В середине 1960-х гг. многие пророчили возникновение «новой биологии», развитие прикладных областей которой существенно изменило бы процедуры получения целого ряда химических и фармацевтических средств. Эта «революция» стала реальностью благодаря многочисленным открытиям последующего десятилетия в биохимии, генетике, в биологии клетки и молекулярной биологии. Столь смелые надежды основывались в первую очередь на установлении структуры и функции определенных ферментов, их использовании в иммобилизованной форме прежде всего микробиологами и энзимологами-в разнообразных производственных процессах, а также на том, что специалисты в области молекулярной генетики открыли способ модификации ДНК и перенесения ее из одних организмов в другие. В самом деле, благодаря стремительному прогрессу вирусологии (в исследованиях бактериофагов), бактериологии (в углубленном изучении физиологии, генетики и молекулярной биологии кишечной палочки, а также в изучении плазмид), молекулярной генетики (в установлении генетического кода) и энзимологии (в открытии ферментов рестрикции) были накоплены знания и разработаны методы генной инженерии. Одновременно были по достоинству оценены и потенциальные возможности этих методов.
Биотехнология, в сущности, не что иное, как использование культур клеток бактерий, дрожжей, животных или растений, метаболизм и биосинтетические возможности которых обеспечивают выработку специфических веществ. Согласно определению Европейской биотехнологической федерации, созданной в 1978 г., биотехнология на основе применения знаний и методов биохимии, микробиологии, генетики и химической техники позволяет извлекать выгоду в технологических процессах из свойств микроорганизмов и клеточных культур. Она создает возможность получения с помощью легко доступных и возобновляемых ресурсов тех веществ и соединений, которые важны для жизни и благосостояния людей.
В промышленном масштабе подобная биотехнология представляет собой уже биоиндустрию (табл. 1). Последняя включает в себя, с одной стороны, отрасли, в которых биотехнологические методы могут с успехом заменить широко используемые в настоящее время традиционные методы, а с другой-отрасли, в которых биотехнология играет ведущую роль. Среди первых в области химической промышленности назовем синтез искусственных приправ, полимеров и сырья для текстильной промышленности, в области энергетики получение метанола, этанола, биогаза и водорода, в области биометаллургии извлечение некоторых металлов. Во второй группе отраслей биотехнология охватывает производство продовольствия (широкомасштабное выращивание дрожжей, водорослей и бактерий для получения белков, аминокислот, витаминов, а также для использования их ферментов); увеличение продуктивности сельского хозяйства (клонирование и селекция сортов растений, исходя из тканевых и клеточных культур, производство биоинсектицидов); фармацевтическую промышленность (разработка вакцин, синтез гормонов, интерферонов и антибиотиков); защиту окружающей среды и уменьшение ее загрязнения (очистка сточных вод, переработка хозяйственных отходов, изготовление компоста, а также производство соединений, поддающихся расщеплению микроорганизмами).
Таблица 1. Схематическое распределение основных продуктов биотехнологии
Эта эволюция биологии неотделима от главных этапов в развитии знаний об основополагающих механизмах жизнедеятельности.
В 1953 г. Сэнгер установил полную структуру белка инсулина, а Уотсон и Крик доказали, что дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) построена из двух нитей. В 1963 г. Ниренберг расшифровал генетический код, который оказался универсальным как для бактерий, так и для высших организмов вплоть до человека. Тем самым генетическая информация и ее смысл, т. е. взаимосвязь между генетическим кодом и структурой белков, стали доступны для изучения.
Второй важнейший этап был пройден в 60-х гг., когда в результате усовершенствования аналитических методов, предложенных Сэнгером, и развития деградации белков по Эдману и Бэггу (1%7) появилась возможность автоматически определять структуру белков. Стали производиться приборы, позволяющие определять аминокислотные последовательности белков. К 1978 г. были установлены последовательности (первичные структуры) 500 с лишним белков, которые составили «атлас белков», хранящийся в компьютерных системах.
Вслед за изучением белков не меньшие успехи были достигнуты и в исследованиях нуклеиновых кислот. В 1976 г. Гилберт и Максам в Гарвардском университете, а также Сэнгер разработали быстрый метод химического анализа ДНК; появилась реальная возможность определять последовательность до 1000 нуклеотидов в неделю силами одного исследователя. В 1982-1985 гг. стало возможно создать прибор для автоматического анализа нуклеиновых кислот (а значит, генов). Анализ ДНК позволяет дедуцировать, основываясь на генетическом коде, аминокислотные последовательности белков, синтез которых находится под контролем соответствующих генов. С помощью созданного в результате совершенствования анализа белков микроанализатора Худа Ханкепиллера (Калифорнийский технологический институт, 1980) за день удается определять последовательность из 100-200 аминокислот, причем для этого требуется всего 10 нг белка (1 нг = 10–9 г).
Третий важнейший этап - это синтез биополимеров по установленной структуре. Первые коммерческие приборы, производящие автоматизированный синтез полипептидов, были разработаны на основе исследований Меррифилда в 1963 г. Они используются в исследовательских лабораториях и в фармацевтической промышленности.
После определения структуры фенилаланиновой транспортной РНК (тРНК) Корана (первоначально в Висконсинском университете, а затем в Массачусетском технологическом институте в 1970-1972 гг.) произвел синтез ДНК (иначе говоря, гена), соответствующей этой тРНК [7]. Впоследствии Корана и его сотр. синтезировали ген предшественника тирозиновой тРНК Escherichia coli . Использованный ими метод, названный фосфодиэфирным, вскоре был заменен на фосфотриэфирный, который значительно удобнее, поскольку промежуточные продукты гораздо легче поддаются очистке (Летсингер и Огилви, 1967; Риз и Сэфхилл, 1968, см. [10]). Еще лучшие результаты дает фосфитный метод .
Итакура с сотр. в Национальном медицинском центре «Хоуп» (Дуарте, Калифорния) в 1977 г. с успехом синтезировали ген соматостатина, а в 1979 г.-ген инсулина человека. Эти гены были введены в клетки В. coli с использованием методов генной инженерии, разработанных в фирме «Генентек» Бойером с сотр. Так впервые была продемонстрирована экспрессия гена человека в бактериальных клетках.
Выделение промежуточных продуктов при синтезе олигонуклеотидов сопряжено с множеством операций, поэтому процесс синтеза проводили на твердом носителе, как и при получении полипептидов. Растущую цепь олигонуклеотида одним концом соединяют с носителем, а ее наращивание осуществляют на другом конце. Избыток реагентов и побочные продукты синтеза легко удаляются простой отмывкой. Эти методы характеризуются хорошим выходом. Созданы автоматические «синтезаторы», позволяющие проводить более или менее автоматическое наращивание нуклеотидной цепи, связанной с носителем. Присоединение каждого последующего нуклеотида происходит каждые полчаса, а вся процедура в целом может контролироваться компьютером (т. е. программой, предусматривающей хранение, дозировку, перекачивание, впрыскивание в реакционную камеру, отмывку растворителей и реагентов, а также контроль запрограммированной последовательности операций). Процесс завершается отделением полинуклеотида от смолы, после чего полинуклеотид необходимо очистить, а также подтвердить его последовательность; это занимает примерно неделю работы.
В 1980 г. Итакура создал первый синтезатор генов. Вскоре после этого компания «Био-Лоджикалс» (Торонто) выпустила прибор, сконструированный Огилви в Университете Мак-Гилла в Монреале; прибор был способен в течение 6 ч синтезировать 12-членный олигонуклеотид с заданной последовательностью. В 1981 г. Худ, изобретатель белкового микроанализатора, создал другой автомат, выпускаемый фирмой «Генетик инстраментс».
Компания «Био-Лоджикалс» намеревалась до конца 1982 г. выпустить две модели синтезаторов олигонуклеотидоводну полуавтоматическую, а вторую в комплексе с компьютером. В 1982 г. цена этих приборов на американском рынке составляла 36 000-39 500 долл.
Синтез фрагментов нуклеиновых кислот, который в 1981 г. проводили наращиванием нуклеотидов один к одному, вероятно, будет быстро усовершенствован за счет соединения заранее полученных более длинных последовательностей согласно заданной программе. Если в 1979 г. для синтеза гена длиной в 120 нуклеотидов требовалось два года, то уже в 1981 г. эту задачу можно было решить всего за три дня с помощью одного из упомянутых приборов. Как было установлено, количество генетической информации, которую расшифровывают в исследовательских лабораториях, каждый месяц возрастает на 15%, что позволяет за год увеличить число известных нуклеотидных последовательностей в четыре раза. Дэйхоф из Национального фонда медико-биологических исследований в Вашингтоне, составивший Атлас аминокислотных последовательностей белков, к концу 1980 г. ввел в память компьютера опубликованные в мировой научной литературе последовательности генов вирусов, бактерий и человека, составляющие в общей сложности, возможно, более 350 000 нуклеотидов.
Полный синтез ДНК, содержащей специфическую последовательность нуклеотидов, отличается от репликации ДНК in vivo или in vitm, катализируемой ДНК-полимеразой. Последняя нуждается в матрице, которая представляет собой двунитевую молекулу ДНК и содержит точно воспроизводящуюся информацию, но не служит источником новой информации. При химическом синтезе имеется возможность вносить изменения в последовательность нуклеотидов и изучать их влияние на биологическую функцию синтезированной таким способом молекулы ДНК (или РНК). Химический синтез создает предпосылки для изучения регуляции синтеза нуклеиновых кислот, а также регуляции транскрипции РНК на матрице ДНК. В процессе транскрипции решающая роль принадлежит определенным нуклеотидным последовательностям, которые называются промоторами. Определено уже несколько сотен таких последовательностей, однако не исключено, что единственным способом выяснения роли различных частей промотора в его узнавании РНК-полимеразой, образовании прочных комплексов между ферментом и ДНК и в инициации транскрипции станет систематическая модификация при синтезе последовательности одного из промоторов.
Систематически вводя различные нуклеотиды в последовательность при химическом ее синтезе, иными словами, фактически получая точковые мутации, можно проследить за изменениями функции такой последовательности в клетке. Именно таким способом в лаборатории Шамбона (Университет Луи Пастера в Страсбурге) в предполагаемом промоторном участке гена, кодирующего один из полипептидов белка куриного яйца (кональбумин), был заменен единичный нуклеотид. Эта мутация позволила установить роль специфической нуклеотидной последовательности в регуляции синтеза информационной РНК-последовательности, называемой блоком Голдберга Хогнесса.
Полученные в результате химического синтеза полинуклеотиды могут быть использованы для выделения с помощью гибридизации соответствующей информационной РНК, кодирующей структуру белка. Молекулярные пробы для гибридизации получают следующим способом: по известной последовательности участка молекулы . исследуемого белка на основе генетического кода можно предсказать различные последовательности ДНК, способные кодировать эту аминокислотную последовательность; синтезированные полинуклеотиды смешивают с общей РНК из экстракта клетки, в которой синтезируется данный белок; между полинуклеотидной пробой и информационной РНК, последовательности которых почти полностью комплементарны, происходит гибридизация; на выделенной таким способом матричной РНК обратная транскриптаза позволяет синтезировать ДНК-копию, которая по структуре и длине в значительной степени соответствует гену белка.
Помимо таких ДНК-проб в специализированных лабораториях синтезируются и другие последовательности: промоторы, необходимые для транскрипции матричной РНК на ДНК и обладающие высоким сродством к РНК-полимеразе; линкерные последовательности; последовательности ДНК, необходимые для трансляции.
Стремительный прогресс биологии, особенно ярко проявившийся в бурном развитии генной инженерии, тесно связан с необычайным усовершенствованием аналитических методов, таких, как ультрацентрифугирование, введение в молекулы радиоактивных изотопов, электрофорез, аффинная хроматография (например, разделение сложных молекул с помощью соответствующих моноклональных антител), двумерное электрофокусирование (позволяющее анализировать до 50 000 белков в одной клетке) и методы микроанализа (например, определение первичной структуры белка, исходя всего из 10 нг, а также определение структуры других биологических макромолекул, таких, как полисахариды, связанные с белками в составе гликопротеинов).
Таким образом, если развитие биологических знаний и в самом деле можно считать детищем технического прогресса, то в настоящее время биологическая наука, обогащенная достижениями энзимологии и генетики, в силах создать систему взаимосвязанных отраслей биотехнологии, обладающих уникальным достоинством: они будут основаны на функционировании природных (а не искусственных) систем, метаболические механизмы которых будут подчинены интересам человечества.
