условий этих программ – создание банков зародышевой плазмы: семян, меристем, пыльцы, зародышей, культур тканей, клеток и другого генетического материала. Такие банки долговременного хранения геномов позволяют:

• собирать и сохранять редкие и исчезающие виды;
• сохранять морфологическое, физиологическое и адаптационное разнообразие внутривидовой изменчивости по культурным и дикорастущим видам;
• служить незаменимыми источниками материала для селекции культурных растений;
• обеспечивать размножение редких и исчезающих видов дикорастущих растений и возвращение их в природу;
• создавать искусственные популяции и фитоценозы.

8.2. КРИОКОНСЕРВАЦИЯ СЕМЯН РАСТЕНИЙ

Семена всех растений в зависимости от продолжительности их жизни делят на три группы:

1) микробиотики, сохраняющие жизнеспособность до 3 лет;
2) мезобиотики – от 3 до 15 лет;
3) макробиотики – от 15 лет и более.

Для продления жизни семян разработано достаточно много технологий. В первую очередь это касается семян культурных растений. Время их жизни увеличивают благодаря снижению температуры хранения (низкие положительные температуры), снижению влажности окружающей среды, герметизации при хранении, применению искусственных газовых сред и, наконец, криосохранению. Очень важно разработать технологии долговременного хранения семян, относящихся к группе микробиотиков, среди которых немало хозяйственно важных (цитрусовые), декоративных (каштан, гербера) и лекарственных (дуб, каштан) растений.

В настоящее время для продления жизни семян любых растений чаще всего применяют хранение при пониженных температурах:

1) низкие положительные температуры (4 ± 1 °С);
2) неглубокое замораживание (от –10 до –20 °С);
3) глубокое замораживание (криоконсервация) в жидком азоте при температуре -196 °С или в парах над ним -160 °С.

Семена и некоторые другие элементы зародышевой плазы хранят, используя в большей или меньшей степени все три температурных режима, в специализированных банках, сеть которых за последнее время сильно увеличилась. Если в середине 70-х годов XX в. таких банков насчитывалось немногим более 50, то сейчас их более 1300. В банках хранится более 6 млн образцов: 48 % – новые сорта и селекционные линии; 30 % – старые сорта; 15 % – дикорастущие родичи культурных растений и сорные виды. Например, в Швейцарии, в 24 государственных и частных банках сохранено 17 тыс. образцов семян кормовых, плодовых, лекарственных и ароматических растений. Большое внимание сбору и хранению лекарственных растений уделяют в Австрии и Китае. Создаются специализированные банки зародышевой плазы по древесным видам.

Самым дешевым и экологически безопасным было признано хранение семян в шахтах в вечной мерзлоте. Такие эксперименты проводились в Якутске в подземной лаборатории Института мерзлотоведения Сибирского отделения РАН. Хранение в герметичных сосудах в течение трех лет семян пшеницы, ячменя, овса, ржи, овощных растений, кормовых трав при температуре –2,7 °С не снижало их жизнеспособности. Однако вечная мерзлота есть не везде, поэтому глубокое замораживание и замораживание до сверхнизких температур (–200 °С и ниже) удобнее всего в техническом отношении. Кроме того, при этих температурах практически прекращаются все метаболитические процессы, что позволяет хранить растительный материал очень долго без существенных изменений. Сейчас изучена всхожесть семян после глубокого замораживания у более чем 400 видов растений, и уже эти результаты показывают, что устойчивость семян к низким и сверхнизким температурам видоспецифична, а также может зависеть от времени и места сбора. Разные растения неодинаково реагируют на температурный фактор. Только недавно удалось добиться успешного криосохранения семян шести форм наземных и эпифитных тропических орхидей, что открывает возможность создания криобанка сеян этих исчезающих растений (Т. В. Никишина и др., 2001). Криоконсервация семян некоторых культурных бобовых растений рекомендуется для повышения их всхожести. Глубокое замораживание семян вишни и черешни запатентовано как способ их долговременного хранения. Реакция на низкие температуры у представителей семейства лилейных немного различалась: у ландыша после криосохранения увеличивалась частота хромосомных аберраций и снижалась жизнеспособность; у семян растений рода купена жизнеспособность также снижалась, но частота хромосомных аберраций не изменялась. У некоторых растений повышение частоты хромосомных аберраций наблюдалось даже при неглубоком замораживании. Семена таких растений, как жимолость, пиретрум, золотарник обыкновенный, частично погибают при любом замораживании (В.Л.Тихонова, 1999). Поэтому перед внедрением криоконсервации необходимо проводить всесторонние исследования ее всевозможных последствий, так как они могут быть весьма разнообразны.

8.3. КРИОКОНСЕРВАЦИЯ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ

Сущность метода криосохранения сводится к замораживанию специально подготовленных растительных клеток при использовании криопротекторов – веществ, ослабляющих повреждения клеток при замораживании и оттаивании. В настоящее время известны два метода криосохранения: программное {медленное) и сверхбыстрое замораживание. Программное замораживание изучалось уже давно, поэтому оно довольно широко применяется для сохранения животных и растительных клеток. Разработка сверхбыстрого замораживания началась сравнительно недавно, однако считается, что именно этот метод со временем станет наиболее перспективным.

Трудности криосохранения растений связаны со спецификой растительных клеток. Клетки растений имеют большие размеры (в культуре тканей они изменяются от 15 до 1 000 мкм), прочную целлюлозную стенку и вакуоли. Причем именно степень вакуолизации играет основную роль в устойчивости клеток к действию низких температур. В зрелой клетке центральная вакуоль занимает до 90 % общего объема клетки, т. е. клетка представляет собой как бы резервуар с водой, которая необходима для ее нормальной жизнедеятельности. Поэтому основные факторы, способные привести клетку к гибели при замораживании, – это образование льда и дегидратация. Обычно кристаллы льда сначала образуются во внешнем растворе вокруг клеток. Максимальная скорость их роста в зависимости от состава раствора находится в пределах температур от –20 до –60 °С. При температуре –140 °С рост кристаллов льда совершенно прекращается. Следовательно, и при замораживании, и при оттаивании клеткам очень важно с оптимальной скоростью «проскочить» температуру образования льда. Кристаллы внеклеточного льда могут механически разрушать клетки. Кроме того, они играют водоотнимающую роль, что приводит к значительной дегидратации клетки и возможной ее гибели от осмотического стресса. При очень быстром замораживании лед может образовываться и внутри клеток, что ведет к разрушению в ней многочисленных мембран.

Избежать кристаллизации льда помогла бы витрификация воды, т.е. затвердение ее в аморфном состоянии. Получить витрификацию чистой воды практически невозможно. Но в коллоидных растворах скорость образования центров кристаллизации и роста кристаллов льда снижается и повышается температура, при которой их рост прекращается. Все это облегчает витрификацию. Добавление криопротекторов также затрудняет кристаллизацию льда и способствует витрификации.

Наиболее известны такие криопротекторы, как диметилсульфоксид (ДМСО), различные сахара, глицерин, этиленгликоль и их производные. Действие криопротекторов состоит в снижении количества свободной воды, повышении вязкости раствора. Все криопротекторы делят на две группы: проникающие и непроникающие. Это разделение достаточно условно. Так, глицерин – первое вещество, определенное как криопротектор, может проникать в клетку, если его добавлять при комнатной температуре, или выступать как непроникающее соединение, если его добавлять при температуре 0 °С. Принято считать, что непроникающие криопротекторы специфически влияют на мембрану, повышая ее проницаемость. Применение сильных, проникающих в клетку криопротекторов ограничено их токсичностью. Обычно используют смеси криопротекторов, так как в них токсичность одного из веществ снижается за счет присутствия другого.

Жизнеспособность клеток после замораживания зависит не только от предупреждения образования льда, но и от их состояния. Крупные вакуолизированные клетки погибают гораздо чаще, чем мелкие меристемоидные. Поэтому на этапе подготовки культуры к замораживанию ее культивируют в условиях, способствующих образованию мелких клеток и синхронизации их деления. Кроме того, концентрирование клеток в культуре, т. е. увеличение ее плотности, способствует повышению выживаемости клеток после замораживания.

Таким образом, криосохранение достаточно надежно обеспечивает сохранение генофонда. Перспективность этого метода подтверждается возобновлением после хранения в жидком азоте суспензионных культур моркови, явора, кукурузы, риса, сахарного тростника; каллусных культур тополя, маршанции, сахарного тростника; андрогенных эмбриоидов – беладонны, табака и др. Из восстановленных после замораживания культур моркови и табака удалось регенерировать целые растения. После быстрого замораживания сохранили жизнеспособность меристемы земляники, малины, гвоздики, томатов, картофеля и ряда других растений. Однако для криосохранения требуется сложная работа по подбору условий, обеспечивающих выживание клеток и, следовательно, возможность последующей регенерации из них целых растений. Необходимо учитывать генетические и морфофизиологические особенности клеток, способность к закаливанию, уровень проницаемости клеточных мембран, подбор криопротекторов, скорость снижения температуры при замораживании, условия оттаивания.