Получение белков из углеводородов

Крупномасштабное культивирование микроорганизмов как прямой источник белка для питания человека и животных рассматривалось в качестве способа решения проблемы нехватки пищи в Германии уже во время первой мировой войны. В Берлине Дельбрюк и его коллеги разработали первый технологический процесс культивирования пивных дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) в широких масштабах. Дрожжи добавляли главным образом в супы и колбасы. Во время второй мировой войны в Германии важным компонентом питания также были пищевые дрожжи (Candida arborea и С. utilis).

Впервые выражение «белки одноклеточных организмов» (БОО) употребили в 1960-е гг. применительно к микробным белкам, продуцируемым массовыми культурами дрожжей или бактерий, которые используются в качестве пищи человека или корма скота. Множество статей на эту тему привлекло внимание ученых и общественности к возможности производства таких белков при выращивании микроорганизмов на углеводородах.

Однако этот энтузиазм не разделяли ведущие нефтяные компании, и такая их позиция оказалась справедливой ввиду резкого повышения цен на нефть в 1973 г. Однако уже через год интерес к этой проблеме вспыхнул вновь, причем не только по причине неуклонного технологического прогресса разработок, но и в связи с результатами пищевых тестов для продуцируемых белков, а также с открывающимися перспективами сбыта.

Все дрожжи в качестве источников азота ассимилируют соли аммония и реже нитраты. Превращение неорганического азота в белок и ассимиляция различных органических субстратов как источников углерода-основные процессы, позволяющие растущим дрожжам производить белки в промышленном масштабе.

В конце 1950-х гг., после исследований Шампанья в Лавера (Франция), фирма «Бритиш петролеум» (ВР) заинтересовалась производством микробных биомасс из углеводородов. Доводом в пользу первоначального проекта служила помимо производства белков необходимость удаления парафинов из газойля. Сырая нефть, очищаемая у давера, содержала 10-15% парафинов. Последние од действием дрожжей Yarrowia (Candida) деградировали в ферментерах, в которые вводили соли аммония, чтобы обеспечить необходимым азотом и поддержать нужный рН в нестерильной среде. После активной фазы роста дрожжи собирали, оставшийся газойль вместе с липидами, которые составляли около 10% биомассы, удаляли. Так как в ходе процесса получаются побочные продукты, которые должны возвращаться в очистительный цикл, его необходимо выполнять вблизи нефтяных очистных заводов. В 1976 г. фабрика в Лавера использовала газойль в качестве субстрата для получения вещества, продаваемого под названием «топрина»; ее производительность составляла 20 000 т в год.

Первая крупномасштабная фабрика ВР вступила в строй в конце 1975 г. в Сарроке (Сардиния). Своим возникновением она обязана образованию совместно с итальянской фирмой общей компании «Италпротеин». На фабрике с производительностью 100 000 т в год использовали другой процесс: дрожжи утилизировали п-парафины, а не газойль, как в Лавера. Процесс был разработан в другом подразделении ВР в Грэнджмаусе (Шотландия), и для него использовался перемешиваемый ферментер с перегородками, содерж'ащий очищенные n-парафины. По грубым оценкам, производство белков одноклеточных организмов достигало 4000 тв год. Итальянская компания «Ликвикимика» построила фабрику для производства дрожжевых белков, аминокислот, жирных кислот и лимонной кислоты из n-парафинов в Салине ди Монтебелло (Калабрия). В 1980 г. фабрика, работающая по японской технологии, производила 200 000 т белков.

После 1975 г. Япония занялась производством белков одноклеточных организмов и содействовала созданию в Румынии фабрики производственной мощностью 60 000 т в год («Румимпорт»). В Румынии же к 1980 г. восемь фабрик производили из промышленных отходов по 1500 т белка в год каждая.

Что касается США, то интерес, проявленный американскими специалистами к этой отрасли пищевой промышленности в 1960-х гг., со временем снизился, что, возможно, объясняется благоприятной сельскохозяйственной ситуацией, характерной для Северной Америки тех лет. Однако примерно с 1975 г. наблюдается возрождение интереса к производству белков из субстратов, отличных от п-парафинов, таких, как метанол и целлюлоза.

Получение белков из других субстратов

Массовая добыча природного газа из месторождений в Северном море обусловила интерес компании «Шелл» к использованию этого субстрата в качестве сырья для получения белка одноклеточных организмов. Газ, добываемый из Северного моря, состоит почти исключительно из метана. А так как нефтехимия основана главным образом на этилене, то метан в основном используется для обеспечения водородом синтеза аммиака. Чтобы предотвратить воспламенение смеси воздуха и метана, метан химически окисляют до метанола, который представляет собой подходящий субстрат для производства белка одноклеточных организмов. В середине 1973 г. «Шелл» прекратила работу с метанолом и разработала систему смешанных культур на метане иными словами, среда содержала основной микроорганизм и несколько других, играющих вспомогательную или симбиотическую роль. Высокая температура (42° С) уменьшала риск множественного микробного загрязнения.

Производство белка одноклеточных организмов из метанола, который служил источником углерода, было налажено на предприятиях западногерманской фирмы «Хёхст» и английской «Империал кемикал индастриз лтд.» (ICI). Этот процесс получил также одобрение Научно-исследовательского института в Кувейте, и в 1982 г. в этой стране было создано опытное производство для получения дрожжей таким способом.

Концерн «Империал кемикал индастриз» приступил к выпуску белков одноклеточных организмов в 1968 г., более чем десятилетием позже «Бритиш петролеум». Фирма остановила свой вьiбор преимущественно на метаноле по двум причинам: во-первых, метанол сводил к минимуму проблемы химической инженерии, во-вторых, он в отличие от метана и п-парафинов растворим в воде. В 1976 г. концерн вложил 40 млн. ф. ст. в создание фабрики в Биллингэме (Великобритания), которая вышла на проектную мощность в 1980 г. Чтобы конечный продукт мог конкурировать с соевыми бобами, исследователям пришлось изыскивать способы уменьшения стоимости производства белков одноклеточных организмов главным образом за счет большей эффективносm превращения метанола в белок.

Используемый бактериальный штамм Methylophilus methylotrophus (ASI) ассимилирует аммиак из культуральной среды, превращая его в глутаминовую кислоту посредством двух реакций, которые катализируются ферментами глутаминсинтетазой (GS) и глутаматсинтазой (COGAТ). Для ассимиляции аммиака требуется энергия в виде АТФ на стадии, катализируемой GS. АТФ получают при окислении метанола до углекислого газа, и это приводит к избыточному потреблению углеродного субстрата. В некоторых других бактериях, включая кишечную палочку, происходит синтез глутаминовой кислоты, для которого требуется меньше энергии и который зависит от другого фермента-глутаматдегидрогеназы (GDH). Был выделен ауксотрофный мутант штамма ASI, который не усваивает аммиак, будучи лишен COGAT. С другой стороны, ген Escherichia coli, кодирующий глутаматдегидрогеназу, был встроен в плазмиду, клонирован и перенесен в ауксотроф ASI. Полученный штамм, способный синтезировать GDH вместо COGAT, ассимилировал аммиак с меньшим расходом энергии (Гельфанд, 1980, в ). Но даже умеренный выигрыш в энергии приводит к существенной экономии в силу массового характера производства белка Methylophilus methylotrophus. Производственная мощность биллинrэмской фабрики составляла 5000 т в год (по данным на 1983 г.); рыночное название продукта-«прутин».

Производство белка западногерманской компанией «Хёхст», работавшей с тем же штаммом, что и ICI, в 1982 г. достигло всего 1000 т. Применявшийся процесс nозволял удалять любые токсичные вещества.

Еще один перспективный путь получения белков одноклеточных организмов использование в качестве субстрата промышленных отходов, например отработанного сульфитного щелока с предприятий, выпускающих бумагу. В США в этих растворах выращивают кормовые дрожжи, но производство сокращается, так как сульфитный процесс получения бумаги постепенно вытесняется крафт-процессом. Тем не менее в Финляндии в районе Ямсанкоски в 1975 г. сооружена фабрика, использующая гриб Paecilomyces, культивируемый в сульфитных стоках; производственная мощность фабрики 10 000 т белка в год. В 1980 г. фабрика в Тапелла выпустила на рынок продукт под названием «пекило».

Как субстрат для производства дрожжей можно употреблять молочную сыворотку-доступный побочный продукт сыроварения. Во Франции в 1979 г. три предприятия с производственной мощностью 6000 т в год выпускали белок для корма животных и питания человека. Предусматривалось также создание двух других фабрик с производительностью 10 000 т в год каждая.

Одна из фирм, расположенная в По на юго-западе Франции, разработала процесс выращивания дрожжей на маниоке. Штамм Candida tropicalis родствен штамму, выращиваемому в установках компании «Бритиш петролеум», (ВР), поэтому фирма обладала известными преимуществами: во-первых, она воспользовалась проверенной технологией, а во-вторых, знала, что на белках, экстрагируемых из этих дрожжей, были выполнены пищевые и токсикологические тесты. Дрожжи бурно росли на негидролизованном крахмале: время генерации составляло около 1 ч; иными словами, крахмалистый материал обогащается дрожжами на 20-30% всего за 1 ч. По окончании процесса маниок содержал 19% белка с удовлетворительным содержанием лизина (7,7%) и серусодержащих аминокислот (2,7% метионина и 2% цистеина).

На Кубе в 1979 г. были построены 12 крупномасштабных фабрик для получения дрожжей, выращиваемых на мелассе и отходах спирто-водочных заводов.

В 1980 г. ведущим в мире производителем белков одноклеточных организмов являлся СССР. По данныы Картера (1981), производство белков в стране достигало примерно 1,1 млн. тв год. Из 107 исследованных предприятий по меньшей мере 86 выпускали белки одноклеточных организмов, а остальные широкий ассортимент биологических соединений: лизин и другие аминокислоты, сахара, витамины, липиды, ферменты и кормовые добавки антибиотиков.

Картер изучал данные по сырью, относящиеся к 56 из 86 заводов. Большинство из них (49) работает на сельскохозяйственных, лесных и промышленных отходах. Многие небольшие заводы, относившиеся к промышленности гидролиза лигнина, ранее занимались извлечением смолы и фурфурола, производя посредством гидролиза древесный уголь и ферментируемые кормовые продукты. Большинство из них было реконструировано; сейчас на них установлены новые большие агрегаты для производства белков. Сырье включает древесную стружку и целлюлозу, древесные опилки и бисульфиmый щелок - отходы бумажной промышленности. К отходам сельскохозяйственных культур относятся лузга подсолнечника и риса, кукурузные кочерыжки, жом сахарного тростника и меласса. Значительными потенциальными возможностями обладает также гидролизуемый торф. Неуглеводородное пищевое сырье обеспечивает примерно половину общего производства белка. Однако углеводородное сырье можно использовать с большей эффективностью, и в советских публикациях будущему углеводородного и неуглеводородного сырья придается равное значение.

Культура цианобактерий и одноклеточных водорослей

Крупномасштабное культивирование зеленых водорослей осуществляется в нескольких странах. В противоположность системам выращивания бактерий и дрожжей оно не относится к непрерывному производству, так как происходит за счет фотосинтеза: эффективность производства зависит от условий освещения, к тому же процесс нуждается в больших объемах воды. Тем не менее в определенных природных условиях цианобактерии весьма Перспективны, поскольку некоторые виды, например Spirulina spp., способны фиксировать атмосферный азот.

В 1521 г. Бернал Диас дель Кастилльо упомянул о галетах под названием «текуитлатл», которые продавались на базаре в Мехико и состояли из высушенных слоев Spirulina maxima. В то время, впрочем, как и сегодня, цианобактерии выращивали в очень щелочных водах озера Текскоко вблизи Мехико. Физик и натуралист Франсиско Эрнандес, сопровождавший первых конкистадоров, описал, как пласты Spirulina извлекали из озера и высушивали для получения галет «синего или зеленого цвета».

В 1964 г. бельгийский ботаник Ж. Леонар, участвуя в бельгийской экспедиции через Сахару, обратил внимание на галеты «сине-зеленого цвета» на некоторых деревенских базарах в районе Канема (Чад). Галеты, которые местные жители называли дихэ, «добывали» из щелочных прудов, окружающих озеро Чад; их употребляли в пищу. Как показали микроскопические наблюдения, дихэ состоит из одного вида цианобактерийSpirulina platensis. По возвращении в Бельгию Леонар и Компер проанализировали дихэ и обнаружили в нем очень высокое содержание белка до 70% сухого веса.

Так две популяции, разделенные расстоянием примерно в 10 000 км, открыли питательные свойства Spirulina. Озеро Текскоко и пруды, окружающие озеро Чад, очень щелочные (вплоть до рН 11)-при таких рН Spirulina бурно разрастается и растет как монокультура. Благодаря наличию в клетках наполненных газом вакуолей, а также спиральной форме филаментов клубки водорослей всплывают, а ветер выносит их на берег озера. Под солнцем клубки быстро высыхают.

Тщательные анализы образцов Spirulina, полученных в лабораторных условиях или собранных в природе, которые проводились во Французском институте нефти, а также в Италии, Японии и Мексике, подтвердили данные бельгийских исследователей: в Spirulina содержится 65% белков (гораздо больше, чем в соевых бобах), 19% углеводов, 6% пигментов, 4% липидов, 3% волокон и 3% золы. Для белков характерно сбалансированное содержание аминокислот: концентрация метионина, триптофана и других ·аминокислот была такой же, если не выше, как и соответствующие концентрации в казеине. Однако в белках Spirulina оказалось мало лизина. Клеточная стенка Spirulina имеет не такой состав, как у других эукариотических водорослей (Chlorella, Scenedesmus), и поэтому легко подвергается перевариванию. Кроме того, Spirulina содержит 4% нуклеиновых кислот, что заметно выше среднего их содержания у высших растений (1-2%), но несколько ниже, чем у других эукариотических водорослей (5-6%), и намного ниже, чем у дрожжей (10%), которые идут сегодня на производство белков одноклеточных организмов.

Отмечено, что у нескольких видов животных пища, в которой весь белок вырабатывался Spirulina, обеспечивала нормальную скорость роста. Среди них не наблюдалось никаких аномалий или патологических эффектов. Помимо всего прочего, Spirulina является источником рибулозодифосфаткарбоксилазы этот фермент присутствует во всех фототрофах и представляет значительный интерес как источник белка для питания человека.

В ходе экспериментов, выполненных в 1967 г. Французским институтом нефти совмесmо с мексиканской компанией «Соса Текскоко», с поверхности озера Текскоко, запасы соды которого разрабатываются с 1936 г., собирали урожай Spirulina. Площадь исследуемой поверхности составляла примерно 900 га. В течение трех-четырех дней биомасса Spirulina удваивалась; сбор проводили круглые сутки. После фильтрации суспензия Spirulina высушивалась горячим воздухом и превращалась в муку. Первая опытная фабрика, производившая 150 т муки в год, вступила в строй в 1973 г.; со временем ее производственная мощность возросла до 500 т в год. С 1977 г. «Соса Текскоко» ассигновала около 5 млн. долл. на решение инженерных проблем, связанных с расширением производства и с разработкой обязательных токсикологических проверок перед сбытом продукции. В 1982 г. производство достигло 1000 т со стоимостью 15 млн. долл., что соответствует трети годового дохода компании от добычи содового порошка из месторождений озера.

Главными импортерами мексиканской муки из Spirulina являются Япония, США и европейские страны. «Соса Текскоко» выпускает свою продукцию в виде таблеток и капсул, в которые по договоренности со странойпотребителем добавляются витамины А и С. В США экспортируется и неочищенная мука. В 1982 г. девять американских компаний, специализирующихся на сбыте белковых концентратов и диетических продуктов питания, закупили 300 т муки из Spirulina. Для нужд внутреннего рынка «Соса Текскоко» также производит муку в таблетках и капсулах; они продаются почти исключительно в диетических магазинах. Кроме того, компания предоставляет муку из Spirulina правительственным учреждениям, ответственным за улучшение питания населения, которые используют ее для производства галет и кондитерских изделий с высоким содержанием белка.

В Израиле Spirulina platensis выращивают на болотах площадью 12 000 м² (фирма «Хиллз кур продакшн лтд.», Хайфа). В 1982 г. фирма производила 50 т высушенной Spirulina, которая скармливалась скоту и добавлялась в пищу человека.

В Южной Италии собираются построить фабрику, где Spirulina будет выращиваться на площади 2 га в закрытой системе, состоящей из полиэтиленовых труб. Трубы будут служить солнечными коллекторами и тем самым позволят продлить продуктивный сезон. Кроме того, закрытая система исключает экзогенное загрязнение. Эксперименты во Флоренции показали, что в то время как размножение Spirulina в прудах и озерах продолжается с июля по сентябрь, в трубах оно начинается в апреле и заканчивается в середине ноября. В оптимальных условиях роста выход высок: до 20 г сухого вещества на 1 м² в сутки. Ежегодные урожаи в десять раз превышали урожаи пшеницы, а выход белка также был в десять раз выше, чем у соевых бобов.

Генетическое усовершенствование штаммов Spirulina может значительно повысить урожай. Чиферри (1981) отобрал мутантов S. platensis, у которых внутриклеточный пул определенных аминокислот мог быть в 40 раз выше, чем в штамме дикого типа, вместе с тем они росли с той же скоростью, что и последний. В Мексике исследования, проводимые компанией «Соса Текскоко», были направлены на получение методами генной инженерии штаммов, способных расти в разнообразных щелочных средах и в искусственных условиях. Выход Spirulina может в результате достигнуть 10-20 т на 1 га.

Как сообщили из Японии, при кормлении декоративного карпа Spirulina рыбы приобретают очень красивый цвет благодаря каротиноидным пигментам цианобактерий. В 1973 г. на юге острова Тайвань было создано опытное производство, где Spirulina скармливали домашней птице. Яичный желток окрашивался пигментами цианобактерий. Это позволяло избежать использования дорогих химически синтезированных соединений. Синие пигменты Spirulina, фикоцианины, могут также найти употребление в пищевой промышленности-в естественных продуктах этот тип пигментов довольно редок. Исследователи Французского института нефти продолжают работу над возможными применениями Spirulina. С этой целью ее выращивают в пруду экспериментальной станции Национального института сельскохозяйственных исследований на острове Мартиника, где климатические условия весьма благоприятны для роста этой цианобактерии.

Spirulina можно выращивать в щелочных прудах или в теплых водах системы охлаждения теплоэлектростанций, которые также выпускают отработанные пары, богатые двуокисью углерода. При этом не происходит вытеснения друmх, экологически более требовательных микроорганизмов. В Узбекской ССР в 1979 г. в 400 водоемах выращивались мезофильные и термофильные зеленые водоросли, которые скармливались крупному рогатому скоту, домашней птице и тутовому шелкопряду. Суспензии водорослей использовали в качестве пробного удобрения на хлопковых полях. Урожай водорослей составлял 30-60 т сухого вещества с 1 га в год; лимитирующим фактором являлась довольно низкая зимняя температура (2-5° С), несмотря на высокую солнечную активность. Завод около Самарканда производит 1 т влажных водорослевых клеток в день; планируется строительство и других заводов. Проводились также опыты по крупномасштабному культивированию цианобактерий и водных растений (Lemna ).

Пищевая ценность и перспективы микробного белка

Страны ЕЭС в 1974-1975 гг. производили 13 - 15 млн. т растительного белка для корма скота. По оценкам, к 1985 г. производство должно было возрасти до 25 млн. т в год. Белки получают главным образом из соевых бобов, ввозимых из Северной и Южной Америки, их потребление стремительно растет (в 1974 г. оно составило 931 000 т, в 1977 г. - 2 140 000 т). Корм для скота становится очень дорогим из-за роста цен на сою и рыбную муку; последнее вызвано главным образом упадком промысла анчоуса в Перу.

По сравнению с ними белки одноклеточных организмов имеют огромные преимущества: 500 кг дрожжей за сутки дают 80 т белков (что составляет примерно 40-50% всей биомассы), тогда как для быка того же веса за тот же период прирост белка составляет 400-500 г, а цыпленок, считающийся наиболее выгодным животным с точки зрения роста, может дать около 2 кг мяса примерно за два месяца, съев при этом 8,4 кг растительного белка.

Производители белка одноклеточных организмов не рассматривают свою продукцию в качестве заменителя соевых бобов. Их стратегия скорее состоит в том, чтобы сбывать ценный, но конкурентоспособный продукт, который мог бы заменить рыбную муку при кормлении свиней, домашней птицы и в меньшей степени телят. Его можно также использовать в качестве корма в рыбоводческих хозяйствах и добавлять в пищу комнатных животных. По оценкам специалистов ICI, белки одноклеточных организмов до 1985 г. не станут дешевле соевых бобов (в 1982 г их стоимость превышала стоимость пищевых продуктов, изготовленных из сои, зато их пищевая ценность была·вдвое выше).

Еще одно преимущество белков одноклеточных организмов перед соей и перед рыбной мукой состоит в постоянстве состава. Компании ICI и ВР утверждают, что для выпускаемых ими прутина и топрины характерна такая же воспроизводимость состава, как для промышленных изделий, в отличие от изменчивого состава сельскохозяйственных продуктов. Кроме того, чтобы удовлетворить требованиям безопасности в различных странах, эти вещества подвергались многочисленным пищевым и токсикологическим проверкам. Результаты проверок позволяют сделать следующий вывод: употребление этих белков в пищу животных не вызывает побочных эффектов и они являются высококачественными продуктами. Например, дрожжи, выращенные на метаноле или п-парафинах в качестве источников углерода, содержали до 61% белка; лизина в нем было 4,5% и достаточно серусодержащих аминокислот. Поэтому они вполне дополняли пищевой рацион, основанный на злаках. Как показали эксперименты, выполненные на крысах и цыплятах во Французском институте нефти и французском Национальном институте сельскохозяйственных исследований, дрожжи Torulopsis candidaстоль же хороший источник лизина, как рыбная мука и соевый шрот.

Введение генов Saccharomyces cerevisiae в клетки Chlamydomonas reinhardii и их экспрессия в этой одноклеточной зеленой водоросли открывают новые перспективы получения белков и других компонентов клетки водоросли для питания человека и животных.

Вместе с тем перед исследователями стоит задача: сделать белки одноклеточных организмов пригодными для питания человека. Возникающие при этом проблемы настолько сложны, что, по мнению некоторых специалистов, они делают бессмысленными все попытки крупномасштабного производства таких белков. То обстоятельство, что в качестве промежуточного решения выбрано кормление домашних животных, связано со сложностями или с невозможностью изменить пищевые привычки и поведение человека. Но не следует отказываться от мысли, что в один прекрасный день эти белки могут послужить, пусть даже в малой степени, улучшению нашего питания.

К 1985 г. в мире предполагалось построить 10-15 предприятий (половина из них в Европе) мощностью около 100 000 тв год каждое. К этому времени должны появиться проекты значительно больших предприятий второго поколения. На них специалисты смогут проверить на практике и в крупном масштабе методы и знания, накопленные в последние годы. Надо надеяться, что к этому времени будут лучше изучены реакции потребителя на сбыт продукта, количество которого с каждым годом увеличивается.

Белки одноклеточных организмов, которые принципиально не могут решить проблему голода в мире, в следующем десятилетии будут играть более важную роль в качестве корма животных, а со временем и в питании человека, ибо история этих белков только начинается. Не исключено, что их реальное производство будет ориентировано на рынки сбыта, способные оплачивать дорогостоящий продукт для получения мяса, возрастающее потребление которого происходит параллельно с ростом уровня жизни. Если такая ситуация станет превалирующей в развивающихся странах, то в производстве белков одноклеточных организмов будут заинтересованы только богатые социальные слои или экспортеры; нехватка пищи не уменьшится, и в вопросах питания социальное неравенство углубится. Вот почему мелкомасштабные и недорогие установки, которые смогут использовать сельскохозяйственные отходы на уровне деревни для улучшения питания людей и домашнего скота, имеют неоспоримые преимущества перед крупными предприятиями. Вместе с тем в странах производителях нефти создание крупных фабрик оправдано, поскольку эти страны ввозят большое количество пищевых продуктов.