Слияние соматических клеток

В 1960 г. Барски, Сорьёль и Корнефор (лаборатория вирусологии и культуры тканей Института Гюстава Русси в Вильжюифе, Франция) обнаружили, что при совместном культивировании двух линий. опухолевых клеток мыши образуется новый тип клеток. По морфологическим характеристикам и особенностям роста эти клетки отличались от родительских. Более того, ядра новых клеток содерж·али число хромосом, являющееся суммарным числом хромосом родительских клеток, а также обнаруживали хромосомные маркеры родительских клеток. Эти наблюдения подтвердили Эфрусси и др. (1964) уже на неопухолевых клетках мыши. Частота слияния оказалась очень низкой, примерно 10^–410^–6, но Окаде (1958, 1962) удалось увеличить эффективность слияния опухолевых клеток с помощью японского гемагглютинирующего вируса (JHV). Совместно с Тадокорой (1962) он показал, что вирус можно полностью инактивировать, облучая его ультрафиолетом. Тем не менее он сохраняет способность индуцировать слияние клеток, иными словами, избежать всех сложностей, связанных с использованием активного вируса. Харрис и Уоткинс (1965) обратили внимание на работу японских ученых и впервые использовали инактивированный вирус Сендай, чтобы вызвать слияние клеток HeLa человека с опухолевыми клетками мыши. Вирус JHV принадлежит к миксовирусам и похож на вирус Сендай. Позднее Харрис и др. ученые показали, что между клетками, принадлежащими позвоночным разных отрядов, возможно соматическое слияние.

В 1967 г. Вейсс и Грин обратили внимание на то, что в гибридах клеток человека и мыши хромосомы человека в основном утрачивались. После слияния обезьяньих и мышиных клеток хромосомы обезьяны также исчезали. Поскольку в результате слияния клеток, принадлежащих животным разных видов, всегда наблюдалась утрата хромосом одного вида, полученные гибридные клетки оказались очень полезным объектом для генетического анализа. Были получены соматические гибриды между клетками HeLa человека и клетками Aedes aegypti, между клетками мыши и цыпленка.

Соматические гибриды были получены и при использовании вместо вируса Сендай полиэтиленгликоля при слиянии клеток животных различных видов, слиянии растительных клеток разных видов и даже слиянии животных к,леток с растительными.

Гибридамы

В результате иммунного ответа на определенный антиген образуется высокогетерогенный продукт, иными словами, антисыворотка содержит смесь антител. Последние продуцируются разными линиями В-лимфоцитов и направлены к различным антигенным детерминантам антигена. Если бы определенную линию лимфоцитов можно было выделить и растить in vitro, полученный клон продуцировал бы один тип антител моноклональные антитела. К сожалению, антителообразующие клетки не могут расти в культуре. В то же время существуют злокачественные опухоли костного мозга, миеломы, клетки которых продуцируют большое количество аномальных иммуноглобулинов. Эти клетки обладают способностью к неограниченному росту (т. е. образуют клоны), и продуцируемые ими иммуноглобулины идентичны по структуре. По сути дела это моно.клональные антитела, однако антиген, к которому они направлены, неизвестен. Следует отметить, что у некоторых больных, страдающих миеломой, эти иммуноглобулины образуются в огромном количестве (до 10 г/л крови). Это обстоятельство позволило Эдельману и Портеру (Нобелевским лауреатам 1972 г.) выяснить полную химическую структуру антител.

Милстейн, возглавлявший отдел молекулярной биологии в Аргентинском национальном институте микробиологии в 1961 г., вернулся в Великобританию, чтобы продолжить работу в Кембридже в лаборатории молекулярной биологии Медицинского научно-исследовательского совета. Ученый занимался культивированием миеломных клеток. В 1973 г. Коттон и Милстейн слили клетки крысиной и мыщиной миеломы и обнаружили, что гибридные клетки продуцируют иммуноглобулины, состоящие из различных комбинаций полипептидных цепей, синтезируемых роднтельсскими линиями. Однако комбинации с V- и С- участками от. разных линий не получались никогда. Проведенные исследователями эксперименты по гибриднзации показали, что гены, кодирующие синтез V-и С участков, должны быть расположены на одной хромосоме н что нухлеотидные последовательности этих генов объединяются в результате сплайсинга первичного транскрипта (удалевие нитронов вырезанием и соединение нуклеотидных последовательностей генов С и V). Эксперименты показали также, что в гибридных клетках не происходит аллельного исключения, иными словами, информация от обеих Jюдительских линий «кодоминантно» экспрессируется в сJIИвшихся клетках.

Сотрудник Милстейна Кёлер занимался изучением мутаций: генов, кодирующих синтез иммуноглобулинов; его диссертация, выполненная в Базельском институте иммунулогии, была посвящена вариабельности антител при иммунном ответе. Идеальным объектом для такого исследования явился бы изолированный клон клеток, хорошо растущий в культуре и продуцирующий единственный вид антител, направленных против известного антигена. Однако такого клона не было, и единственными системами, способными синтезировать один тип антител, служили миеломы. Правда, одна миелома (МОРС315), индуцированная у мышей Поттером в Национальном институте рака (США), обладала специфичностью в отношении антигена, однако попытки Кёлера культивировать ее клетки оказались безуспешными. Позднее Кёлер заинтересовался проблемой получения гибридов двух разных мышивых миелом и изучением иммуноглобулинов, продуцируемых гибридными клетками (эти исследования были аналогичны экспериментам Коттона и Милстейна по слиянию мышиных и крысиных миеломных клеток). Среди миелом, полученных Кёлером, была линия клеток РЗ, также некогда изолированная Поттером. Клетки миеломы РЗ могли расти in vitro, и Милстейну удалось получить из нее мутантные линии. Кёлер выделил вариант РЗ, устойчивый к азагуанину, и слил его с другой миеломой, P1. При этом он обнаружил, что гибридные клетки продуцировали иммуноглобулины обеих родительских линий.

Обретя мастерство в технике слияния миеломных клеток (а до того времени это считалось трудной операцией), Кёлер решил вернуться к своему первоначальному замыслуполучению клона клеток, секретирующих антитела к извесmому антигену. Он предполагал слить миеломную клетку с лимфоцитом из популяции, предварительно имевшей контакт с определенным антигеном. По ero расчетам, полученная путем такого слияния клетка должна была бы синтезировать антитела соответствующей специфичности и одновременно обладать способностью к неограниченному росту подобно злокачественной миеломной родительской клетке. Успех этого предприятия казался весьма сомнительным, так как лимфоциты с трудом поддаются слиянию и для обнаружения клетки с заданными свойствами потребовалось бы исследовать тысячи гибридных клеток.

В конце 1974 г. Кёлеру удалось получить гибридому путем слияния клеток миеломы РЗ (резистентной к азаrуанину) и лимфоцитов из селезенки мыши, иммунизированной эритроцитами барана. Эксперимент состоял в иммунизации мышей эритроцитами (продукция антител против этого антигена легко тестируется в сыворотке методом, разработанным в 1963 г. Ерне и Нурдином) и в последующем смешивании клеток мие юмы РЗ мыши с клетками селезенки иммунных мышей в присутствии полиэтиленгликоля. Полученные в результате такого слияния гибридные клетки затем обнаруживались при культивировании в селективной среде они секретировали иммуноглобулины, характерные для обеих родительских клеток. Некоторые гибриды продуцировали антитела против эритроцитов. Таким образом, Кёлер и Милстейн сумели выделить клоны клеток, способные секретировать единственный тип молекул антител и расти в·культуре. Будучи полученными путем слияния антителообразующих и опухолевых клеток, эти клетки-химеры, названные гибридомами, наследовали способность к неограниченному росту в культуре и в то же время к продукции антител определенной специфичности (моноклональных антител).

Прежде чем опубликовать результаты исследований, Милстейн обратился к властям с предложением запатентовать mбридомную технику, но не добился положительного Решения. Тогда совместно с Кёлером он решил передать свои материалы в журнал Nature 14 мая 1975 г. статья была опубликована. Таким образом, британское правительство потерялg право на открытие, признанное одним из важнейших в период с 1970 по 1980 г. Эта работа в значительной степени явилась результатом исследований в бласти синтеза антител, культивирования клеток и кл точных слияний, проводимых в течение двух десятилетий.

Вернувшись в Базель, в Институт иммунологии, Кёлер усовершенствовал гибридомную технику; он отказался от работы по получению моноклональных антител и продолжил исследование мутаций антителообразующих клеток.

Получение моноклональных антител

Разрешив ряд методических проблем, Милстейн, Говард и Батчер из Института физиологии сельскохозяйственного научно-исследовательского совета в Кембридже успешно осуществили слияние клеток, продуцирующих моноклональные антитела против крысиного антигена тканевой совместимости-молекулы, ответственной за генетическую индивидуальность организма и реакцию отторщения трансплантата.

Когда после слияния клеток двух различных линий образуется клон, антитела, которые он продуцирует, необязательно будут моноклональными в иммунологическом смысле, ибо в каждой клетке гибридного клона присутствуют хромосомы обеих родительских клеток и экспрессия этих хромосом ведет к продукции иммуноглобулинов селезеночных (тяжелые и легкие цепи) и миеломнмх клеток (ϒ и Х-цепи). Однако на ранних стадиях размножения гибридные клетки быстро утрачивают часть хромосом. Такая утрата хромосом имеет неслучайный характер, поэтому Кёлер и Милстейн пытались выделить клоны, которые потеряли хромосомы, принадлежащие миеломе, и потому экспрессировали хромосомы иммунных лимфоцитов, иными словами, те, которые синтезируют только тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов (HL), реагирующих с эритроцитами барана. Такая селекция здачительно облегчилась бы, если бы имелась мутантная миеломная линия, не продуцирующая иммуноглобулинов. Тогда в результате слияния получались бы только НL­гибриды.

Отобранные клоны могут храниться в замороженном состоянии. В любое время определенную · дозу такого клона можно ввести животному той же линии, от которой получены клетки для слияния. У животного развиваt: гся опухоль, которая продуцирует моноклональные антитела заданной специфичности. Антитела обнаруживаются в сыворотке животного в очень высокой концентрации от 10 до 30 мг/мл. Клетки такого клона можно также выращивать in vitro, а секретируемые ими антитела получать из культуральной жидкости.

Милстейн и его сотрудники получали моноюiональные антитела, направленные против антигенов малого размера, т. е. гаптенов, белков (включая ферменты), углеводов и гликолипидов, а также против вирусов и компонентов клеточной мембраны. Гибридомная техника получи.ца широкое применение. Теперь моноклональные антитела можно определить, как химический реагент известной структуры, ко1орый можно получить по желанию, тогда как соответствующая антисыворотка является вариабельной смесью реагентов и никогда не может быть в точности воспроизведена после гибели исходного животного. Моноклональные антитела очищают с помощью аффинной хроматографии на колонке с нужным антигеном и затем в течение 6-12 мес получают неограниченное количество моноспецифических антител невиданной дотоле чистоты·и гомогенности. В то время как для получения · антител, используемых в определении группы крови АВО, несбходимо около 1200 л сыворотки крови человека, полученной из крови 6000 доноров, Милстейн и его коллеги выделили «специфические антитела» для группы А из культур гибридомы, оказавшиеся столь же эффективными, как наилучшие из имеющихся в продаже реагентов.

Применение моноклональных антител

Поскольку гибридомы можно хранить в замороженном состоянии, в некоторых институтах и лабораториях для научных целей созданы гибридомные банки. В 1981 г. стоимость препаратов моноклональных антител составляла 200-400 долл. за 1 мг. Многие фармацевтические Фирмы были кровно заинтересованы в увеличении масштабов производства моноклональных антител, поскольку сфера их применения помимо количественного определения различных веществ включала разнообразную диагностику·(идентификация определенного гормона, вирусных или бактериальных антигенов, антигенов группы крови и тканевых антигенов).

Благодаря использованию моноклональных антител, полученных в результате иммунизации животных лекарствами, стало возможным определение дозы этих лекарств. Надежность и экономичность такой иммунодозировки следует считать существенным достижением. В мае 1981 г. Управление по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США (FDA) впервые утвердило к продаже набор для диагностического скрининга на основе гибридом, предназначенный для установления аллергена. Такие же наборы могли быть созданы для тестирования гормонов, диагностики вирусных заболеваний, обнаружения некоторых видов рака и наличия или появления малигнизированных клеток после хирургической перацни или радиотерапии.

Фаррандсу и его сотрудникам из Ноттингэмского университета (Великобритания) удалось получить антитела, специфически «узнающие» злокачественные опухоли толстой и прямой кишок. Больные, подвергнутые клиническому обследованию по подозрению на такие опухоли, получали инъекцию моноклональных антител, меченных радиоактивным иодом. На рентгенограмме, проанализированной с помощью компьютера, с исключительной точностью определялись истинные размеры первичной опухоли и ее распространение в другие органы. Так впервые первичная опухоль и ее метастазы были локализованы специфически. Открытия английских исследQвателей, опубликованные в 1982 г., получили подтверждение в замечательной работе Маха (Лозанна), который использовал подобную технику для обнаружения некоторых форм рака щитовидной железы, хотя и с меньшей специфичностью, чем его предшественники, а также в работах Тубиана из Института Гюстава Русси (Вильжюиф, Франция) по определению опухолей желудочно-кишечного тракта и ученых из Королевского фонда по изучению рака (Лондон), которые теми же методами диагностировали эпителиальные формы рака.

С помощью моноклональных антител возможно также выделение биологичесхи активных веществ (белков, гормонов, токсинов) из сложных смесей. В случае интерферона Сичер и Бёрк из Уорвикского университета (Великобритания) с помощью иммуноадсорбции получили препараты около 1% чистоты. После иммунизации мышей таким препаратом интерферона они слили клетки селезенки иммунных мыщей с миеломными клетками мыши, затем отобрали гибридный клон, секретирующий антитела к интерферону, и для получения большого количества антител привили эти клетки мышам. Антитела бьmи пришиты к углеводным гранулам и использованы для приготовления колонки с иммуносорбентом, на котором очищали грубый препарат интерферона. После одного пассажа через колонку с иммобилизованными моиоклональными анmтелами препарат очищался в 5000 раз.

Можно также использовать моноклональные антитела для мечения и точной идентификации специализированных клеток, таких, как нейроны, чтобы глубже изучить способы их взаимодействия и функционирование (локализацию химических нейромедиаторов).

Очень ценна техника моноклональных антител и для изучения клеточных мембран. Мембранные белки трудно выделять в чистом виде. Оии присутствуют в клетках в малом количестве, их биологическую активность трудно измерить или же она и вовсе исчезает при растворении мембран в аналитических эскпериментах. Эти трудности можно преодолеть, если прибегнуть к иммунологическим методам изучения мембранных белков, как было сделано в случае антигенов клеточной поверхности, являющихся маркерами разных стадий дифференцировки ткани. Обычные же препараты антител против клеточных антигенов, как правило, сложные и не способны распознавать отдельные молекулы.

В 1977 г. Милстейн, Гальфрэ и Уильямс иммунизировали мышь мембранами клеток тимуса крысы. Получив гибридомы, продуцирующие антитела против тимоцитов крысы, исследователи сумели изолировать несколько клонов продУцирующих ·некоторые антитела, специфичные для отдельных антигенов клеточной поверхности. Моноклональиые антитела можно использовать в качестве стандартного реагента для обнаружения определенных Молекул на клеточной мембране, а также для разделения популяций клеток, несущих на поверхности разные антигены. Обнадеживающие результаты были получены с некоторыми -клетками кроветворной и лимфоидной систем; в частности, при использовании моноклональных антител для дифференциальной диагностики различных лейкозов и родственных заболеваний.

Что касается непосредственной терапии, эффективность серотерапии может быть увеличена благодаря применению очищенных или моноклональных антител. Кроме того, с помощью моноклональных антител можно изготовлять высокоспецифичные вакцины, особенно против определенных вирусных штаммов и паразитов.

В 1980 г. Кроус и его сотрудники из Института анатомии и биологии Уистера (Филадельфия) получили гибридому человека путем слияния В-лимфоцитов от больного, страдающего множественной миеломой, с лимфоцитами от больного с подострым панэнцефалитом. Клетки гибридомы продуцировали молекулы иммуноглобулина М человека, специфически узнающие некоторые компоненты вируса кори. Этот результат показал возможность создания гибридом человека, секретирующих антитела против патогенных вирусов.

Шистосоматоз (бильгарциоз)заболевание, вызываемое паразитическими червями, шистосомами, двойные мембраны которых содержат около десяти различных белков с молекулярной массой 18 000-200 000 дальтон, определяющих антигенные свойства паразита. Тэйлор из Кембриджского университета и Диссу из Пастеровского института (Лилль, Франция) получили препараты моноклональных антител к полипептидным антигенам с молекулярной массой 24 000 и 37 000 дальтон соответственно.

Становясь зрелым, паразит перестает связывать антитела, продуцируемые хозяином, и таким образом приобретает способность обманывать защитные реакции организма-хозяина. Создается впечатление, что шистосомы способны синтезировать молекулы, по структуре близкие к молекулам организма-хозяина. И действительно, на наружных мембранах шистосом, выделенных из мышей, удалось обнаружить компоненты антигенов гистосовместимости. Симпсон из Национальных институтов здоровья США с помощью моноклональных антител показал, что на поверхности паразита присутствует антиген Н-2.

Однако при анализе генома шистосом гены, кодирующие антигены тканевой совместимости человека или мыши, не были обнаружены, значит, паразит «получает» их от хозяина. В связи с этим большой интерес представляет детальное изучение мембранных липопротеинов с помощью моноклональных антител, чтобы затем на основе последних изготовлять вакцины или препараты для эффективной химиотерапии.

Моноклональные антитела способны также нейтрализовать действие лимфоцитов, ответственных за отторжение трансплантата, и аутоантител, образующихся при аутоиммунных заболеваниях (некоторые формы диабета, рассеянный склероз, ревматические болезни). В сочетании с лекарственными средствами они могут значительно усиливать эффективность действия последних на клеткимишени, позволяя при этом избегать серьезных побочных явлений, столь обычных при химиотерапии рака. Лезерману, Барбе и Маши (1981) из Иммунологического центра INSERM-CNRS (Марсель-Люмини, Франция) удалось встроить моноклональные антитела в поверхность липосом. Эти липидные пузырьки, способные пересекать клеточную мембрану и переносить миллионы молекул лекарственного препарата, могут оставлять свое содержимое в печени или в каких-то других клетках в соответствии со специфичностью связанных с ними антител. Таким образом лекарства, противоопухолевые препараты или гормоны могут попадать внутрь клеток чтобы вылечить их или разрушить.

Моноклональные антитела в терапии опухолей

Начиная с 1979 г. несколько американских лабораторий создали моноклональные антитела, реагирующие со специфическими антигенами рака легких, молочной железы, толстой кишки, поджелудочной железы, а такжес антигенами меланом, лимфом и лейкозов.

Для получения моноклональных антител, специфически реагирующих с антигенами мелкоклеточной карциномы легкого, которая составляет 25%, из 130 00 случаев злокачественных опухолей легкого, регистрируемых за год, ученым из Национального института рака (США) Минна, Кутгита и Розену пришлось проскринировать 15 000-20 000 гибридом. Процесс получения этих моноклональных антител состоял прежде всего в изоляции лимфоцитов из селезенки мышей, иммунизированных раковыми клетками, затем в слиянии лимфоцитов с клетками миеломы мыши и, наконец, в выделении гибридных клонов. Антитела, продуцируемые 20 000 выделенных таким образом клонов, были испытаны· на двух разных линиях культуры мелкоклеточной карциномы и на одной линии нормальных (не раковых) лимфоидных клеток. Было выявлено 80 антител, реагирующих с раковыми и не реагирующих с нормальными клетками. Три из них были подвергнуты дальнейшему подробному изучению. Один клон реагировал с нормальными клетками почки и с опухолевыми клетками (рак легкого и молочной железы, нейробластома) (Маркс, 1982). Степлевски, Копровски и др. из Филадельфийского института анатомии и биологии Уистера получили моноклональные антитела против линии клеток из нижнего отдела толстой кишки, которые могли оказаться полезными при обнаружении раковых опухолей в желудочно-кишечном тракте. В Национальном институте артрита, нарушений обмена и заболеваний пищеварительного тракта (США) исследователям Гинзбургу и Маньяни удалось идентифицировать антиген клеток нижнего отдела толстой кишки, который реагировал с антителами против крупного гликолипида (моносиалоганглиозида). В норме этот гликолипид отсутствует в клетках взрослых особей и обнаруживается лишь у эмбрионов. Ученые из Института Уистера обнаружили этот антиген в крови у 23 из 33 больных с прогрессирующим раком нижнего отдела толстой кишки и не нашли его в крови у 38 здоровых добровольцев. Они также выявили присутствие этого антигена в крови больных, страдающих раком желудка и поджелудочной железы (Маркс, 1982). Группа Мецгара из Медицинского центра Университета Дьюка разработала серию из пяти препаратов моноклональных антител про· тив опухоли поджелудочной железы и охарактеризовала опухолевые антигены, с которыми эти антитела реагировали. Один из антигенов был обнаружен в сыворотке больных раком поджелудочной железы, причем его концентрация коррелировала со стадией заболевания. Рак поджелудочной железы обычно диагностируют слишком поздно, когда его уже невозможно лечить, поэтому так важно в качестве метода ранней диагностики использовать моноклональные антитела, улавливающие специфический антиген в сыворотке больных (Маркс, 1982).

Харрис с сотр. (Оксфордский университет) идентифицировали и выделили в достаточном количестве Саlантитела, распознающие так называемый Саl-антиген, представленный на клеточных мембранах большого числа злокачественных опухолей человека (рак молочной железы, матки, почек, горла, легких, желудка, тонкой кишки и печени, опухоли соединительной и костной тканей) и отсутствующий как на клетках доброкачественных опухолей тех же органов и тканей (бородавки, кисты, аденомы), так и на нормальных клетках (правда, Саl-антиген был обнаружен в выстилке фаллопиевых труб и в переходном эпителии мочеточников). Возможность обнаружения молекулы Cal, маркера злокачественного перерождения ткани, с помощью простого и высокоспецифичного иммунологического теста послужила основой для создания метода точной диагностики на срезах ткани, полученной при биопсии, а также в секретах, содержащих отдельные малигнизированные клетки (влагалищные мазки, пробы из желудка и бронхов и т. д.). Корпорация «Белкам фаундейшн» намеревалась выпустить в продажу Саl-антитела, наиболее ценным качеством которых является точность и быстрота диагностики рака. Как известно, шансы на выздоровление в огромной степени зависят от возможности ранней диагностики рака. Более того, Саl-антитела могут сыграть важную роль в терапии рака, которая все большее предпочтение помимо обычных радиологических и химиотерапевтических методов отдает применению молекул-антагонистов. По мнению специалистов, молекулярная онкология знаменует собой новую эру в изучении канцерогенеза, точном обнаружении и лечении рака, хотя свой вклад в решение этих проблем внесли и другие дисциплины (биохимия, генетика, иммунология, вирусология, гистология, эпидемиология, фармакология).

Возможность применения радиоактивных иммуноглобулинов в терапии рака была показана Ордером (отделение радиотерапии опухолей Медицинской школы Университета Джона Гопкинса, Балтимор, шт. Мэриленд), и с 1979-1980 гг. к .этой технике прибегали, главным образом при лечении больных с неоперабельвым первичным раком печени. Насколько можно судить, такое леченце эффективнее обычной химиои радиотерапии. (Маркс, 1982). Возможность лечения злокачественых солидных опухолей радиоактивными моноклональными антителами изучалась с 1982 г. объединенными усилиями ученых Онкологического центра Джона Гопкинса, «Гибритек корп.» (СанДиего, шт. Калифорния), Калифорнийского университета (Сан-Франциско) и Медицинского центра Альберта Эйнштейна (Филадельфия).

В марте 1982 г. Миллер и др. из Медицинской школы Станфордского университета весьма осторожно, как принято встоль важном вопросе, доложили о своем практическом достижении: первой длительной ремиссии (10 мес.) у больного с лимфомой, которого лечили моноклональными антителами мыши. Последние специфически связывались с вариабельной частью (идиотипом) иммуноглобулинов, находящихся на поверхности опухолевых клеток (Влимфоциты). К сожалению, попытки такого же лечения других лимфом (Т-лимфоидных опухолей) оказались безрезультатными. Даже если данные, представленные Миллером и его коллегами, подтвердятся, описанный ими случай достаточно исключительный, так как опухолевые клетки В-лимфомы синтезировали иммуноглобулины, которые оставались связанными с поверхностью и не выделялись в кровь больного. Именно против таких иммуноглобулинов (выделенных и очищенных) с помощью гибридомной техники были получены специфические противоопухолевые моноклональные антитела. Что же касается опухолей лимфатической системы, которые продуцируют иммуноглобулины, циркулирующие в крови больного, то подобные моноклональные антитела нейтрализуются этими аномальными иммуноглобулинами раньше, чем они смогут достигнуть опухолевых клеток. Поэтому излечение или ремиссия в этом случае в высшей степени проблематичны.

Злокачественную опухоль удается обнаружить, когда она состоит примерно из миллиарда клеток, иными словами, когда на каждую раковую клетку в организме приходится 100 000 здоровых клеток. В идеале лечение рака заключается в истреблении малигнизированных клеток без повреждения окружающих здоровых клеток, поэтому весьма ценным качеством противоопухолевого препарата является избирательность его действия. Но противораковые лекарства действуют главным образом на быстро делящиеся клетки, а это делает их неэффективными в отношении медленно развивающихся опухолей. Еще одним способом применения моноклональных антител в терапии рака является соединение их с цитотоксическими веществами.

Такой метод был предложен еще в 1958 г. Ж. Матэ из Института Гюстава Русси (Вильжюиф, Франция). Ученый попытался «вооружить» противоопухолевые антитела антинеопластическими средствами (метотрексат, хлорамбуцил, дауномицин), однако последние были недостаточно токсичны, а антитела не очищены. Более эффективными оказались яды растительного и микробного происхождения: дифтерийный токсин, рицин токсин из семян клещевины, а-аманитин-компонент яда бледной поганки. Исследователи Кролик, Ур и Вилетта из Юго-Западной медицинской школ.ы Техасского университета (Даллас) показали, что поликлональные антитела, конъюгированные с рицином, способны убить почти все опухолевые клетки в костном мозгу больных лейкозом мышей, не разрушая стволовых клеток, продуцирующих нормальные красные и белые клетки крови (Маркс, 1982). Вообще же in vitro эти токсины разрушают нормальные клетки так же, как раковые, поскольку они обладают способностью связываться с поверхностью любых клеток. Вот почему необходимым условием является именно селективность связывания. Рицин по своей структуре как бы создан для выполнения такой задачи. Он состоит из двух полипептидных цепей: А-пепь несет токсические детерминанты, а В-цепь содержит участок, распознающий галактозу, что и позволяет рицину связываться с клеточной мембраной. В научно-исследовательском центре КленМиди в Монпелье (Франция) в 1975 г. была завершена работа по очистке А-цепи с целью конъюгирования ее с противоопухолевыми антителами. Без В-цепи рицин приобретал специфичность связывания благодаря антителам и не попадал на нормальные клетки. Начиная с 1978 г. несколько групп ученых успешно создавали такие гибридные молекулы, или иммунотоксины, пришивая А-цепь рицина (которого очень много в семенах клещевины, поэтому его можно получать десятками граммов) к моноклональным антителам и испытывая их в экспериментальных условиях. Такие иммунотоксины распознавали антигены, характерные для некоторых опухолей мышей и новообразований человека. Согласно данным Казелласа и Гроса (1982), чтобы убить здоровую клетку, нужно в 10³ 10⁵ раз больше яда, чем для уничтожения раковой клетки. Иммунотоксины же обнаруживали высокую избирательность действия и убивали злокачественные клетки in vitro. В экспериментах на животных иммунотоксины способны останавливать развитие опухоли.

Однако, прежде чем приступить к производству иммунотоксинов, дающих столь обнадеживающие результаты, необходимо всесторонне проанализировать их с позиций принципов медицины. До применения иммунотоксинов в клинике придется преодолеть немало серьезных препятствий: возможную инактивацию токсина антителами больных; вероятность нейтрализации токсина опухолевыми антигенами, циркулирующими в крови; неэффективность токсинов в случае очень обширного поражения опухолью или инвазивного роста и т. д.

Эффективности терапевтического действия моноклональных антител может помешать присутствие в крови некоторых больных опухолевых антигенов, связывающих эти антитела и тем самым препятствующих их взаимодействию с опухолевыми клетками. С другой стороны, случается, что после связывания некоторых антител с клеточными антигенами последние исчезают и перестают экспрессироваться на поверхности. Это тоже делает применение антител неэффективным. Такая модуляция антигена, наблюдавшаяся при исследовании больных лейкозом, снижает эффективность антител при повторном лечении.

Другая проблема, связанная с применением моноклональных антител в терапии рака и общей терапии, заключается в отсутствии моноклональных антител человеческого происхождения.

Все эксперименты проводились с моноклональными антителами мышей или с поликлональными ан'гит лами от группы различных животных. Существует опасность возникновения у больных сильных анафилактических реакций при повторном введении чужеродных антител. Исследования в этой чрезвычайно важной области надо начать с получения человеческих моноклональных антител; одной из трудностей на этом пути является отсутствие легко растущих в культуре линий миеломных клеток человека, не секретирующих собственных иммуноглобулинов. В 1982 г. Национальный институт рака (США) ассигновал на такого рода исследования 500 тыс. долл. Необходимо также выделить клетки человека, продуцирующие антитела против опухолевых антигенов; совершенно очевидно, что методы, используемые для достижения аналогичных целей при опытах на мышах (введение опухолевых клеток в организм, выделение иммунных лимфоцитов из селезенки), невозможны применительно к человеку.

Тем не менее Шлом и Вундерлих из Национального института рака (США) успешно слили лимфоциты из лимфоузлов человека (удаленных при операции по поводу рака молочной железы) с миеломными клетками мыши. Полученные в результате гибридомы продуцировали антитела против опухолевых антигенов. Однако гибридомы оказались нестабильными: они утрачивали хромосомы человека и прекращали синтезировать антитела, специфичные для организма человека. Вместе с тем могут образовываться и стабильные линии, что явится разрешением проблемы получения моноклональных антител человека.

Другое обстоятельство, а именно гетерогенность опухолевых антигенов, т: е. присутствие различных антигенов на опухолях, развивающихся при одном заболевании, или даже на поверхности клеток одной опухоли, побуждает использовать смесь моноклональных антител для лечения в таких случаях.

Итак, гибридомы и продуцируемые ими моноклональные антитела вносят свой вклад в революцию в терапии, которая базируется на последних достижениях биохимии, молекулярной биологии и иммунологии и в которой возрастает тенденция к использованию биологически активных соединений, а также к воздействию на физиологические механизмы при лечении различных патологических состояний.

Производство моноклональных антител

Интерес к применению моноклональных антител· проявляет целый ряд европейских и североамериканских фирм. Так, в Калифорнии существуют компании, выпускающие диагностические наборы для обнаружения гепатита и установления аллергена, другие фирмы осуществляют выпуск лекарственных средств, третьипрепаратов для диагностики раковых заболеваний; все на основе антител. Одна фирма в Филадельфии приобрела два патента на производство моноклональных антител против раковых клеток и вирусных антигенов; теперь она специализируется в диагностике рака, болезней сердца и печени, вирусных заболеваний. Два патента имеют Копровски с сотр. (Филадельфийский институт анатомии и биологии Уистера) и фирма «Сентокор», внесшие большой вклад в применение гибридомной техники, благодаря работе с клонами клеток, предоставленными им Милстейном.

По данным американских финансовых кругов, в 1987 г. будет выпущено диагностических наборов на основе моноклональных антител на 500 млн. долл.; для диагностических проб раковых заболеваний к 1990 г. сумма, возможно, превысит 2 млрд. долл. Появление новых диагностических средств отражает рост доли реагентов для биологических анализов, которые. в 1980 г. на мировом рынке были представлены на сумму свыше 2 млрд. долл.; две трети из них производили США и Япония. Франция, Нидерланды, ФРГ, Швеция и Швейцария тоже вступили в конкурентную борьбу в этой индустрии.

Во Франции в Национальном институте здравоохранения и медицинских исследований (INSERM) в 1981 г. десятая часть всех субсидий была предоставлена исследованиям по биологической и медицинской инженерии с· целью уменьшить зависимость страны от иностранного рынка (в то время Франция импортировала 80% биохимических, 65% иммунологических, 50% гематологических и 15% микробиологических реактивов). Более того, в июле 1981 г. коммерческая фирма «Иммюнотек» приступила к освоению гибридомной техники, стремясь достигнуть уровня ведущих фирм, производящих иммунологические реактивы. Первая французская иммунотехнологическая фирма получала научную помощь от INSERM; ее лаборатории в январе 1982 г. начали функционировать в университетском городке в Люмини, под Марселем, неподалеку от ведущего французского иммунологического центра INSERM-CNRS. Фирма «Иммюнотек» получала также финансовую поддержку от общественных корпораций, содействующих развитию биоиндустрии, и от других общественных фондов. Было подписано соглашение о сотрудничестве фирмы с INSERM: лаборатории INSERM представляли ей свои научные достижения в первую очередь, а фирма их оплачивала. «Иммюнотек» взяла на себя обязательство выплачивать 10% своей прибыли в фонд развития медицинских научных исследований. Перед нами типичный пример того, как на национальном уровне было осуществлено усиление биомедицинских исследований с целью участия в · том фантастическом буме на мировом биологическом рынке, который порожден созданием гибридомной техники.