В применении к промышленным штаммам микроорганизмов прогресс в микробной генетике в первую очередь способствует пониманию огромного разнообразия метаболизма микробов и его ориентированию в полезную сторону. С этой целью используются следующие методы: индукция мутаций в специфических участках ДНКдля уменьшения сложностей, связанных с трудоемким выделением и скринингом штаммов, которые получаются при спонтанном мутагенезе; слияние протопластов для расширения границ природного полового процесса и генной инженерии; применение рекомбинантных ДНКдля переноса природных генов и конструирования новых.
Амплификация генов заключается в значительном увеличении числа копий определенного гена в микробной клетке, приводящем к резкому повышению производства вещества, кодируемого этим геном. Применяемый технический прием связан с увеличением числа плазмид на клетку. В норме они присутствуют в 130 копиях на клетку и содержат 2-250 генов, между тем удается добиться до 3000 копий плазмидных генов на клетку. Техника амплификации генов широко использовалась для Escherichia coli, а сейчас возможно перенести любой хромосомный ген или группу генов в плазмиду и затем перенести плазмиду в кишечную палочку, где ее можно амплифицировать. Более того, появилась возможность переносить из одной клетки в другую плазмиды Bacillus путем трансформации в присутствии полиэтиленгликоля. Плазмиды из Pseudomonas можно переносить в другие грамотрицательные бактерии, относящиеся к родам Acinetobacter, Agrobacterium, Escherichia; Klebsiella, Proteus, Rhizoblum и Salmonella. Плазмиды Staphylococcus aureus также могут реплицироваться и экспрессироваться в клетках Bacillus subtilis. Клетки дрожжей также содержат до 50 плазмид на клетку.
Фактически все вырабатывающие антибиотики микробные штаммы содержат плазмиды, которые несут либо структурные гены биосинтеза антибиотиков, либо гены, регулирующие их экспрессию. Поэтому целью экспериментов является амплификация этих генов, чтобы значительно повысить производство антибиотиков.
Можно использовать и другие процессы. Например, фаг λ, осуществляющий трансдукцию trр-оперона Е. coli (который в норме содержится в хромосоме этой бактерии), может быть амплифицирован таким образом, что ферменты биосинтеза триптофана составят до 50% растворимого клеточного белка. Сходный результат может быть достигнут амплификацией того же trр-оперона, перенесенного на плазмиду, а не на трансдуцирующий фаг λ. Такого рода исследования направлены на увеличение производства пролина, биотина, рибофлавина и пенициллинацилазы.
Гомологичная рекомбинация происходит между хромосомами бактерий или эукариот, которые имеют сходную последовательность ДНК и после скрещивания обмениваются фрагментами ДНК по механизму разрывавоссоединения ДНК. Гомологичная рекомбинация особенно эффективна для создания новых генотипов или новых блоков генетической информации. Если две особи различаются по n генам или участкам генов, рекомбинация между ними может привести к возникновению 2n новых генотипов. Конъюгация между представителями двух микробных штаммов, ДНК которых отличается лишь дюжиной пар нуклеотидов из миллионов нуклеотидов, может привести к возникновению 212, т. е. почти 5000, новых генотипов. Хотя для большинства микроорганизмов возможен обмен генов между родственными штаммами, трудно привести убедительные примеры того, когда для выведения высокопродуктивных культур со свойствами нескольких штаммов использовали бы возможности природной генной инженерии. Между тем промышленные дрожжи предоставляют несколько таких примеров.
Гомологичная рекомбинация, как уже говорилось, вызывает обмен между сходными участками ДНК, тогда как другие формы рекомбинации, такие, как перенос плазмид или случаи негомологичной рекомбинации различающихся ДНК, добавляют новую ДНК к генотипу микроорганизма.
Традиционные типы брожения можно улучшить за счет переноса генов, кодирующих амилазы Aspergillus, глюкоамилазу Aspergillus или Rhizopus, глюкозоизомеразу Streptomyces или реннин Mucor в бактериальные клетки. Производство ферментов станет более экономичным, а процессы ферментацииболее эффективными.
Такие методы использовали также для улучшения свойств штаммов S. cerevisiae, применяемых в пивоварении. Цель недавних исследований состояла в том, чтобы ввести в эти штаммы гены близкого вида Saccharomyces diastaticus, вызывающего сбраживание декстринов. Углеводы солодового сусла содержат 53% мальтозы, 12% глюкозы, 13% мальтотриозы, 22% декстринов и следы мальтотетраозы. Пивные дрожжи верхового и низового брожения способны сбраживать все эти углеводы, за исключением декстринов. Повышение спроса на светлое пиво, т. е. пиво с низким содержанием углеводов, привело к поиску штаммов, которые сбраживали бы декстрины и уменьшали конечную концентрацию углеводов в пиве. Делались попытки ввести гены S. diastaticus, которые увенчались получением штаммов, способных сбраживать декстрины. Однако производимое новыми штаммами пиво имело неприятный запах, который вызывал 4-винилгваякол (последний продуцировался дрожжами из компонента сусла). Табб с сотр. из Фонда исследования пивоварения (Великобритания) обнаружили, что гены, ответственные за сбраживание декстринов у S. diastaticus, не всегда переносятся совместно с генами, ответственными за синтез этого фенольного соединения, в дрожжи, полученные методами генной инженерии. Так появилась возможность переносить только гены, кодирующие сбраживание декстринов, от одного штамма дрожжей к другому. Эта процедура была, по-видимому, первой в цикле программ, направленных на получение ферментируемых пищевых продуктов и алкогольных напитков с желаемыми качеством и ароматом.
Как полагают, введение в клетки S. cerevisiae генов амилазы и rлюкоамилазы обеспечит производство спирта из крахмала.
Применение методов генной инженерии для синтеза промышленных аминокцслот могло бы внести заметный вклад в случае ферментативного производства метионина. В 1980 r. было химически синтезировано 105 000 т этого продукта. Хотя методов для индукции и селекции мутантов, способных синтезировать большие количества метионина, пока нет, генетики намерены ввести в микроорганизмы гены, кодирующие новые метаболические пути и регуляторные механизмы биосинтеза метионина. Альтернативой производству метионина могло бы стать производство белка, богатого этой аминокислотой, который может оказаться более вкусным, чем метионин (при добавлении метионина к кормовым продуктам последние приобретают горький вкус).
Что касается антибиотиков, то антибиотикпродуцирующие опероны могут быть перенесены из медленно растущих стрептомицетов в быстро растущие бактерии, такие, как Е. coli или В. subtilis. Это позволило бы достичь гораздо более высокого выхода за счет более надежного контроля условий культивирования. Как показали недавние исследования, структурные гены биосинтеза некоторых антибиотиков обычно сосредоточены в хромосомах исследованных микроорганизмов, так что можно включить их в плазмиды и перенести в другие актиномицеты или в Е. coli. Такие плазмиды были сконструированы на основе плазмид SLPl .2 S. lividans и SCP2 S. coelicolor; лучше всего их удается вводить в клетки Streptomyces при помощи слияния протопластов. С другой стороны, умеренный фаг Streptomyces СЗ1 был объединен с плазмидой pBR322 Е. coli. Этот бифункциональный репликон размножается как фаг в клетках Streptomyces и как плазмида в клетках Е. coli.
Методы слияния протопластов с последующей рекомбинацией были усовершенствованы для грибов и актиномицетов за счет использования полиэтиленrликоля. Примерами служат слияния протопластов Penicillium chrysogenum и Р. cyaneo-fulvum, Aspergillus nidulans и А. rugulosus, различных видов стрептомицетов (для которых частота рекомбинации может возрасти вплоть до 10–2 – 10–1) и даже представителей двух родов дрожжей Candida и Endomycopsis. Границы этих рекомбинационных событий могут быть расширены благодаря тому, что ультрафиолетовое облучение протопластов Streptomyces перед слиянием увеличивает частоту рекомбинации в десять раз. Слияние протопластов может способствовать совершенствованию некоторых промышленных штаммов, у которых накоплено немало нарушений в ходе селекционной программы: они могут быть подвергнуты внутривидовой рекомбинации с мало продуцирующими, но сильными штаммами. Слияние двух штаммов Streptomyces может также привести к появлению гибридных клеток, часть которых содержит новую комбинацию генов, возможно представляющих особый интерес для производства антибиотиков. Тем самым появится возможность объединить группу генов, ответственных за увеличение производства антибиотиков; изменения в этих генах были накоплены в ходе последовательных циклов мутагенеза и селекции (процедуры генетического скрининга).
Были усовершенствованы два штамма Nocardia lactamdurans, вырабатывающие цефамицин; последующее слияние привело к появлению рекомбинантов, отдельные культуры которых продуцировали на 10-15% больше антибиотика, чем лучший из родительских штаммов. В результате слияния двух видов Streptomyces возник рекомбинант, который производил новый антрациклин, а мутанты Nocardia mediterranei, которые не производили рифамицин, после слияния дали штаммы, синтезирующие три новых рифамицина.
Некоторые штаммы Saccharomyces cerevisiae, используемые при ферментационном производстве пищевых продуктов и алкогольных напитков, способны образовывать споры, т. е. подвергаться экспериментам по селекции, основанным на гибридизации. Такие эмпирические эксперименты привели к усовершенствованию пекарских дрожжей.
